Quaderno di istologia.
Indagini istochimiche e
citochimiche.
Scritto da Fabrizio Crisafulli
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Prima revisione (maggio 2007)
Fabrizio
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Date: 2007.05.25 23:20:41 +02'00'
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Indice generale
1 Introduzione..........................................................................................................................................................4
Strumenti e tecniche............................................................................................................................................4
2 Gli strumenti dell'indagine citoistologica.............................................................................................................6
I microscopi ottici...............................................................................................................................................7
Le aberrazioni cromatiche nei microscopi.....................................................................................................7
I microscopi elettronici.......................................................................................................................................7
I microscopi a fluorescenza................................................................................................................................8
I microtomi.........................................................................................................................................................9
3 La preparazione di un campione.........................................................................................................................11
Preparazione di un campione nella microscopia ottica.....................................................................................12
Prelievo........................................................................................................................................................12
Fissazione.....................................................................................................................................................12
Fissazione con metodi fisici....................................................................................................................12
Freeze drying dei tessuti biologici......................................................................................................13
Fissazione con metodi chimici................................................................................................................13
Fissativi chimici primari.....................................................................................................................13
Fissativi chimici secondari.................................................................................................................13
La colorazione..............................................................................................................................................13
Struttura chimica di un colorante............................................................................................................14
Classificazione dei coloranti in base alla loro produzione.................................................................14
Classificazione dei coloranti in base all'auxocromo ed al gruppo cromoforo...............................14
Tecniche di colorazione......................................................................................................................14
La reazione PAS.............................................................................................................................14
4 Indagine delle molecole biologiche....................................................................................................................17
Carboidrati........................................................................................................................................................17
Tecniche di localizzazione dei lipidi............................................................................................................17
Lipidi.................................................................................................................................................................18
Tecniche di analisi dei lipidi.........................................................................................................................18
Nucleotidi, DNA e RNA...................................................................................................................................20
Tecniche di analisi dei nucleotidi, del DNA e dell' RNA.............................................................................20
Estrazione del DNA.....................................................................................................................................20
5 Immunoistochimica............................................................................................................................................22
Anticorpi primari e anticorpi secondari............................................................................................................23
I tipi di marcatori..............................................................................................................................................23
L'amplificazione del segnale........................................................................................................................23
Il complesso biotina-avidina....................................................................................................................24
I saggi ELISA..........................................................................................................................................24
6 I marcatori tumorali............................................................................................................................................26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
1
Introduzione.
La sclerosi laterale amiotrofica.
stesso, è la cellula. Dagli studi
citologici, ovvero dagli studi sulla
cellula, si evince la sua struttura e
l'ultrastruttura interna, dando uno
sguardo alle sue entità interne ad
essa . Il citoplasma, il nucleo, il
REL, i mitocondri e i corpi del
Golgi sono soltanto alcune delle
strutture che hanno una specifica
funzionalità.
La sclerosi laterale amiotrofica
Esistono diversi tipi di indagine
(SLA) è una patologia dalla bassa
medica o biologica. La sfera della
incidenza la cui eziologia non è
vita, in ogni sua forma, tocca
chiara. L'esame per stabilire se un
differenti punti che possono essere
paziente è affetto da SLA, dopo ogni
molto diversi tra loro. L'analisi di un
accertamento volto ad escludere altre
organismo animale, in particolare, si
patologie, consiste nell'analisi del
può svolgere su differenti fronti.
tessuto
midollare,
effettuato
L'animale infatti vive in comunità e
mediante
risonanza
magnetica
interagisce con l'ambiente circostante
nucleare, e la successiva biopsia che L'indagine del tessuto in modo
ed è compito dell'ecologia studiare
analizza il tessuto, nella morfologia, globale, ovvero l'analisi della sua
tali rapporti. Un altro tipo di indagine
e le cellule nella struttura morfologia e della sua funzionalità,
può
essere
quella
di
tipo
evidenziando,
con
opportune è in diretta correlazione con
comportamentale che sempre si
l'analisi morfofunzionale delle
tecniche, le zone danneggiate.
svolge nell'ambito di più organismi
cellule che lo compongono. La
che idealmente condividono lo stesso
necrosi di un tessuto, ad esempio, è
spazio. Sappiamo che i delfini si muovono in branco, l'effetto globale che si vede nel tessuto ma la cui causa è
che i cani in genere sono “i migliori amici dell'uomo”, da ricercare nella cellula che formano il tessuto. Ci sono
che l'istinto materno di una specie può “esplodere” tanti altri esempi per comprendere come indagine
quando la madre adotta un cuccio di un'altra specie tissutale e citologica vanno di pari passo e si svolgono
proprio grazie a tanti studi etologici effettuati nel corso per fini curativi, come ad esempio la ricerca di tumori, o
di diversi secoli.
per fini esclusivamente diagnostici come avviene nella
Dal punto di vista strettamente biosanitario le indagini si ricerca della sclerosi laterale amiotrofica per la quale
svolgono
ad
esempio
su
fronti
di non ci sono, al momento, cure.
infettivologia/patogenesi e conseguente prevenzione
che studiano la diffusione su un campione di Strumenti e tecniche.
popolazione l'incidenza e la prevalenza di malattie, di
infezioni e come prevenirle. Ma una patologia, oltre che Per poter effettuare l'indagine istologica ci si deve
un evento possibile in una comunità, è in prima istanza affidare a strumenti e tecniche. Gli strumenti sono tutti i
mezzi con i quali viene fatta l'indagine mentre con il
una realtà che colpisce il singolo individuo.
termine “tecniche” si indicano le varie procedure con le
Il virus dell'influenza stagionale colpisce, nel mondo, quali mettere in atto l'indagine. Il microscopio è uno
decine di milioni di persone ma per essere rilevato in strumento mentre la colorazione del campione è una
modo preciso l'analisi viene fatta sul singolo e non sulla tecnica. Con il microscopio, che è uno strumento, si
popolazione, che è diretta conseguenza delle indagini osserva ciò che si colora, mediante la tecnica..
effettuate. Quando una patologia è manifesta, o quando
si sospetta sia in corso od in fase di formazione, è Esistono differenti tipi di strumenti e, per ognuno di
possibile individurarla mediante l'analisi dei tessuti essi, possono esistere differenti modelli proprio come
(istoanalisi), delle singole cellule (citoanalisi) o dei esistono diverse tecniche, usate perlopiù con protocolli
fluidi corporei da questi prodotti. Nonostante la simili. I microscopi, ad esempio, rappresentano una
complessità dell'organismo è relativamente facile classe eterogenea di strumenti “per vedere il piccolo”
contraddistinta da differenti modelli (microscopi ottici,
diagnosticare una patologia.
elettronici, a fluorescenza). Ogni microscopio, inoltre,
Il tessuto è costituito da una varietà di elementi di ha una propria peculiarità in quanto può essere formato
caratterizzazione morfologica, chimica e funzionale da lenti di diversa qualità, o elementi solidi che
differente ma la cui unità base, ovvero la più piccola assicurano una maggiore precisione nell'analisi.
unità funzionale che ricalca la fisiologia del tessuto
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 4/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
Di per sé il solo microscopio non serve a molto se non si
adottano delle metodologie con le quali è possibile la
visualizzazione del preparato cito-istologico. Vedremo
in avanti in dettaglio questi “protocolli” con i quali è
possibile osservare più o meno in dettaglio i
compartimenti tissutali o cellulari e, per adesso,
possiamo limitarci nel dire che utilizzando diverse
tecniche possiamo fare in modo di immobilizzare
l'attività tissutale, per prevenire i fenomeni di autolisi,
colorare opportune zone in base a determinati fattori che
possono essere la presenza di lipidi, di zuccheri, di acidi
nucleici o di proteine in genere.
Mediante gli strumenti e le tecniche è possibile
includere il tessuto in un ambiente adatto ad essere
conservato per anni, se non decenni, preservandone però
lo stato per garantire una sufficiente qualità di analisi
dello stesso nel corso degli anni.
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 5/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
2
Gli strumenti dell'indagine
citoistologica.
microscopi elettronici.
In realtà l'indagine citologica non si limita
semplicemente a vedere l' “interno” della cellula, o la
sua organizzazione, ma sovente si rende necessario
Abbiamo già parlato, nell'
sapere se un determinato
introduzione, del fatto che per
elemento è presente nel tessuto
Il metedo scientifico e l'indagine.
poter effettuare un'indagine
per cui si usa un indicatore che
citoistologica è necessario
Fu Galileo Galilei, nel XVII secolo a mettere
mostra, con un sufficiente grado
osservare alcuni particolari del delle solide basi per il pensiero scientifico.
di precisione, la presenza o
tessuto (indagine istologica) o Nell'indagine citoistochimica, a distanza di
meno del corpo sul quale verte
delle cellule che lo formulano secoli, si utilizzano ancora le riflessioni dello
lo studio all'interno del
(indagine citologica).
scienziato in quanto l'osservazione e la
campione.
