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ISTISAN 95/I
(ISSN 1111-3117}
ISTITUfO SUPERIORE DI SANITA'
m Semlaario di agiornamento suU'epatile da HCV:
dlaposl, epidemloloKbl, prevenzione e terapia
lstituiO Superiore di SaniiA
Roma, 23-24 gennaio 1995
AUi a CID'Il di Maria Rapiceua
LaboraJorio dj VirologUJ
Roma
1995
Istituto Superiore di Sanità, Roma
m SeadbArio di aar&ornameuto 111lrepadte da HCV: diagnosi, epklemlolotia, preveazione e tenpla.
lstiruto Superiore di Sanità. Roma, 23-24 gennaio 1995.
Ani a cura di Maria Rapiceua
1995, v, 227 p. Rapporti ISTISAN 95/1 (in italiano, inglese)
Sono tranate le più reeenti acquisizioni disciplinari, per quanto concerne gli aspetti virologici e patogenetici
dell'infezione da HCV, in particolare in relazione ~~gli studi sull'agente vitale, sulle IUe caratteristiche genomiche ed
espressione genica sui marcatori indotti nel corso dell'infezione, e in relazione agli studi su possibili vaccini. Sono, inoltre,
trattati i progressi raggiunti nel campo dell'epidemiologia, p-ofi lassi e terapia dell'infezione. Tali dati hanno un notevole
impatto in vari settori di interesse medico e saniwio quali quelli relativi alla lefapia e alla prevenzione dell'infezione.
Ptuole chiave: Formazione, InJezioni, Virus epatite C.
Istituto Superiore di Sanità, Rome (haly)
ID Seminar OD developments ID HCV hepatltis: dlagnosis, epklemlology, pr.venUon and tberap)".
Istiruto Superiore di Sanità. Rome. 23-24 January 1995.
Proceedings edited by Maria a.p;ceua
1995, v, 227 p. RapportilSTISAN 95/1 (in halian, English)
The )alesi achievements from Ùle studies on HCV genome strucrure and expression, on vaccine development and
significance of infection markers are reported, as well as, epidemiology, prophylaxis and lherapy perspectives. Such data
bave gready impacted on various areas of mediclne and heaiÙistructures as concems Ùle infection therapy and prevention.
Key WOt"ds: Hepatitis C virus,lnfections, Training.
Si ringrazia Cinzia Bisegna per la collaborazione tecnica prestata per la realizzazione del presente rapporto.
C l.rtiluto S~riore di StuUuì 1995
.
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.
INDICE
Introduzione.................................................................................................... Pag.
I
Maria Rapicetta
ASPETTI VIROLOGICI DELL'INFEZIONE DA HCV
Ferruccio Boniao, Maria Rapicetta
HCV structura/ proteins: expression in different anima/ ce/ls......... ................. Pag.
3
Tatsuo Miyamura
HCV detection in blood transjusion. ................................................................ Pag.
IO
Cee L. V an Der Poel
Tavola rotonda:
ASPE177 DIAGNOS17CI DEU 'INFEZIONE DA HCV
Erica Villa, Alessandro Zanetti
Saggi di screening e saggi addizionali ............................................................. Pag.
I8
Anna Rita Cicc::aglione, Maria Rapicetta
Importanza della quantizzazione ed analisi dinamica. ..................................... Pag.
27
Ferruccio Bonino
Determinazione dei genotipi del/ 'HCV: aspetti diagnostici ed interesse
clinico............................................................................................................. Pag.
Elisabetta Cariani, Antonella Ravaggi, Angelo Rossini
33
Il
Aspetti istologici dell'epatite da HCV ............................................................. Pag.
Luisa Bercic:b, Mariafausta Bonetti, Giovanna Fabbreti, Laura Lucini,
Francesco Callea
43
Tavola rotonda:
STORIA NATURALE E PATOGENESI DELL'INFEZIONE DA HCV
Alfredo Alberti, Antonio Craxì
Storia naturale dell'infezione da virus C ........................................................ Pag.
47
RaffaeUa Romeo, Massimo Colombo
Meccanismi virologici dell'infeziune .............................................................. Pag.
52
Maurizia Rouana Brunetto
Autoimmunità.................................................................................................. Pag.
56
Francesco B. Bianchi, Laigi. Muratori, Marco Lenzi
Tavola rotonda:
EPIDEMIOLOGIA DELL'INFEZIONE DA HCV
Nicola Caporaso, Evangelista Sagnelli
Modalità di trasmissione delle epatiti Non A,Non'B parenterali...................... Pag.
59
Alfonso Mele
HCV: trarmissione intrafamiliare e sessua/e.................................................... Pag.
66
Maria Chiaramonte
Trasmissione nei gruppi a rischio .................................................................... Pag.
Piero Dentico, Rosalba BuoDgioro.o, Anna Volpe, Antonio.Migfietta,
Gaetano Lonero, Rodolro S1cco
74
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..
U1
Trasmissione verticale!perinatale <kl virus HCV. ............................................ Pag.
Alessudro ZIDeUi ed il Gruppo di Studio
79
Trasmi&Jione nella popolazione generale: fatiori dt rischio............................. Pag.
Tomm- Strofrollnl
81
Fatiori di rischio per epaJtte C nsl/a popolazione generale: uno studio
caso-controllo. ................................................................................................ Pag.
Mauro Zaccarelli, Maria Antonella Longo, Puquale Noto, Gianna
Touini, Fabrizio Ferri, Ubaldo Visco Comandini, Giuseppe Visco
88
Ruolo <kl virus <kl/'epatite C nelle infezioni profes.rionali degli operalori
sanitari............................................................................................................ Pag.
Nicola Petrosillo, Francesco Albertonl, Vincenzo Di Nardo, Vincenzo
95
Puro, Carla D'Ubaldo, Giuseppe lppolito
Tavola rotonda:
ASPE171 CUNICI E DI TERAPIA NEU 'INFEZIONE DA HCV
A: ASPE117 CUNICI
Mauimo Colombo, Antonio Alcione
ValutDziooe clinica del paziente cronico sintomaJico....................................... Pag. l 00
Luigi Ortona, Andrea De Luca
Aspetti clinici 1111ll'infezi01111 da HCV: valutazi01111 clinica <kl paziente
crooico asintomatico. ...................................................................................... Pag. l IO
Nicola Caporuo, Giovanna Del Vecchio-Bianco, Eny Crafa, MarieUa
Forestieri, Gabriella Sessa, lole Falzarano, Pino lasevoli, Coacetta Tuccillo,
Filomena Morisco
Valutazione clinica di!/ paziente cronico asinlomatico..................................... Pag. l l 7
Giovuoi Raimondo
IV
Valutazione clinica del paziente crtoglobulinemico e del paziente
autoimmune..................................................................................................... Pag. 121
Francesco B. Biancb~ Luigi Muratori, Marco Lenzi
Infezione da virus del/ 'epaJite C (HCV): Problematiche connesse
al trapianto di fegato ....................................................................................... Pag. /25
Erica Villa, Antonolla Gnttola, Paola Buttalllco, Anuliu Merighi,
Uva Ferretti, Federico Manenti
B: ASPE177 TERAPEU11Cl
Maria Cbiaramnte, Giovanni Raimondo
/nteljeron in clrronic hepaJitis C: an evaluation ojeffectiveness and
unresponsiveness. ............................................................................................ Pag. /30
Anteaio Crul, Cristilla Linea, Silvio Magrin
Valutazione del trattamento a lungo termine con IFN. ..................................... Pag. 149
Giuseppe Visco, Evangdo Boumis, Fabrizio Ferri, Maria Antonella
Longo, Puq1181e Note, Gianna Touin~ Mauro ZaccareUi
Fallori predittivi di risposta a/l'interjerone nel/ 'epatite cronica da HCV. ....... Pag. !60
Alfredo Alberti, Liliana Cbemello, Patrizia Poatiao
Terapia con inteljerone nei "casi difficili "...................................................... Pag. /68
Evangelista Sap~ Fftlltesca Maria Fdaeo, Lucia Aprea, Vilocenzo
Meaina, Felice Pieeiloiao
Nuove prospettive di terapia............................................................................ Pag. 172
Antonio Aidone, Giovan Giuseppe Di Costanzo
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Tavola rotonda:
INFEZIONE DA HCV
PROBLEMA11CHE COI{NESSE ALLA PRA11CA TRASFUSIONALE
GIUHppe De Stuio, Emilio ManneiiL
Infezione da HCV: implicazioni nella pratica trasfusiona/e............................. Pag. I 77
GiUHppe De Stasio
La sorveglianza delle epatiti post-trasfusionall in I/JJ!ia e all'estero................ Pag. I9 I
Emilio Mannella, Micbelina Miceli, An11ela Di Loreozo, Assunta GaUo
SllldiiJ sui riceventi unità di emocompanenti da donatori successivamente
sieroconvertiti HCV. ........................................................................................ Pag. I98
Osvaldo Glacbino
Valutazione di un test anti-HCV di terza generazione applicato a doe
popolazioni selezionate: epatiti acute NANB (indagine retrospettiva)
e donatori di sangue indeterminati alla secondo generazione.......................... Pag. 204
Marisa De Palma
Esperienza multicentrica con
test di JA generazione nello screening
HCV dei donatori di sangue............................................................................ Pag. 2I2
Enrico Pauarelli Pula, Maurizio Lanteri, Sante Barbante, Cesare
Fausto Bertorello, Paolo Cagetti, Giuseppe Cambié, Patrizia CoUinassi,
W alter Cozzolino, Marisa De Palma, Osvaldo Giacbino, Paolo Gottardl,
Ermanna Iiritano., Giovanni Landueci. Michela Macri, Mara Miazzucco,
Carlo Omodei-Zorini, Gaetano Polignano, Paolo Rizzone-Faviccbio,
Mario Ronl, Liliana Santarossa, Piera VaUauri, Leopolda Zampieri
Valutazione esterna di qualità di saggi di screening anti-HCV nei servizi
trasfusiona/i (S. T.) italiani. RiS!tltati relativi al trtennio I992!94..................... Pag. 22I
Maria Orlando, Alessandra Barca, F1avia Cbiarotti, Giuseppina Ruggia,
Giuseppe Pizzocolo.
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l
INTRODUZIONE
Maria Rapicetta
Laboratorio di Virologia
Istituto Superiore di Sanità - Roma
Sono trascorsi più di cinque anni dalla identificazione del virus dell'epatite C
(HCV) quale principale agente eziologico deUe epatiti post-trasfusionali e sporadiche
precedentemente classificate nell'ambito delle epatiti di tipo non-A, non-B.
Negli ultimi 2-3 anni si è avuto un notevole progresso delle conoscenze sulla struttura
genomica virale.
n significativo sviluppo che ne è derivato, per quanto concerne i metodi
sperimentali di rilevamento dei marcatori viraJi e lo studio dei prodotti di espressione in
vari sistemi procariotici ed eucariotici ha avuto, inoltre. una rapida applicazione nel
campo delle scienze mediche.
In un considerevole numero di pazienti con epatite acuta e cronica di tipo non-A,
non-8 e di tipo autoimmune e di pazienti con cirrosi ed epatocarcinoma è stato possibile
effettuare la correlazione della malattia con l'infezione da HCV. I valori di prevalenza dei
marcatori virali nelle varie aree geografiche ed i meccanismi di trasmissione dell'infezione
sono sufficientemente identificati, sebbene sia ancora oggetto di studio l'importanza
epidemiologica dei meccanismi di trasmissione verticale e sessuale e parenterale
inapparente.
Lo screening di tutte le donazioni di sangue, applicato a partire dal 1990, ha
ridotto in modo sostanziale l"incidenza dell'infezione correlata alla somministrazione di
sangue e suoi prodotti.
Nel campo della ricerca virologica numerosi studi sono stati dedicati alla
definizione dei livelli di variabilità del genoma virale, nei differenti isolati, ed alle possibili
implicazioni in campo biologico e patogenico. Sono in atto tentativi classificazioni che
includono fino a 9 genotipi e vari subtipi. I dati di queste ricerche hanno un notevole
impatto oltre che neUa definizione di appropriate strategie per un'accurata diagnosi e per
2
un'appropriata selezione dei pazienti ai fini dell'efficacia dei trattamenti terapeutici,
soprattutto nel campo della ricerca per lo sviluppo di vaccini per una profilassi specifica.
Il Seminario di cui vengono riportati gli atti in questo volume, costituisce il III
incontro, presso l'Istituto Superiore di Sanità, dopo quelli del 1990 e del 1992. Viene
trattata l'infezione da HCV, nei suoi principali aspetti virologici e patogenetici, per
quanto concerne le più recenti acquisizioni disciplinari e sono discusse le relative
implicazioni nella pratica diagnostica e clinica e nella profilassi.
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..
3
HCV STRUCTURAL PROTEINS: EXPRESSION IN DIFFERENT ANIMAL
CELLS
Tatsuo Miyamura
Department ofVirology Il, National Institute ofHealth, Toyama 1-23-1, Shinjuku-ku,
Tokyo 162, Japan.
Hepatitis C virus (HCV) is the most important causative agent of post-transfusion
and sporadic non-A, non-B hepatitis. HCV has a positive-senso RNA genome of
approximately 9.4 kilobase which encodes a large polyprotein of about 3,000 antino
acids [l). Since effective replication system in tissue culture ceUs has been reported, it is
not yet known how the structural proteins of HCV are synthesized, processed and finally
forrn virus particles during the course of virai replication. The analyses of the structure
of the HCV genome, the comparativo study of its antino acid sequence with those of
ftavi- and pestiviruses, in vi(ro tranSiation of HCV -RNA and gene expression
experiments in Escherichia coli, yoast and animai cells hsve revealed thst the structural
proteina are procossed by a host cellular signalase and the remaining nonstructural
proteins, NS2-NSS, are cleaved by virus-coded proteinases (Fig. l) [2-9).
We hsve cloned a typo lb HCV cDNA from a patient with hepatitis C and
expressed it using (i) recombinant baculoviruses [IO, Il], (ii) repUcation-deficient
recombinant adenoviruses [12), (iii) transient expression in COS cells under the contro!
offoreign promoters derived from the SV40 early genome [4, 13) and (iv) constitutive
expression in human hepatic cells by using promoter of tho human polypeptide chain
elongation factor which is useful to obtain stable transfectants [ 14).
Processing and
immunological properties of the HCV structural proteins will ho discussed .
The HCV Core protein (p22) is unglycosylated protein of about 22 kilo-dalton
(kD) encoded by the S' proximal portion ofthe large open reading frame (ORF) (16). lt
is considered lo be composed of 191 amino acids (5). lt is rich in arginino and lysine
particularly at its N-tenninus (23.5%), as are those offlaviviruses, and it can bind to the
4
RNA genome to form a nucleocapsid of an HCV virion.
Although their hydropathy
profiles look similar, distinct amino acid homology among HCV, pestiviruses and
flaviviruses is not detectable in this region of the genome. Because of the presence of
extremely hydrophobic domains at its carboxyl (C) terminus, the p22 protein i.s expressed
in the cytoplasm ofanimal cells [4, IO]. When the C-terminai hydrophobic domains were
deleted, however, the truncated Core proteins were translocated into the nucleus [16]
The truncated Core proteins were located in the nucleus even when they were expressed
as a fusion protein with E.coli 13-galactosidase which is essentially localized in the
cytoplasm. Plasmids containing HCV cDNAs with one of the regions encoding clusters
ofbasic amino acids deleted were expressed in COS cells and the localization ofthe Core
protein was examined. The residues PRRGPR were suggested to play an important role
in nuclear localization. This phenomenon reminds us of the assembly of anchored Core
protein of flaviviruses, during which it is converted t o mature Core protein by remo val of
the C-terminai hydrophobic segments. In the case of West Nile virus, the cleavage is
dane by virai proteinase [16]. In the cells infected with recombinant vaccinia virus [8] or
recombinant adenovirus [12], transfected with expression plasmid and constitutively
expressing HCV Core protein [14], a truncated Core protein of 16 kD was also detected.
The mechanisms of production, biological function and localization of the truncated Core
protein are not known.