Abbiamo anche detto che
verifica di una ipotesi seguono ancora i criteri
E' il caso della
quanto osserviamo nel tessuto di Galilei. Prendiamo a titolo di esempio il
immunofluorescenza2 dove
è, di solito, correlato a quanto
test dell'AIDS:
particolari microscopi captano
possiamo osservare nella sua
1) Ipotesi: Il soggetto è positivo all' HIV?
radiazioni non necessariamente
unità funzionale più piccola,
2) Osservazione: Saggi ELISA (Enzyme
appartenenti allo spettro visivo
ovvero la cellula, per cui
Linked Immunoabsorbent Assay) hanno un
che dimostrano la presenza di un
variazioni della fisiologia
grado di affidabilità sufficientemente valido
complesso molecolare
della cellula possono
per verificare la presenza o meno dell' virus
solitamente antigenico3.
corrispondere a variazioni
responsabile della sindrome da
della morfologia, e della
Quella dell'indagine
immunodeficienza acquisita.
fisiologia del tessuto.
microscopica, sia ottica che
3) Metodologia: Si effettua il saggio
elettronica o a fluorescenza, è
I tessuti sono insiemi di
immunoenzimatico con gli strumenti e le
senza dubbio la fase più
cellule che hanno in comune
tecniche proprie dell' ELISA.
importante in quanto è il
particolari caratteristiche. Il
4) Diagnosi: Il test è negativo o positivo e,
momento nel quale si osservano
tessuto ghiandolare, ad
con un sufficiente grado di sicurezza, il
e si verificano le ipotesi
esempio, è composto da
soggetto è sua volta positivo o negativo.
precedentemente fatto, ovvero i
cellule che in gran parte
5) Test di controllo: Si esegue un ulteriore
motivi per i quali si è reso
condividono la funzionalità di test (che per la ricerca del virus HIV
necessario operare una indagine
sintetizzare delle
corrisponde all'analisi chiamata “western
citoistologica. Questo passo è
macromolecole quali gli
blot”) per aumentare ulteriormente il margine
tuttavia l'ultima operazione del
ormoni. Se gli organi, fatti da di sicurezza
lavoro che si svolge adoperando
tessuti, sono solitamente
altri
strumenti.
Il
preparato
presente nel microscopio,
grandi a sufficienza da poter essere visti ad occhio nudo
infatti, deve essere molto sottile altrimenti non potrebbe
la stessa cosa non la si può dire per i tessuti o per le
essere correttamente visualizzato, specialmente nella
cellule. La cellula, in particolare, può avere una
microscopia ottica, e per questo si rende necessario un
dimensione media di 20μM (20 micrometri) pari a 20
microtomo ovvero uno strumento capace di tagliare
milionesimi di metro. A questi livelli l'occhio umano
sottili fette del tessuto.
non è capace di distinguere nulla in quanto la sua
risoluzione massima, ovvero la capacità di distinguere
Come è facile intuire il tessuto animale, ed anche
due corpi in modo univoco se posti sullo stesso piano, è quello vegetale, non sempre ha consistenza tale da poter
di circa 0,2mm. Per questo motivo è necessario usare
essere sezionato in modo facile ed immediato. La lama a
degli strumenti che ingrandiscono, tramite lenti, la
superficie da analizzare oppure mostrano un equivalente
2 http://www.lacellula.net/appunti/immunologia/immunofluoresce
visivo della superficie su un monitor. Nel primo caso
nza_citofluorimetria.html
parliamo di microscopi ottici mentre nel secondo di
3 Antigenico:Capace di scatenare una risposta immunitaria.
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 6/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
contatto con zone “molli” potrebbe ridurre in poltiglia il
tessuto e vanificare l'opera di estrazione. Per questo
motivo è necessario includerlo in un mezzo che da un
lato fornisca una solidità tale da poter essere processato
dalle lame di un microtomo e dall'altro deve presentare
una grado di invasività minimo tale da non precludere le
operazioni di visualizzazione. La ricerca e la
sperimentazione di oltre cento anni ha fornito diversi
elementi che date le loro proprietà chimiche si prestano
bene a fornire strutture di sostegno ai tessuti. Stiamo
parlando delle sostanze di inclusione che, spesso, sono
delle emulsioni liquide di materiali che possono essere
utilizzate solo se preriscaldate e successivamente
lasciate raffreddare nel tessuto da esaminare.
I microscopi ottici.
o canna del microscopio, fino a giungere ad una
seconda serie di lenti che prendono il nome di oculare.
Per garantire differenti livelli di ingrandimento esistono
vari obiettivi posti in un disco rotabile che prende il
nome di revolver attraverso il quale è possibile
scegliere l'ingrandimento desiderato semplicemente
girando il revolver ed innestando un differente obiettivo.
La messa a fuoco della zona da visualizzare è resa
possibile grazie all'azione meccanica delle viti
macrometriche e micrometriche che, rispettivamente,
operano aggiustamenti più o meno accentuati della
distanza del piano rispetto alla canna contenente
l'obiettivo.
Nei microscopi ottici moderni è possibile usare una
microcamera per poter registrare o fotografare il tessuto
e, in altri microscopi, è possibile adattare l'obiettivo per
l'uso con comuni macchine fotografiche.
Il microscopio ottico è uno strumento utilizzato per
osservare preparati istologici con un modesto
ingrandimento. La capacità visiva in un microscopio
ottico si attesta mediamente sui 100-400 ingrandimenti Le aberrazioni cromatiche nei
per cui in un tessuto formato da cellule di media
microscopi.
dimensione, circa 20 μM, queste verranno ingrandite di
L'utilizzo di lenti di scarsa qualità, sia per l'obiettivo sia
100-200 volte. Tali valori sono grossomodo sufficienti
per l'oculare, può produrre l'effetto dell'aberrazione
per apprezzare il nucleo con la cromatina condensata ed
cromatica ovvero un viraggio scomposto della
altre strutture endocellulari.
componente cromatica che si manifesta
Il funzionamento del microscopio ottico è
in particolare lungo i contorni degli
molto simile a quello di una comune
elementi del campione che vengono
macchina fotografica dotata di zoom
visualizzati. Le aberrazioni, inoltre,
ottico. Una lampadina emette un fascio di
possono in alcuni i casi portare alla
luce che passa attraverso un
visualizzazione di corpi inesistenti nel
condensatore. Generalmente il
quadro visivo e alla formulazione di
condensatore ha il compito di convogliare
esiti falsati.
la luce verso il vetrino, dove è apposto il
Le aberrazioni cromatiche in genere
preparato, e eventualmente filtrare alcune
avvengono a causa delle scarsa qualità
componenti cromatiche per colorare
delle lenti o della costruzione del
indirettamente il tessuto. Il vetrino è
microscopio. La scelta di lenti migliori,
posto su un piano che, attraverso alcuni
Illustrazione 1: Testa di
inevitabilmente, comporta un maggiore
sistemi meccanici, può essere traslato in
una formica visualizzata
costo del microscopio ma permette di
verticale o in orizzontale e in alcuni casi
con il microscopio
ottenere risultati di maggiore qualità.
anche in obliquo. La luce che passa
elettronico.
attraverso il tessuto viene incanalata
(Immagine di pubblico
I microscopi elettronici.
verso una prima serie di lenti che
dominio)
prendono il nome di obiettivo.
Il microscopio elettronico, a differenza
L'immagine ottenuta dalla luce che passa
nell'obiettivo viene ingrandita per la
prima volta e successivamente passa attraverso un tubo,
di quanto abbiamo visto per il
microscopio ottico, non visualizza
l'immagine in base ad un fascio di luce che passa
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 7/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
attraverso il preparato ma
usa una tecnica differente.
millesimo di secondo,
questa restituisce la
radiazione con minore
intensità ma con uno
shift 4 pari a circa 2040nM. Veicolando luce
viola si ottiene luce blu,
veicolando luce verde si
ottiene rossa, mentre
con l'ultravioletto si
visualizza della luce
viola.
Nel microscopio a
scansione un fascio di
elettroni, generato da un
apposita struttura, viene
condensato in due o tre
stadi e convogliato contro
il preparato
opportunamente realizzato
e trattato. Gli elettroni
“rimbalzano” sul preparato
e vengono intercettati da
Il microscopio a
un rivelatore che, in base
fluorescenza è perlopiù
Illustrazione
2:
Principio
di
funzionamento
del
al punto di contatto,
usato nelle indagini di
microscopio a fluorescenza
genera un segnale. Tale
immunoistochimica
impulso viene amplificato
dove anticorpi marcati si
elettronicamente e visualizzato grazie ad un monitor.
legano ad antigeni tissutali o, in alternativa, anticorpi
marcati si legano ad altri anticorpi che, a loro volta,
Il vantaggio della microscopia elettronica è,
sono legati all'antigene.
indubbiamente, rilevabile nella grandissima potenza di
ingrandimento che può toccare oltre i 50.000X. Gli
svantaggi, però, sono notevoli. Il microscopio elettronico
è uno strumento dal costo non indifferente e, inoltre, i
metodi di preparazione dei tessuti per l'osservazione
comportano un tempo ed un costo di diverse misure
maggiore rispetto all'analisi effettuata con il microscopio
ottico.
I microscopi a fluorescenza.
Il principio di funzionamento del microscopio a
fluorescenza è riconducibile alle proprietà di
assorbimento di diverse lunghezze d'onda di alcuni
gruppi chimici e la loro restituzione dopo pochi istanti.
Il vantaggio dovuto dall'utilizzo del microscopio a
fluorescenza è individuato nella facile visualizzazione di
gruppi di molecole bersaglio. L'indagine antigenica in
immunofluorescenza, ad esempio, mostra i focolai di
infezione di un tessuto mentre l'indagine biomolecolare
o tissutale, ovvero i test che si eseguono per vedere se
un particolare composto biologico (glucidico, proteico)
o una intera struttura (nervo, collagene) è presente nel
tessuto possiedono un'alta specificità.
Gli svantaggi della microscopia a fluorescenza, sono
quelli dovuti al costo di preparazione del campione e
alla necessità di veicolare verso lo stesso una luce
“pulita” ovvero cromatograficamente priva delle
lunghezze d'onda non necessarie. Per evitare questo si
utilizzano filtri ad alto rendimento uniti a particolari
sistemi di controllo elettronici che, nei microscopi più
evoluti, sono direttamente integrati nel corpo.
Alcuni molecole, come ad esempio l'isocianato di
fluoresceina o la rodamina, se stimolate attraverso
lunghezze d'onda comprese nello spettro della luce
visibile (400-700nM) o di quella immediatamente
inferiore (ultravioletto) e o superiore (infrarosso)
assorbono parte della radiazione e la restituiscono con
una lunghezza d'onda superiore di circa 20-40nm. In
altre parole se ad una molecola dalla proprietà
fluorescenti si veicola della luce viola e questa molecola
nello spettro di 400-420nm, che corrisponde proprio alla
luce viola, ha il proprio range di assorbimento dopo un
4 Shift: spostamento. In biologia è sovente l'uso del termine shift
periodo di tempo, che si misura in sottomultipli del
per indicare delle variazioni lungo una scala
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 8/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
dall'utente.
I microtomi.
Un altro tipo di microtomo, definito microtomo
congelatore, rappresenta la
I microtomi sono strumenti
I vari tipi di microtomo:
diretta evoluzione del
meccanico-elettronici il cui
microtomo elettronico con la
compito è quello di sezionare
● Manuale
possibilità di sezionare il
parti di tessuto già fissato ed
● A slitta
preparato a temperature
incluso nel mezzo di inclusione.
inferiori allo zero. Di solito
● Rotativo
Il microtomo seziona fette
l'ambiente nel quale avviene
sufficientemente sottili del
● Elettronico
l'operazione e lama vengono
preparato pronte per essere
● Congelatore
portati a circa – 40°C e, a
osservate al microscopio ottico.
queste temperature, viene
Per quanto riguarda l'indagine in
operato il taglio.
microscopia elettronica, invece, il microtomo non ha
La necessità di operare sezionamenti a basse
largo uso in quanto il preparato viene montato e
temperature
si rende necessaria in alcuni campi della
ricoperto in modo differente.
ricerca medico-biologica dove, in base al tipo di tessuto
Il microtomo, inoltre, è uno strumento che viene
o di fissazione, è opportuno operare a temperature
utilizzato per sezionare campioni di tessuto animale ma
inferiori per evitare la degradazione e la conseguente
va bene anche per essere utilizzato con campioni di
inutilizzabilità del preparato.
origine vegetale.
I campioni conservati a temperature basse, come ad
Esistono differenti tipi di microtomo che si basano su
esempio quelli posti in azoto
diversi principi. Il microtomo a
liquido, in genere devono essere
slitta, ad esempio, è uno
sezionati mediante l'ausilio del
strumento manuale dove
microtomo congelatore.
l'operatore fa scorrere il preparato
che viene a contatto con la lama
sezionatrice avendo, ovviamente,
cura di utilizzarlo in modo
opportuno per evitare lesioni
personali.
Nel microtomo a rotazione,
invece, la lama seziona il
preparato mediante rotazione.
I microtomi elettronici sono
molto più costosi rispetto ai
microtomi manuali ma permettono
di ottenere sezioni di gran lunga
più raffinate grazie ai controlli
integrati nelle circuiterie
elettroniche.
Illustrazione 3: Microtomo elettronico
(Copyright www.otticaturi.it, si
ringrazia l'azienda per la concessione
dell'immagine)
Il microtomo elettronico è, infatti,
coadiuvato da elettromotori e sensori che regolano con
precisione la distanza della lama dal preparato, la
velocità di taglio in base alla consistenza del tessuto e
dell'inclusione ed altri parametri spesso gestibili
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 9/ 26
Riepilogo:
Gli strumenti più importanti utilizzati per l'indagine citologica ed istologica sono i microtomi,
che sezionano parti di tessuto, ed i microscopi che visualizzano un immagine ingrandita del
preparato.
Parole chiave:
Microscopio, potere di ingrandimento, potere di risoluzione, microtomo, fluorescenza, spettro
visivo.
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
3
La preparazione di un
campione.
colorare un campione nella microscopia ottica o
ricoprire un campione, per poter essere scansionato,
nella microscopia elettronica a scansione.
La colorazione di un campione rende possibile
La preparazione di un campione è un passo
l'osservazione delle sue più piccole parti marcando, con
fondamentale nell'analisi
gli opportuni coloranti, gli
citologica. Dei buoni risultati Perché la colorazione si effettua esclusivamente
organuli o particolari
finali si ottengono prestando
con le indagini mediante microscopia ottica e non
agglomerati di
attenzione alle fasi iniziali
con quella elettroniche a scansione?
biomolecole interne.
del processo.
Perché i due sistemi utilizzano metodi differenti per
La copertura di un
“Preparare un campione”
la visualizzazione del campione. Nella microscopia
campione, che si effettua
vuol dire effettuare una serie
ottica, infatti, la luce che viene convogliata verso il
nell'analisi con il
di procedimenti atti a
preparato vira di colore a seconda del colore del
microscopio elettronico a
conservare nel tempo il
punto che colpisce. Un po' come avveniva nei vecchi scansione, consiste nell'
substrato cellulare.
proiettori di diapositive. Il microscopio elettronico a
apporre uno strato di
scansione, invece, utilizza un metodo che è più
Il tessuto vivo, una volta
metallo pesante, quale
simile a quello usato dai radar . Un fascio di elettroni l'oro od il palladio, per
prelevato, tende ad
non passa attraverso il preparato ma rimbalza lungo
autodistruggersi andando in
rendere possibile la
la sua superficie e viene rilevato da un apposito
contro ad una serie di
repulsione degli elettroni
strumento
interno
al
microscopio.
Colorare
un
processi che, a livello
lungo la superficie. Il
preparato per la SEM, dunque, non ha senso in
endocellulare, portano al
metallo posto sopra il
quanto
è
importante
ricoprire
tale
campione
di
digerimento progressivo di
campione deve essere
sostanze proprio per permettere agli elettroni di
alcune strutture mediante
sufficientemente spesso
“rimbalzare”
fenomeni proteolitici. Il
da respingere gli elettroni
tessuto appena asportato,
ma, allo stesso tempo,
inoltre, viene privato di una serie di elementi necessari
deve evitare una copertura totale che potrebbe
per la sua sopravvivenza. Le cellule, infatti, necessitano compromettere i rilievi dello stesso eliminando
di nutrienti esogeni, di ossigeno, di segnali biochimici
particolari dettagli da apprezzare nella fase di
per poter sopravvivere e, inoltre, devono in qualche
osservazione.
modo portare fuori i prodotti di scarto. Il tessuto
Nella fase di copertura di un campione per l'utilizzo con
asportato non può fornire alle proprie cellule tali
il microscopio elettronico il metallo viene nebulizzato
nutrienti che, anche per questo motivo, cessano di
sulla superficie preferibilmente in modo perpendicolare
vivere. In ultima analisi qualsiasi tessuto può venir
giusto per farne risaltare i rilievi.
danneggiato dall'azione dell'ossigeno dell'atmosfera che
è un potente ossidante o essere preda di batteri o
microorganismi vari. Alla luce di ciò si rende necessario
“fissare” il campione.