The envelope protein (El and E2) regions are located downstream of the Core
region. The El protein (gp35) is a glycosylated protein of about 35 kD. After
deglycosylation of the expressed product in animai cells, this protein band shifts to 22 kD
[13]. It is composed of 192 amino acids. The amino acid sequence in this region is not
conseiVed as much as that of the Core region among different HCV isolates. The E2
region may encode the second envelope protein, gp60 [17]. The hydrophobic profile of
the HCV polyprotein suggests that the HCV E2 protein corresponds to the flavivirus
NSI glycoprotein and the major pestivirus
. envelope protein
. gp53/gp55 (E2) (gp53 in
bovine virai diarrhea virus and gpSS in hog cholera virus).[18, 19]. Both flavivirus NSI
protein and pestivirus E2 protein bave been shown to induce protective immunity in
immunized animals [20-22]. There exist extremely hypeJVariahle sequences among
(
..
s
diJferent HCV isolates [23, 24). The heterogeneity ofthis region is also observed even in
single patients during the course of the disease. This raises a serious concem for the
future development of'eftèctive vaccine for hepatitis C. Recently. immunoprecipitation
experiments with specific monoclonal antibodies have suggested that the E l and E2
proteins fonn a disulfide-linked heterodimer in pestiviruses [18] [25). Similarly,
coprecipitation of E I and E2 proteins of HCV has also been detected in cells transiently
expressing these two proteins [12). The molecular size of the HCV E2 produCI varies
(from 58 to 72 kD) in different lahoratories and ditferent expression systetns [5, 6-8, 17,
26-28].
Amino acid sequences of Core protein are highly conserved among ditrerent HCV types
isolated and analyzed so far. The Core protein is sufficiently immunogenic to raise
specific antihody.
Therefore, an antibody to HCV Core protein is found with high
frequency in the serum of patients with hepatitis C [ 10]. A recently developed antibody
detection assay using the p22 protein is effective for screening blood and for precise
diagnosis of hepatitis C. On the other band, antihody to the E l protein is detectable in
only 10-20"/o of patients with hepatitis C at various stages of infection and in some rare
hepatitis C cases who recovered naturally from the disease [13]. These observations
indicate that anti·El antibody might bave some neutralizatioo activity. The coexistence
of anti-El antibody with HCV in patient serum might reflect the appearance of escape
mutants or mixed infèctions of serologically ditrerent types of HCV. In spite of the
presence of hypervariahle regions within the E2 region of the HCV genome, antibody to
E2 protein is found with very high frequency among hepatitis C patients, using
immunofluorescence or ELISA assays. However. when the antigen is denatured by SDS
for Western blotting, the detection rate is lower [17, 26, 29]. These data, together with
the observation suggesting the formation of heterodimers of the E l and E2 proteins,
indicate that the envelope proteins ofHCV constitute complex tertiary structures. As yet
there is no system for direct detection of antibody to the natura! E I-E2 protein produced
during the course of HCV infection. Il is of extreme importance to analyze the native
6
HCV proteins in detail. lt is also vital that nove! sensitive diagnostic tests as well as an
etfective vaccine are deveJoped.
Structural proteins
Nonstructural proteins
NS2
NS3
p22 gp35 gp60-70 p24
p70
NS4
b
p8 p27
NSS
a
b
p58
p68
3'
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IO
HCV DETECTION IN BLOOD TRANSFUSION
Cees L Van der Poel
Red CrossBlood Bank Ulrecht, Rubenslaan 190,3582 JJ Utrechl, The Netherlands
Sensitivity of anti-HCV blood donor trsting
After the originally isolated hepatilis C virai (5-1-1) clone, lesting for antibodies lo the
causative agent of post-transfusion hepatitis non-A, non-B (PTH-NANB) became possible.
At present third generation anti-HCV ELISA's (EUSA-3) include recornbinant or peptide
antigens front lhe putative Core, NS3, NS4 and NS5 HCV regions (Figure). These BLISA-3
systems are now widely used in blood donar screening, and are more sensitive and more
specific !han earlier generations (1, 2). The sensitivity ofELISA-3 blood donor screening, in
terms ofprevention ofHCV transmission and subsequenl post-transfusion hepatitis C (PTHC) in recipients of blood is now practically l 00%. Situations may occur when antibody lests
do not detect HCV infection. Immuno-suppressed
palient~
such as renal transplant patients,
may sometimes be anti-HCV antibody negative but remain HCV infected, but such
individuals are noi likely to donate blood. More relevant to blood transfusion services is the
period of early HCV infection in an asymptomatic donor. lt may take as long as 6 months
alter primary infection for an anti-HCV response to develop, the mean period between HCV
infection and detectable antibody being 12 weeks (3). Although rare, a HCV infected
donation nùght thus be missed by present anti-HCV screening. lgM anti-HCV antibody tests
employing Core proleins bave been evaluated, but were of no additional value in diagnosis of
acute HCV infection.
Specificity and confinnation of anti-HCV blood donor testing
Even with the high specificity (99. 7%) of anti-HCV BLISA-3, fàlse-positive test
results are relatively common arnong blood donors 2 . Tbe pOsitive predictive value ofthe test
depends on the prevalence in the population, which is very Jow. Therefore anti-HCV ELISA
reactivity needs lo be coofirmed with supplernental assays.
{
Il
For confinnation of positive anti-HCV ELISA test resq!ts, different fonnats such as
recombinant immunoblot assays (RIBATM. Chiron) and synthetic peptide assays (lnno-LùoiM,
Innogenetics) are developecf· Al present, the in Europe widely used third geoennion RIBA
system (RIBA-3) employs synlhetic peptides from the Core, and NS4 regions, and
recombinant antigens from the NS3 and NSS regions. The preparation of HCV anrigens may
differ among rnanulàcturers of supplemental assays, which in the case of NS3 is important,
with regard to conformational epitopes. A modification of a (NS3 derived) C33 antigen was
shown to largely enhance the sensitivity of the RIBA-3 system as compared to the previous
generatian
l.3.
RIBA-3 results are interpreted as confinned positive when antibodies to
antigens ofmore than one HCV region are detected. A high proportion, but not ali (75-80"/o)
of such HCV RIBA-3 positive individuals are viraemic, as detected by HCV cDNA-PCR.
RIBA-3 positive but HCV cDNA-PCR negative individuals may bave cleared the virus from
the circulation after previous infection, they may be viraernic below the PCR detection leve!,
or just represent false positive anti-HCV antibody reactivity. Negative HCV cDNA-PCR in
serum of anti-HCV RIBA positive asymptomatic individuals was sbown to correlate with
norma! histological frndings in liver biopsy, probalbly indicsting clearance of the virus (4).
However in hepatitis C patients treated with anti-viral drugs, HCV viraemia may re-occur
after a PCR negative period, indicating the possibility ofHCV RNA below the HCV cDNAPCR detection level or presence oflNC in non-blood compartments. In tenns of notificatian
of the deferred blood donor, RIBA-3 confrrrned positivity combined with negative cDNAPCR represents a diagnost.ic problem. Most of these donors have a history of an overt risk
factor for parenteral exposure to HCV, suggesting that positivity of the RIBA-3 represents
true HCV infection, rather than non-specific reactivity (S).
Indetenninate anti-HCV results in blood donon
Oflen anti-HCV antibody reactivity is found against orùy one of the HCV antigens of
the supplemental assay. Such pattems are interpreted as indetenninate, and may represent
non-specific IgG binding, resolved (PCR negative) HCV infection, or actual HCV viraemia.