Fissare un campione vuol dire fare una “fotografia
istantanea” e prevenire che il tessuto stesso possa andare
in degenerazione. E' un passo necessario per poter
visualizzare, anche a distanza di tempo, il campione
nella sua completezza. Un campione viene fissato a
prescindere dal tipo di analisi realizzata o dagli
strumenti necessario per poterla a termine.
E', invece, necessario operare diverse metodologie in
base al tipo di indagine microscopica quando si deve
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 11/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
Preparazione di un campione nella
microscopia ottica.
Prelievo.
Il prelievo di un campione di tessuto consiste
nell'asportazione di un piccolo frammento dall'animale
vivo.
Gli strumenti del prelievo
sono, solitamente, il bisturi,
l'ago aspirato od il
raschietto.
Il bisturi è uno strumento
chirurgico molto utilizzato
formato da un manico e da
una lama alquanto affilata.
Mediante il bisturi è
possibile sezionare una parte
di tessuto la cui forma può
essere ragionevolmente varia
e, in linea generale, può
essere più o meno invasiva
in base al tipo di tessuto
esportato ed alla sua
dimensione.
Immobilizzare il campione vuol dire bloccare i processi
autolitici della cellula.
Per la microscopia ottica si utilizzano metodi fissativi
fisici e chimici e la scelta viene operata in base al tipo di
studio ed al tipo di tessuto da analizzare. La “forza” di
determinati fissativi, intesa come la capacità chimica di
degradare le molecole, potrebbe irrimediabilmente
rendere inutilizzabile il campione
Fissazione con metodi fisici.
Il pap-test. Un esame salvavita.
Il pap-test è un esame non invasivo che può
salvare la vita alla popolazione femminile. Il
nome deriva dall'ideatore, George
Papanikolau, che nel 1943 mise a punto
questa tecnica di osservazione e di
colorazione delle cellula dell'utero per scopi
medico-diagnostici.
Attraverso un raschietto, mediante l'aiuto di
un divaricatore, viene estratto un campione di
cellule della cervice uterina che viene poi
colorato mediante il metodo “Pap”.
La colorazione del campione può rilevare,
con una efficacia prossima al 90-95%,
eventuali neoplasie del collo dell'utero
provocate, nella stragrande maggioranza dei
casi, dal virus HPV (Human Papillomae
Virus) e, per questo motivo, è un ottimo
strumento di indagine precoce.
Con la tecnica dell'ago
aspirato viene introdotto un
ago di dimensione ridotta
all'interno di una ghiandola,
solitamente la tiroide od un
testicolo, con lo scopo di aspirare verso l'esterno il suo
prodotto di sintesi, o eventualmente dell'essudato. L'ago
aspirato è un esame invasivo in quanto si rende
necessaria la penetrazione epiteliale e ghiandolare.
Mediante il raschiamento è possibile staccare piccoli
frammenti di tessuto epiteliale formati da pochi strati
cellulari. La tecnica del raschiamento è fortemente
utilizzata in ginecologia nell'esame del pap-test.(Si
veda il box Pap-Test)
Fissazione.
Subito dopo il prelievo è necessario “immobilizzare” il
tessuto per i motivi che abbiamo già illustrato.
I metodo fisici per bloccare la
degradazione tissutale possono
essere riassunti in tecniche che
usano:
1. Il calore
2. Il freddo
3. Le microonde
Il calore è solitamente un mezzo
chimico drastico che attua il
proprio lavoro su due fronti. Da un
lato viene tolta parte dell'acqua
presente nel tessuto mentre
dall'altro si modifica la struttura
quaternaria delle proteine, ovvero
il loro ripiegamento
tridimensionale, per cui buona
parte del complesso endocellulare
delle proteasi viene inibito. Gli
strisci di sangue possono essere
fissati mediante l'utilizzo del
calore.
Mediante le microonde si operano dei processi fisici
molto simili a quelli prodotti dal calore. Le microonde
sono radiazioni elettroniche ad altissima frequenza e
bassa energia. La frequenza si attesta a circa 2,4GHZ
mentre l' energia assorbita dal sistema generatore arriva
al massimo ad 2-4kW.
Nonostante gli alti indici l'alta frequenza fa si che a
pochi centimetri dall'emettitore, che generalmente è un
“magnetron” di brevetto statunitense, sia apprezzabile
un campo energetico non capace di ionizzare le
molecole, ovvero strappare loro degli idrogeni o degli
elettroni dal guscio, modificandone le caratteristiche
fisico-chimiche.
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 12/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
Il principio del microonde è semplice. La radiazione
colpisce le molecole di acqua presenti nel tessuto e, in
minor parte, alcuni gruppi di proteine, acidi grassi e
lipidi. Queste molecole vibrano ed il movimento di
frizione contro altri composti, e eventuali urti nel
sistema, producono calore.
Di per sé le microonde non sono ionizzanti e, ciò, non
rompono i legami chimici delle molecole. Per questo
motivo il folding delle proteine non dovrebbe
modificarsi ma, in realtà, l'alta temperatura raggiunta
dal processo può denaturare il ripiegamento
tridimensionale dei peptidi.
e questa peculiarità potrebbe causare del danno
meccanico endocellulare o tissutale.
Fissazione con metodi chimici.
L'utilizzo di fissativi chimici rappresenta la tecnica che
spesso viene utilizzata nella preparazione di un
campione. I fissativi chimici sono classificabili in due
grandi gruppi: i fissativi primari e secondari.
Fissativi chimici primari.
Quando una molecola chimica è capace, da sola, di
operare la fissazione si parla di fissativo primario. Alla
categoria appartengono acidi relativamente forti come
l'acido tricloroacetico, l'acido trifluoroacetico e meno
forti come l'acido acetico oltre che a molecole polari
come l'etanolo o il metanolo.
Il freddo non è un vero e proprio mezzo di fissazione.
Se un campione viene congelato e poi scongelato i
fenomeni ossidativi e proteolitici avvengono comunque.
Fintanto che il campione rimane sotto bassa
temperatura, meglio se prossima allo zero assoluto,
questo non si degrada per cui sarebbe più opportuno
Fissativi chimici secondari.
definire il metodo fisico del freddo come metodo
conservativo.
I fissativi chimici secondari da soli non sono capaci di
fissare la struttura proteica della cellula ma servono per
Freeze drying dei tessuti biologici.
potenziare l'azione dei fissativi primari qualora questi
non fossero efficienti nei confronti di alcune strutture
Mediante la tecnica del congelamento- essicazione
endocellulari.
(freeze drying per usare i termini inglesi) è possibile
conservare a temperatura molto bassa un campione di
tessuto.
La procedura per effettuare il congelamento e la
seguente essicazione è la seguente:
1. Congelamento ultrarapida del tessuto a
temperatura di circa -160° C. A questo punto
l'acqua si trasforma in ghiaccio senza la
formazione di cristalli che potrebbero inficiare
sulla struttura cellulare
2. Essiccazione del tessuto che viene esposto a
temperature di circa -40°C.
La colorazione, che avviene dopo l'inclusione, dei
tessuti processati avviene mediante l'utilizzo di
particolari coloranti nebulizzati sul substrato.
La colorazione.
La colorazione è un processo molto importante nel
corso della preparazione di un campione per
l'osservazione al microscopio ottico. Un buona
colorazione, infatti, si traduce in una buona
visualizzazione in fase di analisi mentre con una
colorazione blanda, o poco accurata, è possibile che i
risultati ottenuti in analisi possano essere fuorvianti.
I coloranti sono perlopiù molecole naturali o sintetiche
solute in acqua. Il preparato incluso contiene la
paraffina che non è adatta per essere colorata e per
questo motivo viene processato attraverso immersioni in
serie decrescenti di xilolo per far avvenire la
sostituzione della paraffina.
E' importante comprendere che il rapido congelamento
del campione ottenuto mediante temperatura inferiore ai Struttura chimica di un colorante.
150°C non permette all'acqua di formare cristalli che
Il colorante è un composto chimico formato da tre
potrebbero danneggiare la struttura del tessuto. L'acqua,
gruppi. Il gruppo cromoforo è rappresentato da un
infatti, ha una proprietà particolare per la quale alle
insieme di atomi che assorbono parti dello spettro della
basse temperature tende ad espandere il proprio volume
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 13/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
radiazione visibile restituendo
all'osservatore un colore privato della
componente cromatica assorbita. In
linea generare i sistemi insaturi,
ovvero quelli con un doppio o triplo
legame, o quelli aromatici,
caratterizzati dalla dislocazione
elettronica lungo una catena ciclica,
sono dei cromofori. Un cromoforo
legato con un gruppo aromatico, in
genere, viene definito cromogeno.
Il potere colorante, in realtà, è più che
altro dovuto alla presenza di un
auxocromo che è un gruppo chimico
capace di legare la molecola ad un
substrato. Gli auxocromi possono
essere gruppi ossidrilici (-OH),
alchinici (C=C), o amminici (NH2).
basica, di conseguenza, reagiscono con
le parti acide della cellula.
COOH
Br
Br
-
O
O
Br
O
Br
Illustrazione 4: Formula di
struttura della eosina Y
OH
O
HO
OH
Tecniche di colorazione.
In generale il tessuto può essere
colorato mediante l'utilizzo di
differenti coloranti, i quali vengono
applicati grazie a protocolli ben
conosciuti. Inoltre differenti parti del
tessuto, come i nuclei cellulari od il
citoplasma, risentono ulteriormente di
altre tecniche di colorazione per cui
usando contemporaneamente differenti
colorazioni si possono distinguere
differenti strutture.
Per colorare un tessuto si utilizzano
metodi diretti oppure metodi indiretti.
OH
Com'è facile intuire il metodo diretto
Illustrazione 5: Formula di
è più semplice in quanto il colorante si
struttura della ematossilina
Classificazione dei coloranti in
“aggancia” direttamente al bersaglio
base alla loro produzione.
da evidenziare mentre con il metodo
In linea generale i coloranti
indiretto è necessario operare uno
Le colorazioni semplici.
possono essere classificati in
o più passaggi preparativi affinché
naturali o sintetici. I coloranti
Con i termini “colorazione semplice” il colorante possa svolgere il
naturali, come il nome stesso
proprio compito.
si è soliti indicare una tecnica di
definisce, sono estratti a partire da
colorazione che fa uso di un solo
Quando si ha necessità di
elementi presenti in natura a
colorante. Se il colorante reagisce con
osservare più strutture
differenza dei coloranti sintetici
un solo tipo di struttura allora la
endocellulari si possono usare due
che vengono prodotti nell'industria. colorazione sarà ortocromatica
o più coloranti ognuno dei quali ha
mentre
se,
a
differenza,
un
colorante
L' ematossilina, in inglese
una specificità per la struttura in
reagisce con più tipi di strutture
Haematoxylum, è ad esempio un
questione. Questo è possibile a
virando
il
proprio
colore
allora
si
parla
colorante naturale estratto da una
patto che i coloranti stessi non
di colorazioni metacromatiche.
leguminacea (Haematoxylum
reagiscano tra loro danneggiando il
campechianum) molto utilizzato
tessuto o comunque formando
Il blu di toluidina è un colorante
nell' istochimica.
aberrazioni dell'osservazione. La
metacromatico in quanto è capace di
colorazione combinata in assoluto
colorare nucleo o citoplasma di blupiù usata è quella
Classificazione dei coloranti in
violetto mentre alcuni polisaccaridi di
dell'ematossilina-eosina, spesso
base all'auxocromo ed al gruppo
rosso-rosso chiaro.
cromoforo.
abbreviata con E-E, nella quale il
colorante basico eosina colora gli
I coloranti possono essere, sommariamente, definiti
acidi nucleici e, di conseguenza, il nucleo delle cellule
acidi o basici in base ad alcune qualità chimiche del
eucariotiche mentre l'ematossilina, che è un colorante
gruppo cromoforo e auxocromico. In linea generale le
acido, colora il citoplasma che è leggermente basico.
molecole aventi gruppi cromofori di tipo carbossilico
HO
(COOH) sono definiti acidi e reagiscono con le parti
basiche della cellula. I cromofori aventi funzionalità
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 14/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
La reazione PAS.
La reazione PAS è l'acronimo di Periodic Acid Schif
reaction. Attraverso questa reazione si dimostra la
presenza di carboidrati, come il glicogeno(si veda la
colorazione dei carboidrati) e lipidi (si veda la
colorazione dei lipidi.).
Per effettuare questa reazione si usa l'acido periodico
(HIO4) che ha la caratteristica di ossidare gruppi chimici
preesistenti ad aldeidi (R-CHO). La particolarità
dell'acido periodico risiede nel fatto che è un agente che
non ossida ulteriolmente i gruppi ad acidi carbossilici.
Alla formazione dei gruppi aldeidici segue la
colorazione mediante il reattivo di Schiff che è
altrimenti conosciuto come leucofucsina. La
leucofucsina è ottenuta dalla fucsina basica fatta
reagire con acido solforico concentrato.
Coloranti di uso comune
Nome
Tipo
Affinità
Eosina
Basico
Colora il nucleo di rosa chiaro
Ematossilina
Acido
Colora il citoplasma di blu-viola
Blu di
toluidina
Anfotero
Colora il nucleo di blu-viola.
Colora gli acidi nucleici di blu-viola.
Colora il citoplasma di blu-viola.
Colora alcuni polisaccaridi di rosso.
Fucsina
acida
Acido
Colora gli eritrociti in arancione
Violetto
metile
Acido
Colora l'amiloide in viola.
Verde luce
Basico
Colora le fibre collagene in verde.
Blu alcian
Basic
Colara alcune mucosostanze
(glicosaminoglicani) in blu.
Rosso congo
Anfotero
Colora i nuclei in blu.
Colora l'amiloide in rosso.
Colora il connettivo in rosso.
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 15/ 26
Riepilogo del capitolo: La preparazione di un campione.
L'indagine di un tessuto deve essere preceduta dalla fase di preparazione del campione in
oggetto che ha lo scopo di bloccare l'autodecomposizione dello stesso e permettere l'utilizzo
del preparato anche in tempi successivi. Dopo aver bloccato i processi digestivi, in base al tipo
di indagine ed al microscopio utilizzato, si passa alla fase colorativa nella quale si utilizzano
particolari sostanze, naturali od artificiali, con caratteristiche coloranti ed affinità a strutture
biologiche, molecolari o cellulari particolari.
Parole chiave:
Preparazione, fissazione, metodi di fissazione, colorazione.
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
4
Indagine delle molecole
biologiche.
In questo capitolo trattiamo, sebbene in modo molto
generico, la colorazione di tre classi di composti bioorganici: i carboidrati, i lipidi e gli acidi nucleici.
Carboidrati.
I carboidrati o idrati di carbonio o zuccheri sono
molecole monomeriche o polimeriche formati da atomi
di carbonio, idrogeno ed ossigeno. Il carboidrato più
semplice è la gliceraldeide presente nelle due sue forme
chirali D ed L. Gli zuccheri di valenza biologici sono
simili, per la conformazione di un particolare atomo
chirale, alla D-gliceraldeide per cui vengono definiti
zuccheri della serie D.
Gli zuccheri possono essere presenti sotto forma di
monomeri o formare polimeri. Un monomero è una
singola molecola ciclica di zucchero5 mentre un
polimero è il risultato della condensazione di due o più
monomeri uguali
(omopolimeri) o differenti
(eteropolimeri).
percorso a livello endocellulare degli zuccheri e, in
generale, di tutte le altre molecole marcabili in modo
radioattivo.
La presenza di glucosio, in un tessuto o in una
soluzione, può essere facilmente dimostrata attraverso il
test di Tollens od il test di Fehling. Nel primo caso si
usa la reattività di ioni argento che ossidano il gruppo
aldeidico degli zuccheri aldeidici (glucosio, fruttosio,
mannosio, allosio, etc) a gruppo carbossilico e
precipitazione di argento metallico (Ag2).
HO
COOH
H H
OH
OH
O OH
Fe3+
H
H
H
OH
H
HO
OH
H
H
OH
H
OH
+
Fe2
CH2 OH
Glucosio
Gluconato
Illustrazione 7: Test di Fehling
Tecniche di
localizzazione dei
carboidrati.