Among healthy blood donors, indetenninate RIBA results most often represent non-specific
reactivity, but since RIBA-3 is more specific than RIBA-2, the numbers of such RIBA
12
inderminate test results are now largely reduced (5). However, during the initial period of an
acute HCV infection with increasing anti-HCV antibody response, one may occasionally find
weak or indeterminate anti-HCV RIBA reactivity, and rarely individuals with "sero-reversion"
after previous HCV infection, may show RIBA indetenninate test results aver prolonged
periods of time. It is therefore advisable to al so re-confinn RIBA indetenninate test results in
blood donors with HCV cDNA-PCR
Confinnation of HCV infection by PCR
Given the mentioned limitations of anti-HCV antibody testing. detection of HCV
viraemia is often indicated. As a result ofthe low titers ofHCV RNA, amplification ofnucleic
acid is needed. A most frequently followed protocol is performed by PCR after a reverse
transcriptase (RT) step, transcribing the vira! RNA into cDNA (6, 7). HCV cDNA-PCR has
evolved from a research tool into a widely used diagnostic test, the most frequent applications
being: confirmation ofHCV infection in individuals with RIBA positive or indeterminate antiHCV antibody test resu1ts, early diagnosis in patients with acute hepatitis, monitoring ofHCV
transmission in epidemiological studies, and follow-up of anti-viral drug treatment. Childhood
diseases of upscaling this high-tech diagnostic bave been encountered, and a first European
proficiency pane! revealed only 16% ofthe laboratories to yield faultless HCV cDNA-PCR
results, a picture that was not dramatically changed by a more recently perfonned proficiency
pane! (8). lt could be expected that commercia! availability ofHCV RNA amplification might
improve the standardisation and reliability of such assays. In addition, estimation of the HCV
Wus load was shown to be of importance not only in monitoring anti-viral therapy, but also
because of the correlation of high virus loads with more severe histological abnonnalities in
the liver (9). An elegant method to quantitate HCV RNA under standardised conditions was
developed by Chiron Corporation, where signa1 amplification in a hybridisation assay with
branched DNA (bONA) molecules was used to provide a linear correlation between test
signal and virus titre over a 3-4 logs range. However the bDNA assay is about 3 logs less
sensitive than cDNA-PCR, resulting in only 7rJ'/o of the HilV cDNA-PCR positive samples
being detected by HCV bDNA assay. Another commercially available HCV PCR assay,
ernploying one single enzyme for reverse transcription and DNA polymerisation was recently
(
13
introduced, and yields reasonable results as compared to domestically developed HCV-cD NA
PCR methods (IO).
Transaminase testing
Assessment of hepatitis C virus infection includes serum transaminase testing. As
alresdy observed in the previous decades, chronic NANB (C) hepatitis is chsracterised by
fluctuating levels of alanine arninotransferase (ALT), or long term marginai ALT elevations at
dose range to normal values. It was shown that 60"/o of the HCV infected individuals bave
normal ALT values in transversal studies, and that the ml\iority (80%) of asymptomstic HCV
viraemic but ALT normal individuals bave chronic persistent or chronic active hepatitis
(CPH/CAH) with or without cirrhosis (Il).
A normal ALT value in HCV infection is
therefore of limited diagnostic value. In addition, 70% of PCR/RIBA conlinned positive
blood dono111 bave a normal ALT leve! (12). The sensitivity far ALT screening of blood
dono111 was calculated at 30%, 40%, and 60"/o in the USA, Japan, and Europe respectively
( 13-15). It is doubtful whether continuation of ALT testing of blood dono111 in countries
where this test was introduced as a surrngate marker far PTH-NANB infection, would stili
add to the safety of the blood supply, now tbat third generation anti-HCV testing is
established.
Importance of risk facton in blood do non
The main mute ofHCV transmission is parenteral, and the majority ofHCV infected
individuals are either recipients of blood products that had previously not been screened far
anti-HCV, or intravenous drug use111 (IVDU), especially pe1110ns who in the past injected
drugs only occasionafly, and do not percieve thernselves as a risk group of parenteral virus
infection (12). Incidental parenteral risk factors also include tattoo and needle stick accidents
among health care workers. Proper assessment of such risk factors is of great irnportance far
donar selection procedures. in arder to reduce the chances that a donar with early HCV
infection escapes the blood screening with anubody tests. In addition, the presence of a
histoty of parenteral risk factors may help in diflicult diagnostic situations i. e.: conflicting
RIBA l PCR results.
14
Breaking the chain
As in low-prevalence countries 40-500/o of the HCV infected blood donors have
acquired the infection by recieving blood transfusions themselves, blood transfusion in the
past played a significant role in maintaining an epidemiologica1 vicious circle.
The main consequences ofHCV infection are chronic, HCV being persistent in about 800/o of
the cases, leading to chronic hepatitis, cirrhosis and probably to hepatocellular carcinoma
(HCC) (Il, 16). Retrospective analy~s of followed-up transfusion recipients with HCV
associateci HCC in Japan, showed a progression of chronic hepatitis C, cirrhosis and HCC
after a mean interval of respectively l O, 19 and 29 years after transfu~on ( 17) Recent repons
on the chronic sequelae of HCV infection thus leave a more pessimistic impression than
previously imagined from the earlier follow-up studies on chronic NANBH patients when
HCV testing was not available. Apart from the recent scientific achievements on HCV
virology, inununology and treatment, the ·screening ofblood donors for anti-HCV, resulting
in practically the elimination ofpost-transfusion hepatitis Cis the major milestone.
(
structural
.~
111
1
•
NS5
nt
l N~5. laa
3'
HCV eocoded antigeos upressed (or diagoostic anU..bcv antibody detection in recombinant immuooblots (RIDA).
C22
NS6
NS3 ] ~S4j
C100
5-1-1
C33c
C200
C33c
5-1-1 l C100
][E~][E2JNs!]~~~
C22--
-PCR
-_l_-~- -~-~---
non-structural
- - - - c I~;·~;~;1r;-I ~-~~~-.l~ _;~~
5'
HCV recombinant & peptide antigens
-"'
,.
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18
SAGGI DI SCREENJNG E SAGGI ADDIZIONALI
Anna Rita Ciccaglione, Maria Rapicetta
Laboratorio di Virologia. Istituto Superiore di Sanità, Roma
I saggi di screening utilizzati per il rilevamento di infezione da virus dell'epatite di
tipo C (HCV) sono basati su metodiche immunoenzimatiche di tipo indiretto che
evidenziano anticorpi specifici. Non sono al momento disponibili saggi in grado di
svelare la presenza di antigeni virali da campioni sierici. I saggi per il rilevamento di
HCV-RNA. diffusamente applicati in ambito diagnostico nei laboratori a più elevato
livello di specializzazione, sono in via di standardizzazione per un più ampio impiego
attraverso l'allestimento di kit commerciali.
Le caratteristiche di sensibilità e specificità dei saggi immunoenzimatici sono
influenzate dal tipo di antigeni impiegati ed inunobilizzati alla fase solida oltre che dalle
condizioni di standardizzazione delle concentrazioni dei singoli reagenti e dai tempi e
dalle temperature utilizzate nello sviluppo della reazione. La scelta del tipo di antigene
coinvolge il sistema di produzione (sintesi diretta o espressione in cellule procariotiche o
eucariotiche) e fattori legati al virus. quali, la porzione genomica viraJe da cui l'antigene è
dedotto, la funzione del suo prodotto di espressione durante il ciclo replicativo virate e la
capacità di indurre anticorpi circolanti_
I progressi ottenuti con un ritmo molto rapido negli ultimi tre anni e che hanno
portato al passaggio dai saggi di I generazione ai saggi di II e III generazione, con un
notevole miglioramento delle possibilità diagnostiche nell'infezione da HCV, sono
pertanto avvenuti in stretta dipendenza dal progresso delle conoscenze sulla sequenza e
struttura del genoma virale e delle proteine codificate, sul loro significato biologico e
suUe caratteristiche immunogeniche oltre che sul tipo di anticorpi prodotti e sulla loro
persistenza nelle principali fasi dell'infezione e nelle diverse categorie cliniche_
I saggi di Il e III generaziooe liOilO risultati in grado di rilevare, nella maggior parte
dei casi di infezione da HCV la presenza di anticorpi Specifici. Permane tuttavia una
percentuale di casi non definiti, in alcuni studi valutata intorno al l 00/o con i saggi di II
generazione, ed un intervallo variabile di tempo successivo alla fase acuta dell'infezione
in cui tali anticorpi non sono rilevabili. Non sono disponibili saggi in grado dì
(
;
19
differenziare la fase acuta dalla fase cronica ed un considerevole numero di reazioni
falsamente poflitive si verifica particolarmente nei sieri di popolazioni a bassa prevalenza
di infezione.
Vari fattori possono influenzare la sensibilità dei saggi di screening. I recenti studi
sulla variabilità genetica deU'HCV hanno evidenziato le sue implicazioni non solo dal
punto di vista biologico e patogenico ma anche nel campo deUe diagnosi.