La presenza dei carboidrati in
una cellula può essere
investigata utilizzando
1 Metodi radiologici.
2 Metodi di colorazione.
2.1 Test di Tollens o
Fehling (glucosio)
Illustrazione 6: Reazione PAS per la ricerca del
glicogeno
2.2 Reazione PAS
(glicogeno)
(Immagine di pubblico dominio)
Mediante il test di Fehling si
utilizzano al posto dell'argento
ioni rameici (Cu2+) o ferrici
(Fe3+) i quali ossidano il
gruppo aldeidico e si
precipitano sotto forma di
molecole metalliche.
La reazione PAS è, invece,
utilizzata per la rivelazione del
glicogeno. Mediante l'utilizzo
dell'acido periodico (HIO4) e
la successiva colorazione
mediante la fucsina basica il
glicogeno viene colorato di
viola.
Attraverso i metodi radiologici è possibile tracciare il
5 La ciclizzazione degli zuccheri in ambienti acquosi e, di
conseguenza, in ambienti endocellulari è spontanea. Dentro la
cellula, a partire da uno zucchero a catena aperta, si forma una
grande quantità di zucchero a catena chiusa (99,7%) contro una
esigua quantità di zucchero a catena aperta (0,3%)
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 17/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
posto del glicerolo la sfingosina, sfingofosfolipidi che
sono sfingolipidi sostituiti da un gruppo fosfato. Altre
molecole hanno caratteristica lipidica sebbene
strutturalmente dissimili dagli esteri del glicerolo:
queste sono gli steroli tra cui spicca il colesterolo.
Lipidi.
I lipidi, dal punto di vista strettamente biochimico, sono
degli esteri di acidi grassi con il glicerolo, o glicerina.
Secondo la nomenclatura IUPAC il glicerolo è un 1,2,3propantriolo per cui possiede tre gruppi ossidrilici e tre
Tecniche di analisi dei lipidi.
atomi di carbonio.
Dal punto di vista biologico i lipidi, o generalmente
Le tecniche di analisi dei lipidi iniziano dalla fissazione
triacilgliceroli (meno corretta la definizione di
del tessuto da studiare. La fissazione può essere ottenuta
trigliceridi), sono molecole dall'enorme
mediante metodi fisici o metodi
importanza in quanto costituiscono una
chimici.
H2 C
OH
fonte di riserva energetica, possiedono un
La fissazione tramite freeze-drying è
HC
OH
ruolo strutturale per quanto riguarda la
la procedura fisica più utilizzata,
formazione delle membrane biologiche e
sebbene è molto impegnativa e
H2 C
OH
rappresentano, con gli steroidi, dei
costosa. Garantisce ottimi risultati a
Illustrazione 8:
messaggeri ormonali.
patto che venga eseguita con
Formula di struttura
In base al tipi di struttura è possibile
particolare cura.
del glicerolo
classificare diversi tipi di lipidi. La
In alternativa i lipidi possono essere
struttura è generalmente determinata dal
fissati usando la glutaraldeide, o
sostituente di uno dei tre atomi di
l'aldeide formica (formalina). I metodi appena descritti
idrogeno ossidrilici.
possono però portare alla distruzione della componente
Innanzitutto si può operare una distinzione tra lipidi
saturi e lipidi insaturi. I primi hanno, nelle catene
laterali aciliche, carboni ibridizzati sp3 e pertanto
presentano soltanto singoli legami. I lipidi insaturi,
invece, possono presentare una o più insaturazioni.
Le differenze tra lipidi saturi e lipidi
insaturi sono, perlopiù, di caratteri fisico.
A parità di numero di atomi di carbonio il
punto di fusione del lipide saturo sarà
minore rispetto al punto di fusione del
lipide insaturo. L'acido stearico, un acido
grasso a 18 atomi di carbonio, non
presenta insaturazioni e fonde a circa
70°C mentre l'acido oleico, che ha sempre
18 atomi di carbonio ma possiede una
insaturazione, fonde a 16°C.
lipidica.
Per quanto riguarda la colorazione dei lipidi questa
differisce in modo più o meno sostanziale a seconda del
tipo di molecola da osservare. E' per questo motivo che
pur essendo nella stessa famiglia di composti biochimici
il colesterolo viene colorato con un
colorante differente rispetto ad un
O
fosfolipide.
H2 C O C CH2 CH3
In linea generale i lipidi possono
essere localizzati mediante l'ausilio di
lisocromi. I lisocromi sono molecole
O
H2 C O C R
aventi gruppi cromofori con scarsa
Illustrazione 9:
affinità per l'acqua ed alta affinità per
Struttura generica di
i lipidi nei quali si sciolgono.
un lipide o
Mediante i lisocromi sciolti è
triacilglicerolo
possibile vedere al microscopio zone
Una ulteriore classificazione strutturale
più o meno colorate che sono indice
dei lipidi si basa sul tipo di catene e sul
che la sostanza si è sciolta dentro un
sostituente di uno dei tre gruppi ossidrilici del glicerolo ammasso lipidico.
o, in altri casi, della sfingomielina. Si distinguono
I lipidi insaturi vengono colorati grazie alla reazione
quindi, oltre ai triaciligliceroli,i fosfolipidi, i lipidi che
del tetraossido di osmio (OsO4) che reagisce ossidandosi
generalmente possiedono una catena acilica satura
a biossido di osmio (OsO2).
assieme ad una insatura e un gruppo fosfato,
I fosfolipidi vengono individuati grazie alla tecnica
sfingolipidi che sono simili ai lipidi ma presentano al
O
HC O C R
n
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 18/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
PAS (Periodic Acid Schif) che, come abbiamo visto per
i carboidrati, consiste nel trattamento del tessuto con
acido periodico e successiva reazione di contrasto con la
fucsina basica.
I plasmalogeni rappresentano una sottoclasse dei
fosfolipidi. Possono essere rilevati mediante l'utilizzo
della tecnica di colorazione di Feulgen
Nome
Colorazione
mediante
Lipidi
(generale)
Lisocromi
Mediante i liscocromi si
colorano i lipidi neutri in in
differenti tonalità
Fosfolipidi
Acido
PAS,
Luce polarizzata
Tetraossido di
osmio (OsO4) e
seguita da
perclorato di
potassio (KClO4)
fissazione in
formalina
Mediante la tecnica
tetraossido di osmioperclorato di potassio è
possibile distinguere la
mielina normale, che non si
colora, dalla mielina
degenerata che tende a
scurirsi.
Mielina
Plasmalogeni Reazione di
Feulgen
Descrizione
Attraverso la colorazione di
Feulgen è possibile risaltare
i plasmalogeni.
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 19/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
DNA/RNA funge ponte esterico può essere dimostrato
utilizzando la dimostrazione basofila del fosfato.
Nucleotidi, DNA e RNA.
Gli acidi nucleici sono molecole biologiche dall'enorme
importanza. Sono delle lunghe catene eteropolimeriche
formate da nucleosidi legati tra loro da ponti fosforici.
Attraverso gli acidi nucleici è possibile conservare
l'informazione genetica e trasmetterla per la
riproduzione cellulare.
Dal punto di vista strutturale i nucleosidi
sono formati da uno zucchero (ribosio
nel DNA, deossiribosio nell' RNA), una
base azotata. Le catede nucleosidiche
sono legate mediante ponti fosforici.
Gli acidi nucleici, per le proprietà appena
viste, possono essere localizzati mediante
l'ausilio di alcune tecniche.
1. Reazione di Feulgen.
2. Reazione basofila di
dimostrazione del fosfato.
3. Autoradiografia.
Tecniche di analisi dei
nucleotidi, del DNA e dell'
RNA.
Estrazione del DNA.
Nonostante il DNA sia la molecola chiave della vita la
sua estrazione non è affatto difficile a patto di operare
con gli strumenti giusti. Dal punto di vista tecnico
l'attrezzatura necessaria per ottenere del DNA con un
sufficiente grado di purezza consiste in
pochi mezzi di laboratorio: delle
NH2
provette, un contagocce, un becker e
N
vari recipienti riscaldabili. I reagenti, o
N
comunque i prodotti, chimici da usare
CH2OH
si limitano ad un sapone, o detergente,
O N
N
per demolire la membrana cellulare ed
H
H
un alcol per far precipitare il DNA.
H
CH2OH
Opzionalmente possono essere usati
degli enzimi proteolitici per allontanare
OH OH
la parte proteica invischiata nella
Illustrazione 10:
molecola di acido deossiribonucleico.
Formula di struttura
del nucleoside
I passi per ottenere del DNA sono i
Adenina
seguenti:
L'adenina, come tutti
gli altri nucleosidi, è
una molecola formata
da una base azotata
(adenina) legata
tramite un legame
azoto al ribosio.