L'eterogeneità genetica deii'HCV è stata messa in evidenza non appena sono stati
disponibili i dati deUe sequenze ottenute da differenti isolati. anche proverùenti dalla
stessa area geografica. E' ormai noto che la popolazione virate è presente neJrospite con
una distribuzione di tipo "quasispecie", cioè di una popolazione di RNA correlati intorno
ad una sequenza dominante. L'analisi sulrintera sequenza del genoma di isolati diversi ha
permesso la classificazione in due genotipi ciascuno suddiviso in due subtipi (l/la, Ulb,
II/2a, II/2b) e l'analisi di sequenze parziali nelle porzioni genomiche 5'NC, Core, NS l ed
NSS di isolati da varie parti del mondo, ha permesso provvisorie classificazioni che
includono fino a 9 genotipi e differenti subtipi (l).
L'eterogeneità è variabile nelle differenti porzioni genomiche e le percentuali più
elevate di omologia sono state osservate neUa regione 5'NC (92%) Core (81%) ed NS3
(70"/o) mentre per le altre regioni sono stati osservati valori dal 55% (El) al 65% (E2,
NS4) e 66% (NS5) (2). Questi dati sono aUa base della scarsa sensibilità osservata con i
saggi ELISA di I generazione in cui erano esclusivamente presenti antigeni
corrispondenti alla regione NS4 del subtipo la. La percentuale di reattività per l'antigene
Cl00-3 (corrispondente alla regione NS4) è risultata essere del90"/o nei sieri di donatori
infetti con l'HCV tipo I e solo del 30% e 34% nei donatori infetti con HCV tipo II e tipo
lii (3). Anche la reattività per l'antigene C33, corrispondente alla regione NS3 e presente
nei saggi ELISA di II generazione.. è risultata significativamente più bassa per l'HCV di
tipo III rispetto al tipo L Valori di maggiore concordanza sono stati osservati. nell'ambito
di sieri ottenuti da individui infetti con i tre genotipi. per quanto riguarda la reattività nei
confronti di C22, corrispondente alla regione del Core. Questa regione presenta infatti la
maggiore percentuale di conservazione della sequenza aminoacidica (90%).
Tuttavia i dati reali di quanto i saggi ELISA di II e lii generazione che includono
C 100-3, CJJ e C22 siano efficienti nel rilevamento delle positività di anti HCV,
susseguentemente ad infezione da genotipi di HCV differenti dal tipo I e soprattutto danuovi subtipi. non sono attualmente definiti.
20
Un altro fattore di fondamentale importanza per l'efficienza dei saggi di screening è
dato dal tempo di comparsa. dopo l'infezione, di vari anticorpi attualmente rilevabili. l
dati degli studi effettuati in scimpanzé hanno mostrato che tale periodo è dilazionato, con
l'impiego di saggi di Il generazione, fino a 18 settimane dall'inoculazione, per gli
anticorpi anti CI00-3 e fino a 15 settimane per gli anticorpi anti C33 ed anti Core (4). In
ogni caso in tempi di comparsa dei vari marcatori incluso I'HCV-RNA sono variabili nei
vari scimpanzè inoculati, anche se generalmente la comparsa dianti CI00-3 è più tardiva
I dati sui campioni sierologici seriati, in casi di infezione acuta nell'uomo,
confermano la presenza di una notevole variabilità, anche per quanto concerne la
persistenza nel tempo e l'entità della risposta anticorpale. Studi prospettici effettuati su
pazienti di epatite post-trasfusionale hanno indicato che gli anticorpi verso la proteina di
fusione CI00-3 compaiono dopo parecchie settimane (da 5 a 50 settimane), dall'inizio
della fase acuta (5) e persistono durante la fase cronica, riflettendo probabilmente la
replicazione virale.
Studi effettuati con oligopeptidi sintetici hanno fatto rilevare l 1esistenza di epitopi
immunodomina.nti presenti sia nel dominio
C-tenninale che nella regione S-1-1, il
frammento di 42 aminoacidi, della CI00-3 (6) utilizzato nel saggio di l generazione. Tale
saggio si è dimostrato utile nello stabilire il ruolo predominante dell'HCV all'interno delle
epatiti non-A,non-B e la sua persistenza ad elevati livelli di OD è probabilmente di
significato prognostico, tuttavia studi successivi hanno messo in evidenza una sensibilità
e specificità insufficienti per la sua utilizzazjone, come antigene isolato, nei saggi di
screening (7). l saggi di n generazione che includevano antigeni derivati dalla proteina
capsidica, espressa come proteina di fusione, e dalla regione non-strutturale NS3 sono
risultati più sensibili. La comparsa di anticorpi anti-NS3 (C33) e anti-Core avviene
significativamente prima degli anticorpi anti-NS4 (CI00-3) (8). La presenza di tali
llll.igeni è pertanto indispensabile nel rilevamento delle infezioni acute. Inoltre gli
anticorpi verso il Core possono anche essere gli unici marlrers sierologici d1esposizione
ali'HCV a persistere per parecchi anni dopo la guarigione.
Differenze sono state dimostrate in relazione allo stato di immunooompetenza dei
pazienti. Infatti nei soggetti parzialmente imnwnodepressi (dializzati, ernofilici, neonati)
lo spettro anticorpale risulta più frequentemente incomPleto particolarmente per quanto
concerne la presenza di anticorpi anti CI00-3 (9).
Queste osservazioni trovano riscontro nel11esame dei sieri di una popolazione
aperta per quanto concerne la presenza deUe singole reattività anti HCV. In un campione
(
21
di 500 sieri di popolazione a rischia con un valore globale di prevalenza del 25% la
presenza relativa degli anticorpi è stata osservata per quanto concerne anti Core nel 94%
dei casi positivi, anti NS3 riel93%, anti NS4 nel 75%, anti El nel44%, anti E2/NSI nel
38% ed anti NS5 nel 69% (l 0).
In base a tutti questi dati risulta indispensabile ai fini della sensibilità del
rilevamento la contemporanea presenza di differenti antigeni virati. Peptidi specifici
corrispondenti ad epitopi variati potrebbero essere inclusi nei saggi per l'identificazione
delle reattività correlate a differenti genotipi virali. Fondamentale importanza rivestono
inoltre gli studi rivolti all'identificazione di antigeni contenenti epitopi significativi e di
sistemi di espressione adatti al mantenimento delle loro caratteristiche confonnazionalL
Studi immunologici hanno dimostrato la presenza di due epitopi principali nella
porzione N-terminale della proteina del Core (porzioni 5-23 e 39-74) e probabilmente di
un epitopo minore vicino alla sua porzione C-tenninale (Il). L'uso di peptidi sintetici
corrispondenti alle regioni immunodominanti N-terminali pennette il rilevamento di
anticorpi e porta ad un miglioramento nella sierodiagnosi della infezione da HCV (12).
Studi ulteriori sono necessari per stabilire il significato degli anticorpi prodotti contro le
proteine dell'envelope E l ed E2. Infatti i risultati di immunoreattività dei sieri infetti nei
confronti delle proteine envelope prodotte in vari sistemi di espressione risultano
variabili. L'espressione della proteina E l in baculovirus ha permesso, in un primo lavoro
di rilevare la presenza di anticorpi anti-El in una percentuale di pazienti cronici compresa
tra il 2% e il 17%. Tuttavia in uno studio successivo, anticorpi anti-E2, espressa in
baculovirus, sono stati rilevati nel 28% dei pazienti cronici. Analogamente la proteina E2
espressa in baculovirus ha dato valori di positività per gli anticorpi anti-E2 compresi tra il
13.4% e il 28% dei pazienti cronici, in un primo studio (13) e del 92% in uno studio
successivo (14). L'espressione delle proteine El ed E2 come proteine di fusione nel
lievito, ha pennesso di rilevare una immunoreattività nei sieri di pazienti cronici pari
rispettivamente al 61 o/o e 58%. L'espressione delle stesse proteine in "vaccini a virus",
quindi in una fanna glicosilata più vicina alla forma nativa, ha consentito di ottenere una
positività maggiore, pari al 97% nei soggetti cronici (15). L'utilizzazione di due peptidi
sintetici PI e P2 corrispondenti alle regioni 210-223 e 315-327 della proteina El ha
messo in evidenza la presenza di anticorpi anti-PI nel 44.7% nei pazienti e anti-P2 nel
92.1% di una popolazione di donatori (16).
22
I risultati ottenuti sembrano quindi indicare che la reattività immune nei confronti
delle proteine dell'envelope risulta variabile e dipendente dalla popolazione clinica
testata, dall'area geografica esaminata oltre che dal sistema di espressione utilizzato per
produrre l'antigene ricombinante.
Tutte le considerazioni sopra esposte valgono anche per i saggi supplementari
attualmente impiegati per conferma della positività,
basati su metodologie di
immunohlolling in membrane di nitrocellulosa, che pennettono di evidenziare le singole
reattività in forma isolata. Anche per questo tipo di metodiche sono stati allestiti saggi di
Hl generazione in cui oltre all'aggiunta dell'antigene relativo alla regione NS5 sono statr
riformulate le composiziorll degli antigeni C22 e C33. Il saggio, poichè include gli stessi
antigeni dei saggi di screening, prodotti con differenti metodologie, può essere
considerato supplementare piuttosto che di conferma, costituisce tuttavia allo stato
attuale un importante strumento dii\gnOstico.
La Tab. l riporta i principali saggi attualmente in uso in Italia, la natura e posizione
genomica relativa degli antigeni presenti, il tipo di coniugato e substrato impiegati nella
reazione.
Una serie di studi sono stati effettuati per confrontare i risuJtati ottenuti nello
screening di differenti popolazioni con l'impiego di saggi di l, Jl e Ill generazione anche
in rapporto alla capacità risolutiva del saggio addizionale RIBA e del saggio di
rilevamento, mediante PCR, dell'HCV -RNA. Quest'ultimo saggio sebbene sia basato sul
rilevamento di un marcatore virale anziché anticorpale costituisce al momento l'unico
riferimento nei casi in cui si osservi un pattern anticorpale "indeterminato" grazie alle
caratteristiche di elevata sensibilità ottenute con l'impiego di primers relativi alla regione
altamente conservata 5'NC. Può, pertanto, essere utilizzato in aggiunta ai saggi di
screening anche in considerazione del fatto che )•infezione da HCV ha un elevatissimo
tasso di persistenza e che solo il 200/e degli individui mostra successivamente all'infezione
scomparsa di HCV-RNA. Il rilevamento della viremia è necessario negli individui con
risultati positivi o con risultati indeterminati aJ RIBA
La Tab. 2 riporta lo schema di utilizzazione di questo marcatore allo stato attuale,
in cui il non completo livello di standardizzazione dei saggi di PCR ne limita l'uso a
livello di laboratori con elevato livello di specializzazione.. ·'
l
}
23
I dati di valutazione della III generazione dei saggi di rilevamento di anti-HCV
anche in rapporto alla positività per HCV-RNA hanno messo in evidenza un'incremento
della sensibilità principalfllente legata alla migliore risposta nei confronti dell'antigene
C33 (rifonnulato) particolannente in relazione alla maggiore sensibilità a livello del
rilevamento nella fase precoce dell'infezione e nelle popolazioni di soggetti con
immunodepressione. E' stato inoltre osservato un notevole miglioramento per ciò che
concerne le caratteristiche di specificità. legato al rilevamento della C22 (riformulata).
L'inclusione dell'antigene relativo alla regione NS5 non sembra avere influenza nelle
migliorate condizioni di sensibilità in considerazione della scarsa evenienza e della
probabile aspecificità della presenza di anti NS5 in fanna isolata.
Si può sottolineare, in conclusione, che anche se l'inclusione di antigeni relativi alle
quattro regioni genomiche NSJ, NS4, NS5 e Core è una condizione essenziale per una
migliorata efficienza dei saggi, rimane tuttavia aperta la strada per la valutazione di saggi
di IV generazione in cui vengono ulterionnente prese in considerazione la presentazione
di epitopi immunogenici degli antigeni utilizzati (e quindi il relativo sistema di
produzione) e la perdita di sensibilità legata all'infezione con i genotipi 3,4,5 e gli altri
genotipi di recente o futura identificazione.
'
r
,, ......
•
OiagnostiC1 Pa!teur
Francia
UBIN.Y.USA
·Mure~~:
Gran Bretagna
lnnogenetics
Belgio
Mooolisa antiHCV
UBIHCVEIA
Mure,; antiHCV
VK47/48
Jnnotest
HCV Ab 111
newanti~es
HC34
Abbott l .L. USA
Abbon HCV EIA 3.0
HCCLI9B
NSS-25-27·31
NS4-1-5·7
ricombiname (E. col1)
.
.
ptptide sintetieo
Core2-6·10
sintetico
pq~tide
..
ricombinante
(baculovirus)
.
prpridilsintetioo
ricombinante (E. coli)
ricombinante (lievito)
rieombinante(E. col!)
.
.
.
..
.
..
.
riCQmbinante (lievito)
AC90
AC91
AC'> l
BHC2Q
494g
'""
JJO(Mh
JK243t
C36
NSJ.I
5.1.1
NC4l0
NSl
CI00-3
HC43
C22-3
ClOO
NSS
NSl
NSl
NS4
Co~
NS4
NS4
NS4
CoWEJ
NSS+
NSJ+
NSl
"""
NS3
NS4
NSl
NS4
NS3
"""
NSl
Core-NS3
NS3·NS4
c~
"""
NSS
NSl-NS4
policlonaJe capra
{perossidasi)
monoc:lonalr murino
(perossidui)
polidonale capn
(pero!Sidasi)
policlonale capta
(perossidasi)
polk:lbnale capra
(perossidasi)
monocll'llll.ie murino
(perossidasi)
TMB
TMB
OPD
OPD
OPD
OPD
,,.
ISO
120
45-60
IlO
120
-~
.
Antlpnl prrRnll
Siero antiii:G. amane Snbstrato
Darata drl
DenomiRazJone Shtema di produzione Retionr pnomka
(canlupto)
sagrlo (minuti)
Ortho Diagnodics
N.J. USA
Ditta prodnttrin
Ol1ho HCV 3.0
ELISA test sy!tem
Dntominnlone
Tabe-lla 1
SAGGI ELISA. PER IL RILEVAMENTO DI ANTl HCV: 111 GENERAZIONE
NCx +OJ
NCx +0.600
0.15 PCx
0.25 PC,;
NCx + (0.25) PCx
NCx +0.300
NCx +0.600
Valore di cut-tlff
"'...
or.--
25
Tabella 2. Utilizzazione diagnostica del rilevamento di HCV-RNA con metodo PCR
Differenziazione dei casi di risoluzione dell'infezione rispetto a quelli con
evoluzione cronica ·
diagnosi di infezione acuta nella fase precoce
rilevamento dell'infettività nei pazienti anti-HCV positivi
risoluzione dei casi con risultato "indetenninato" al saggio RIBA
diagnosi dei casi di infezione verticale
diagnosi di infezione nei pazienti con immunodepressione
monitoraggio dei trattamenti antivirali.
Bibliografia
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r
}
27
IMPORTANZA DELLA QUANTIZZAZIONE ED ANAUSI DINAMICA.
Femaccio Donino
Dipartimento Sperimentale di Gastroenterologia, Patologia Epatica, Ospedale Molinette,
Corso Bramante 88, Torino
L'introduzione nella pratica clinica delle metodiche di biologia molecolare e
l'affinamento delle tecniche immunometriche ha drasticamente modificato la sensibilità e
specificità diagnostica. La possibilità di evidenziare quantità infinitesimali di acido
nucleico virale con un limite di sensibilità compreso tra alcune e l 000 molecole ha
cambiato radicalmente il significato clinico delle detenninazioni dei parametri virologici
(l, 2). Come in batteriologia la 'capsula di Petri" permette l'amplificazione in
vitro
dei
singoli batteri in altrettante colonie, in virologia la metodica della PCR permette di
amplificare pochi genomi in milioni di copie. Come conseguenza, la positività di un
semplice test qualitativo ha scarso valore diagnostico in quanto poche unita' di acido
nucleico virale non implicano di fatto la presenza di un infezione attiva ne' di una malattia
indotta dal virus (3). In batteriologia si sono da tempo definiti per ciascun batterio i livelli
di batteriuria e batteriernia che definiscono la sterilità, perciò la parola "sterile" non
significa assenza assoluta di batteri. ma la loro presenza in numero clinicamente
insignificante. L'introduzione di tale concetto anche in virologia è oggi indispensabile.