La colorazione di Feulgen è un metodo
semplice ed economico per mettere in
evidenza il DNA. Attraverso una blanda
idrolisi è possibile separare il ribosio
dalla base e dall'acido fosforico. Dopo la
separazione si colora il tutto attraverso il reattivo di
Schiff (fucsina basica) e il preparato assume nelle zone
di presenza del DNA una tonalità rossa o rossa-scura. La
colorazione di Feulgen è valida soltanto per il DNA e
non per l' RNA che presenta un ribosio più resistente
all'idrolisi.
L'autoradiografia è un modo per tracciare un
nucleotide all'interno della cellula per vedere il suo
movimento e la sua localizzazione. Attraverso un
nucleotide marcato radioattivamente, utilizzando ad
esempio il trizio, è possibile seguire lo spostamento del
nucleotide radioattivo mediante l'utilizzo di rilevatori di
radioattività o tecniche radiofotografiche.
1. Riscaldare a 60-70, per 20
minuti, gradi in acqua e sapone
poco concentrato il tessuto da
analizzare per bloccare l'attività
proteolitica degli enzimi e per
digerire la membrana.
2. Raffreddare il tutto in acqua
quasi ghiacciata per un tempo di
7-10 minuti.
3. Filtrare, mediante delle maglie non troppo
strette, il tessuto ridotto in poltiglia dopo
l'esposizione al calore
3.1.Eventualmente usare un enzima proteolitico
per la rimozione degli istoni. (Passo
opzionale)
4. Far precipitare il DNA, attualmente invisibile,
mescolando una quantità non eccessiva di alcol.
5. Colorare utilizzando un colorante acidofilo come
l'ematossilina (in rosso) o toluidina (bluvioletto).
Il gruppo fosfato, in ultima analisi, che nella catena di
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 20/ 26
Riepilogo del capitolo: Indagine delle molecole biologiche.
L'indagine delle molecole biologiche verte, essenzialmente, sulla loro localizzazione spaziale
all'interno della cellula e, in alcuni, caso sulla loro qualità.
L'importanza di analizzare, qualitativamente e quantitativamente, la presenza di una molecola
ad alta affinità biologica è un aspetto fondamentale dei metodi citochimici ed istochimici.
Ogni classe di molecole ha in genere un proprio protocollo di analisi e, per questo motivo,
osservare un preparato per avere informazioni sulla sua componente lipidica differisce
dall'osservazione di un campione per ottenere informazioni su eventuali acidi nucleici in esso
presenti.
Parole chiave:
Colorazione dei carboidrati, colorazione dei lipidi, colorazione del DNA e degli acidi nucleici.
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
5
Immunoistochimica.
conosciute come difese umorali.
Il riconoscimento del non-self avviene quando un
componente della difesa cellulare, per mezzo di un
recettore posto solitamente lungo la sua membrana che è
del tutto simile ad un anticorpo,
capta un particolare segmento
della molecola, o della cellula,
estraneo definito antigene.
Questo può scatenare la risposta
immunitaria mediante diverse
zone dell'antigene: a livello di un
epitopo oppure a livello di un
aptene.
L' immunoistochimica può essere considerata come una
disciplina a sé stante. Il suo campo
di studio è riassumibile nella
ricerca immunologica all'interno
dei tessuti. L' immunoistochimica
si serve di metodologie, di
strumenti, e di protocolli di
indagine proprie ed uniche ma
molto simili a quanto adoperato
nelle analisi da laboratorio in
microscopio ottica ed elettronica. I
microscopi, in particolare, sono
L'epitopo è una parte
quasi sempre il passo finale
dell'antigene che ha specificità
dell'indagine immunoistochimica e
nei confronti dell'anticorpo e
per questo motivo le conoscenze
viene, per questo motivo, definito
citochimiche ed istochimiche
come sito di legame
vengono a fondersi, quasi per
dell'anticorpo. Un antigene può
Illustrazione 11: Struttura di una
diretta conseguenza, con le
avere differenti zone epitopali e
immunoglobulina
pratiche di immunologia dei
di conseguenza ha la capacità di
Si notano tre regioni: FAB (Fragment
tessuti.
legare a sé differenti anticorpi.
Antigen Binding), la cerniera, e la
Per comprendere, in dettaglio, cosa
L'aptene è, invece, una molecola
regione FC (Fragment Cristallyzed)
studia l'immunoistochimica
di
basso peso molecolare, come
uniti da ponti disolfuro (in rosso). Le
dobbiamo fare un passo indietro
un
carboidrato od una piccola
regioni possono essere variabili (V) o
illustrando, seppur brevemente, il
proteina, capace di legare un
costanti (C) ed appartenere a catene
sistema immunitario animale
anticorpo7 ma non
leggere (L) o pesanti (H).
ovvero quel complesso
sufficientemente in grado di
meccanismo cellulare, biochimico
scatenare una risposta
e fisiologico che entra in gioco
immunitaria8.
quando nel corpo entrano molecole estranee
Le tecniche dell'immunoistochimica.
potenzialmente capaci di creare delle patologie.
La caratterizzazione antigene-anticorpo, ovvero lo
La difesa immunitaria è garantita da un complesso
meccanismo fatto da cellule che si scambiano messaggi studio su come un antigene si lega all'anticorpo in modo
pressoché specifico può essere fatta anche in
biochimici. In questo sistema hanno ruolo i linfociti, i
laboratorio. L'anticorpo, infatti, agisce sia in condizioni
macrofagi, le cellule NK globalmente definite come
difese cellulari che hanno il compito di combattere tutto fisiologiche, ovvero nell'animale vivo, sia in condizioni
ciò non-self6 mediante la sintesi, e l'utilizzo, di molecole
6 Non-self: Diverso. In immunologia la definizione di self e non
self è di fondamentale importanza. Con il primo termine si
intende l'insieme di strutture (cellule, molecole, strutture)
appartenenti ad un determinato organismo. Con il secondo,
invece, si indica tutto ciò che non appartiene all'organismo e
risulta ad esso estraneo. E' anche importante comprendere che
anche la stessa classe di cellule, ad esempio gli eritrociti
prelevati da un paziente A, può apparire non-self se posta a
contatto con un altro individuo (o animale), come nel caso che
tali eritrociti vengano introdotti in un individuo B. Il corpo
animale è capace di riconoscere con estrema precisione ciò che
proprio da ciò che estraneo.
7 L'anticorpo legato può essere quello prodotto dai Linfociti B sia
quello presente nella membrana degli stessi che ha il compito di
rilevare la presenza del corpo non-self per iniziare la biosintesi
anticorpale
8 La risposta immunitaria , nei confronti degli apteni, può essere
iniziata qualora questi si legano a particolari molecole definite
carrier.
Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 22/ 26
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
sperimentali.
Nell' immunoistochimica si sfruttano
anticorpi trattati in modo particolare
per stabilire se in un dato tessuto è
presente un antigene. Si pensi ad
esempio nei casi clinici nei quali è
necessario sapere se un paziente è
affetto da Epatite di tipo B9 (virus
HBV, famiglia hepadnaviridae, genere
orthohepadnavirus). Per effettuare la
diagnosi infettiva si ricorre all'utilizzo
di anticorpi marcati, ovvero
immunoglobuline trattate in modo
particolare che possono essere rilevate
dagli strumenti di laboratorio.
tipo di osservazione un anticorpo primario si lega
all'antigene e, a sua volta, viene
attaccato da un anticorpo secondario
anti-anticorpo primario.
Illustrazione 12: Marcatura di
un anticorpo primario
Se c'è in circolo l'antigene che, nel
nostro esempio, è definito HBsAG gli
anticorpi marcati si legheranno ad esso
e, dopo un lavaggio, permarranno nel
tessuto. L'analisi positiva della
persistenza dell'immunoglobulina
marcata indica che nel sangue del
paziente è presente l'antigene HBsAG
e, con ogni probabilità, questo fa parte
del virus HBV. Qualora l'osservazione
del campione trattato con anticorpi
marcati dia esito negativo, con un
Illustrazione 13: Marcatura
sufficiente margine di certezza10, si
può diagnosticare che l'individuo non è secondaria di un anticorpo
caratterizzato da una infezione virale.
Anticorpi primari e anticorpi secondari.
Un anticorpo, come abbiamo visto, si lega all'antigene e
può essere rilevato se marcato con una opportuna
molecola. Modificare ogni singolo anticorpo, però, è un
procedimento molto costoso e per questo motivo la
marcatura primaria, ovvero quella dove un anticorpo
primario si lega direttamente ad un antigene, è quasi
sempre sostituita dalla marcatura secondaria. In questo
I grandi vantaggi della marcatura
secondaria sono rappresentati dalla
maggiore economicità, in quanto si
risparmia il processo di marcatura
per ogni possibile anticorpo antiantigene, e di tipo operativo, poiché
l'anticorpo primario può essere
attaccato in differenti punti con
anticorpi secondari anti-anticorpo
marcati.