Tuttavia sarà molto difficile definire i livelli clinicamente significativi delle viremie per
una serie di ragioni biologiche impananti. D primo problema è dovuto alla mancanza di
una diretta corrispondenza tra numero di molecole di acido nucleico amplificato e i
virioni potenzialmente infettanti. La presenza di un acido nucleico non identifica
necessariamente un virione completo. Infatti. possono esistere acidi nucleici liberi non
incapsulati nel virione. mutati o presenti in particelle virali difettive. Per i batteri invece.
in quanto ad ogni batterio corrisponde nella "capsula di Petri" una colonia che
rappresenta la sua progenie. Un altro problema è che la patologia virale è secondaria al
28
critico equilibrio tra presenza e replicazione virale, da un lato, e tipo ed entità di risposta
immune antivirale, dall'altro. Il virus dell'epatite B ad esempio può replicare indisturbato
per anni determinando livelli altissimi di viremia senza causare alcun danno epatico. Nello
stesso soggetto la condizione di tolleranza immunologica può però interrompersi
bruscamente per una mutazione virale o della reattività del sistema immune e la reazione
immunitaria può causare come conseguenza un'epatite acuta eliminando il virus o
un'epatite cronica con persistenza del virus (in quantità molto ridotte) e del danno
epatico. L'equilibrio tra entità e tipo di replicazione virale e entità e tipo di risposta
immune condizionano perciò fortemente lo stato e l'evoluzione del processo infettivo e
della malattia virus indotta. Ne consegue che la misura di questo equilibrio possa avere
una grande importanza diagnostica e prognostica, molto superiori alla semplice
determinazione qualitativa dei parametri virologici. In un soggetto con infezione da HCV
identificata mediante test sierologicì di screening la sola determinazione qualitativa
deli'HCV-RNA e degli anticorpi antivirali con metodiche di immunoh/otting non
aggiunge informazioni diagnostiche rilevanti. Studi epidemiologici indicano, in indagini
popolazionistiche, che la presenza di acido nucleico virale nel siero è significativamente
più frequente nei pazienti con danno epatico piuttosto che nei soggetti sieropo'sitivi con
infezione pregressa e fegato normale. Tuttavia, anche se in casi rari, la viremia può essere
riscontrata in individui con fegato istologicamente sano (4) Inoltre i livelli di viremia
possono fluttuare ampiamente e risultare temporaneamente indeterminabili in molti
pazienti con epatite cronica. Infine circa un terzo dei pazienti che guariscono dall'epatite
cronica e mantengono il fegato istologicamente normale rimangono per anni viremici
L'analisi quantitativa dei livelli di viremia, delle transaminasi e degli anticorpi antivirali ha
rivelato che anche nell'infezione da HCV le oscillazioni dei tre suddetti parametri sono
sincrone. Ad un significativo aumento dei livelli di viremia fa seguito un incremento degli
indici di citolisi e successivamente un innalzamento del titolo di alcuni anticorpi antivirali
(5). I picchi sierici di ciascuna delle tre variazioni si susseguono sincronizzati con
intervalli di circa 3-6 settimane. L'identificazione di questa sequenza di eventi è molto
utile per la specifica definizione eziologica di un episodio occasionale di citolisi epatica
~----
;
29
soprattutto nei pazienti con danno epatico multifattoriale e con infezione virale multipla.
Infatti la semplice associazione tra presenza di indici qualitativi di replicazione e di danno
epatico non definisce con sufficiente accuratezza diagnostica la relazione causale tra i
due eventi. Quest'ultima è invece stabilita con precisione se si evidenzia un preciso
sincronismo tra le fluttuazioni di livelli di viremia e delle transaminasi. Qualora un
paziente arrivi all'osservazione durante un episodio di citolisi la misura della variazione
sincrona della viremia non sarà più possibile perché questa precede l'evento citolitico
però
la
stessa
specificità
diagnostica
può
essere
raggiunta
determinando
quantitativamente la variazione del livello sierico di un anticorpo antivirale che avviene
successivamente all'episodio di elevazione delle transaminasi (6, 7). L'uso di questi
concetti diagnostici quantitativi e dinamici ha utilissime implicazioni nel monitoraggio dei
pazienti soprattutto se sottoposti a terapia antivirale. La considerazione che la
fluttuazione dei livelli sierici delle transaminasi è sincronizzata con quella della viremia
dimostra l'inutilità della misura ripetuta della virernia e permette perciò una riduzione
notevole del costo del monitoraggio evitando test
costosi che non aggiungono
conoscenze cliniche utili alla semplice periodica misura del livello sierico delle
transaminasi. La presenza di un valore normale delle transaminasi al termine della terapia
non predice se il paziente manterrà la risposta o presenterà una recidiva. Solo il
mantenimento di valori normali delle transaminasi per oltre sei mesi dopo la sospensione
della terapia predice con sufficiente accuratezza la guarigione. Molti autori ritengono che
la determinazione qualitativa della viremia permetta una migliore predizione,
sfortunatamente ciò si rivela inutile nella pratica clinica in quanto valori indeterminabili di
viremia al temùne della terapia non escludono una recidiva e come abbiamo detto sopra
circa un terzo dei pazienti guarisce nonostante la persistenza di viremia (anche per anni)
dopo la sospensione della terapia. Invece, la misura quantitativa della viremia non
aggiunge molto per le stesse ragioni. La misura dei livelli sierici degli anticorpi antivirali
(anti-Core totale, anti-E2 ed anti-CIOO) presenti all'inizio della terapia e ogni 4-6 mesi
in grado di
fo~re
e
un utilissimo indice dell'evoluzione dell'infezione e della malattia (8).
La persistenza di replicazione virale e di citolisi anche con temPoranee e brevi
30
normalizzazioni non si associa ad una significativa caduta dei livelli anticorpali. Il titolo
anticorpale cala significativamente solo nei soggetti che mantengono persistentemente
livelli indeterminabili di viremia e transaminasi normali. La misura quantitativa della
risposta anticorpale ne1 pazienti immunocompetenti utilizzando sempre la stessa
metodica (di comprovata riproducibilità) per ciascun paziente è perciò un mezzo di
grande utilità nel monitoraggio dell'infezione e dell'epatite cronica C sia durante che dopo
la terapia (8).
Va tenuto conto che sia per i livelli di viremia che degli anticorpi
dovranno essere definiti range di valori quantitativi abbastanza ampi e non veri e propri
cut-off. Vequilibrio tra replicazione virale e risposta immune è infatti
diversa da
soggetto a soggetto e ciò che più conta ai tini diagnostici sono le variazioni nel tempo
per lo stesso soggetto e non i valori assoluti riscontrati occasionalmente. La qualità
principale dei test diagnostici futuri dovrà perciò essere la riproducibilità e il compito del
medico sarà quello di accertarsi che ogni paziente venga sempre monitorizzato con la
stessa metodica.
L'introduzione di questi concetti nella diagnostica clinica permette anche di
spiegare molte discrepanze e discussioni presenti nella letteratura specialistica. Ad
esempio è molto importante tenere conto che viremia e livelli delle transaminasi oscillano
con periodicità mensili, mentre il titolo anticorpale e l'entità del danno infiammatorio
intraepatico variano in modo significativo su base semestrale e annuale rispettivamente.
In base a queste considerazioni non è difficile trovare pazienti con danno epatico
evolutivo nonostante abbiano transaminasi occasionalmente normali. Studi prospettici
hanno dimostrato che solo la determinazione mensile (per almeno 12 mesi consecutivi)
delle transaminasi può escludere con sufficiente certezza un'epatite cronica alla biopsia
epatica. Periodicità più lunghe o monitoraggi di durata più breve non escludono
un'epatite cronica anche in presenza di transaminasi normali.