In particolare l'utilizzo di un
anticorpo secondario contro un
anticorpo primario rende possibile
l'esistenza di un ristretto numero di
tipi di anticorpo secondario marcato,
ad esempio anticorpo anti anti-corpo
di pecora, anticorpo anti-anticorpo di
gallina e via dicendo.
I tipi di marcatori.
Per garantire diverse metodologie di
osservazione un anticorpo può venir
trattato con diversi tipi di marcatore.
I marcatori più comuni sono
1. Enzimi perossidasi
2. Marcatori radioattiviti
3. Marcatori fluorescenti
Attraverso la marcatura per perossidasi si assiste ad
una colorazione del mezzo liquido introdotto
successivamente all'immissione dell'anticorpo. Il
marcatore radioattivo può venire osservato mediante
la tracciatura e l'autoradiografia. I marcatori
fluorescenti, in ultima analisi, sono utilizzati per
l'osservazione con il microscopio a fluorescenza.
9 Per maggiori informazioni
http://www.lacellula.net/atlanti/virus/hepadnaviridae/orthohepa
dnavirus/hbv.html
10 In qualsiasi analisi c'è sempre una piccola probabilità di
commettere un errore che può dipendere da un fattore umano,
da una errata calibrazione degli strumenti o dal fatto che il
sistema in analisi non si comporta come da modello.
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Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
L'amplificazione del segnale.
nell'avidina nei quali è possibile legare la
biotina e, per questo motivo, è
sperimentalmente possibile legare alla
avidina un anticorpo biotinilato e, nei
restanti tre siti di legame, tre marcatori
(perossidasi, fluorocromi, molecole
radioattive) biotinilate.
O
In immunoistochimica uno svantaggio del
HN
NH
marcatore, sia applicato ad un anticorpo
H2
HC CH
H2
primario, sia applicato ad un marcatore
C
COOH
C
C
secondario, è rappresentato dal fatto che la H2 C CH C
H
2
S
H2
risposta visiva è spesso blanda. In
particolar modo il microscopio a
Illustrazione 14: Formula
fluorescenza può avere difficoltà ad
di struttura delle biotina
“illuminare” correttamente il complesso
antigene-anticorpo per via di una
relativamente esigua risposta dello stesso.
Abbiamo già parlato del fatto che gli
anticorpi primari, avendo differenti siti di
legame per altri anticorpi secondari
marcati, possono effettivamente
determinare un aumento della capacità di
colorazione/fluorescenza. In laboratorio
vengono utilizzati dei procedimenti
particolari che sfruttano le capacità di
alcune molecole di interagire tra loro.
Il complesso biotina-avidina.
La biotina è una molecola molto
conosciuta in ambiente biochimico.
La si riscontra come cofattore
enzimatico in tutte quelle reazioni
che prevedono carbossilazioni del
substrato come, a titolo di esempio,
nella carbossilazione del piruvato
nella gluconeogenesi11.
Il vantaggio del complesso avidinabiotina consiste nel fatto che per un
singolo antigene è possibile triplicare
l'azione del colorante amplificando, di
fatto, il segnale visibile al microscopio.
In commercio esistono kit già pronti per
operare la tecnica biotina-avidina che
prendono il nome di set ABC (avidinebiotine-complexes) utilizzanti quasi
esclusivamente la funzionalità
dell'enzima perossidasi.
Illustrazione 15:
Rappresentazione
computerizzata della
proteina avidina
I saggi ELISA.
Attraverso questi saggi è
possibile indagare la presenza di
anticorpi anti-antigene oppure la
presenza di antigeni in un dato
tessuto utilizzando come
substrato, rispettivamente,
antigeni conosciuti e anticorpi
conosciuti anti-antigene.
Questa molecola viene introdotta
normalmente con l'alimentazione e
ha una elevata affinità con una
proteina a basso peso molecolare:
l'avidina.
L'avidina è una glicoproteina
presente nell'albume dell'uovo e si
lega saldamente alla biotina
formando il complesso avidinabiotina. Esistono ben quattro punti
I saggi ELISA12 (Enzymed Linked
Immunoabsorbent Assay) rappresentano
la diretta evoluzione dell'indagine
immunologica anticorpoantigene.
Illustrazione 16: Schema biotinaavidina-perossidasi
11 Per maggiori informazioni consultare l'articolo “La biosintesi
dei carboidrati attraverso la gluconeogenesi” disponibile
all'indirizzo:
http://www.lacellula.net/appunti/biochimica/biosintesi_dei_carb
oidrati_gluconeogenesi.html
Mediante i saggi ELISA
vengono analizzati presenze
virali antigeniche come quelle
determinate dal virus HIV.
12 Per maggiori informazioni sui saggi ELISA è possibile
consultare la pagina “I saggi ELISA” disponibile all'indirizzo:
http://www.lacellula.net/appunti/immunologia/elisa_diretto_indi
retto_sandwich.html
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Riepilogo del capitolo: Immunoistochimica.
L'immunoistochimica è lo strumento scientifico mediante il quale è possibile indagare la
relazione antigene-anticorpo sfruttando la specificità che hanno le immunoglobuline a legarsi
saldamente all'antigene. Anticorpi marcati con particolari molecole vengono visualizzati
dall'operatore utilizzando gli opportuni strumenti.
Parole chiave:
Immunoistochimica, saggio enzimatico, anticorpo primario e secondario, anticorpo marcato,
biotina-avidina
Metodologie di indagine citologiche ed istologiche
6
I marcatori tumorali.
Con il termine di marcatore tumorale si intende una
sostanza chimica secreta in modo quantitativamente
abnorme nel decorso di diverse neoplasie localizzabili
in diversi punti dell'organismo. La molecola marcatrice,
in base agli studi effettuati, viene sintetizzata dalle
cellule tumorali e rilasciata generalmente nel torrente
ematico e, in alcuni casi, può essere rintracciata nelle
urine.
L'analisi dei marcatori tumorali, nonostante diversi
decenni di sperimentazione, pone ancora seri
interrogativi scientifici. I valori rappresentanti la
concentrazione delle molecole, infatti, possono variare
da paziente a paziente in modo molto significativo.
Questa caratteristica introduce, nella diagnosi, falsi
positivi o falsi negativi che devono necessariamente
essere approfonditi con tradizionali indagini citologiche.
Il primo marcatore tumorale scoperto fu il CEA
(Antigene Carcino-Embrionico), che nel 1960 veniva
isolato da due medici Statunitensi. L'aumento del titolo
del CEA nel fluido sanguigno fu ricondotto ad una
neoplasia del colon e, più in generale, a neoplasie del
sistema gastrointestinale. Dopo questa scoperta migliaia
di potenziali molecole sono state sottoposte
all'attenzione dei comitati scientifici e per alcune di esse
si è trovata una correlazione, nei limiti dell'affidabilità
intrinseca ai marcatori, concentrazionemarcatore/neoplasia.
Sigla
Nome
Descrizione
CEA
Antigene CarcinoEmbrionale
Rilasciato dalle
formazioni neoplasiche
del colon e di parti
dell'intestino.
Il CEA viene anche usato
per diagnosticare
metastasi al cervello.
AFP
Alfa-feto-proteina
Proteina normalmente
presente nel feto e
rilevabile in minor
quantità nell'adulto. Il
titolo aumenta nella
donna incinta e in casi di
tumore epatico (HCC) e
del tumore dell'ovaio.
HCG
Gonadotropina
corionica
Proteina sintetizzata,
normalmente, in
gravidanza. Diventa
marcatore tumorale nei
casi di neoplasia
teratomica e neoplasia
coriocarcinomica.
CA125
Antigene carbonato
125
Antigene riconducibile al
tumore dell'ovaia.
Generalmente utilizzato,
a fini diagnostici,
assieme ad altri marcatori
CA15-3
Antigene carbonato
15-3
Antigene associabile al
cancro della mammella.
CA19-9
Antigene carbonato
15-3
Antigene associato ad
alcuni tumori del tratto
intestinale come le
neoplasie del colon e del
retto.
PSA
Antigene Prostaico
specifico
Presente in forma libera
ed in forma associata.
Può essere riconducibile
a neoplasie benigne
della prostata qualora il
PSA libero aumenti in
concentrazione, o a
neoplasie maligne
quando il rapporto PSAlibero/PSA-associato è
grossomodo eguale.
Tabella 1: Specchietto riassuntivo dei principali
marcatori tumorali.
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