Nel caso di un singolo
individuo con transaminasi normali la determinazione della viremia non costituisce un
criterio decisionale valido per la biopsia epatica. Infatti, seguendo il semplice criterio
della positività o negatività della viremia rischieremmo nel primo caso di eseguire la
biopsia in soggetti che mantengono bassi livelli di replicazione virale pur essendo guariti
f
}
31
dall'epatite C e avendo un fegato nonnale; nell'altro caso, rischieremmo di non eseguire
la biopsia epatica in un paziente con epatite cronica evolutiva e fluttuazione temporanea
della viremia al di sotto della soglia di determinazione. L'indicazione alla biopsia è invece
posta più specificamente dalla presenza. di una elevazione delle transarninasi (anche
occasionale) e/o dalla persistenza (oltre 6 mesi) di titoli elevati di anticorpi anti-HCV
(come detto sopra). Invece, la persistente normalità dei valori delle transaminasi ben al
di sotto dei limiti della nonna in controJii mensili consecutivi per almeno 12 mesi può
evitare la biopsia epatica con sufficiente specificità diagnostica
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l
33
DETERMINAZIONE DEI GENOTIPI DELL'MCV: ASPETTI DIAGNOSTICI
ED INTERESSE CLINICO
Elisabetta C ariani l, Antonella Ravaggi l, Angelo Rossini2
l lll Laboratorio Analisi, Ospedale di Brescia e Istituto di Chimica, Università di Brescia,
Pie Spedali Civili, l, 25123 Brescia
ZnJ Divisione di Medicina Generale, Ospedale di Brescia, P le Spedali Civili, l, 25123
Brescia
La percentuale di mutazioni del genoma dell'HCV, calcolata intorno a
w-3
sostituzioni nucleotidiche per sito per anno (l), è simile a quella degli altri virus a RNA a
polarità positiva. La notevole variabilità genomica. legata all'assenza di attività
proojreading da parte deii'RNA polimerasi RNA-dipendente (2), ha potenziali
implicazioni per il decorso clinico dell'infezione. L'analisi delle sequenze virali isolate da
un singolo paziente ha permesso di osservare che il genoma dell'HCV presenta un
elevato grado di eterogeneità, sia all'interno dello stesso prelievo che tra prelievi diversi.
[noltre l'analisi comparativa di isolati indipendenti ha indicato l'esistenza di vari genotipi
virati, alcuni dei quali con distribuzione geografica caratteristica.
Entrambi gli aspetti dell'eterogeneità genomica deli'HCV (variabilità in un singolo
paziente e variabilità genotipica tra gruppi di isolati) si accompagnano ad una diversa
percentuale dì mutazioni a livello delle singole regioni genomiche. Infatti, i geni
codificanti per le proteine dell'enveJope (El ed E2), analogamente a quanto
e stato
descritto in altri virus, presentano una percentuale molto elevata di mutazioni. Questo
potrebbe essere dovuto al fatto che le proteine dell'envelope, essendo esposte alla
superficie del virione, sono uno dei bersagli principali del sistema immunitario deJI' ospite
e vengono perciò sottoposte ad una pressione selettiva che privilegia i mutanti non
riconosciuti dalla reazione immune. Altre regioni del genoma virate hanno invece una
sequenza più conservata. come la sequenza della regione non tradotta in 5' (5' UTR),
34
coinvolta nel controllo della traduzione, o le sequenze codificanti per la proteina del
nucleocapside (Core) e per la proteina NSJ (proteasi-elicasi) (Fig. l)
Classificazione dei genotipi dell'DCV
In base alle divergenze di sequenza che, in alcune regioni genomiche, permettono
di definire sottogruppi virali, sono stati identificati diversi genotipi di HCV. Sono state
proposte varie classificazioni dei genotipi virali (3-7); le più frequentemente utilizzate
sono riassunte in tabella l. I due primi genotipi identificati (definiti tipo I e tipo II da
Okamoto et al.) furono originariamente isolati rispettivamente negli Stati Uniti ed in
Giappone. In seguito, questi due tipi virali si sono dimostrati endemici anche in Europa,
anche se non omogeneamente distribuiti nelle diverse aree geegrafìche. Altri genotipi
sono stati completamente sequenziati (tipi III e IV secondo Okamoto et al.) o
parzialmente caratterizzati. Attualmente si considera che esistano almeno 6 grupp1
principali di HCV (genotipi 1-6 secondo Simmonds et al.), ciascuno dei quali comprende
diversi sottotipi (indicati con lettere minuscole). I genotipi 1, 2 e 3 sembrano essere
ubiquitari, con diversa prevalenza nelle popolazioni studiate (6, 8). Il genotipo 4 è
soprattutto frequente in Afiica ed in Medio Oriente, mentre il genotipo 5 è stato
identificato in Sud Africa e il g~ottpo 6 a Hong Kong (6).
Possibili implicazioni della variabilità genotipica deii'HCV
Una possibile implicazione della variabilità tipo-specifica delle proteine di
superficie è l'esistenza di determinanti sierotipici, soprattutto nella proteina El (3).
Questo potrebbe essere rilevante per lo sviluppo di protocolli di immunizzazione, dato
che le proteine di
su~cie
sono i maggiori candidati per i vaccini contro I'HCV (12) e
dato che i genotipi deii'HCV presentano una specifica distribuzione geografica.
Poiché l'infezione con alcuni genotipi sembra essere correlata ad un particolare
decorso clinico e a diversa sensibilità al trattamento antivirale (9-11 ), la detenninazione
del genotipo infettante potrebbe rivelarsi clinicamente utile. La presenza di variazioni di
sequenza tipo-specifiche può essere utilizzata dal punto di vista diagnostico. I metodi
f
35
finora proposti per l'identificazione del genotipo si basano su polimorfismi di restrizione
(13, 14), PCR con primers specifici per i vari genotipi (15) ed ibridazione con sonde
genotipo-specifiche (13, 1-4, 16, 17). Le regioni più frequentemente utilizzate per la
caratterizzazione del genotipo sono la 5'UTR ed i geni C, NSJ ed NS5.
In base ai risultati di sequenza ottenuti su isolati italiani di HCV, abbiamo
sviluppato due test basati sulla PCR tres/ed e l'ibridazione differenziaJe per
l'identificazione dei principali genotipi (l, 4) e sottotipi (Ula e IUlb). L'amplificazione
viene effettuata, nel primo caso, con gli stessi primer della S'UTR utilizzati per la
deternùnazione deii'HCV RNA. Il secondo test si basa sullo stesso principio e viene
effettuato con primers e sonde situati nel gene E l ( 18). I prodotti di amplificazione
vengono quindi ibridizzati mediante una metodica non isotopica, utilizzando sonde
derivate dai segmenti contenenti variazioni genotipo- e sottotipo-specifiche. Questo
approccio è stato scelto in quanto le sequenze pubblicate, insieme ai nostri dati,
indicavano la presenza di zone variabili genotipo-specifiche nella 5'UTR (19, 20) e
sottotipo-specifiche nella regione El (7, 9, 21-23). Le variazioni del gene El consentono
in particolare l'identificazione dei sottotipi la ed Ib, che sono i più frequenti in Europa
(13, 14, 16) e non sono facilmente discrinùnabili in base alla sequenza di altre regioni
genomiche, come la 5'UTR (5, 14, 16, 20, 24). In entrambi i test è stata osservata una
perfetta riproducibilit• tra i risultati dell'ibridazione differenziale e i dati di sequenza.
Epidemiologia e correluioni cliniche dei genotipi dell'HCV
Mediante l'applicazione dei metodi sopra esposti è stato possibile definire la
distribuzione epidemiologica ed alcune possibili correlazioni cliniche dell'infezione con i
diversi genotipi dell'HCV.
Sano stati analizzati fino ad ora 116 soggetti con infezione da HCV sintomatica e
non. Il genotipo l è stato identificato in 88 casi (76% ), con prevalenza del sottotipo 1b
(62 casi) rispetto all'la (20 casi). Le infezioni miste dovute ad entrambi i sottotipi sono
state evidenziate in 6 campioni, mentre il genotipo 2 era presente in 20 casi ( 17% ), il
genotipo 3 in 5 (4%) e il genotipo 4 in 3 (3%). Pertanto, i genotipi l e 2 sono i più
36
diffusi, essendo responsabili del 95% delle infezioni da HCV. Il sottotipo lb, m
particolare, risulta prevalente nella popolazione studiata {53.4% del totale), in analogia
con quanto riscontrato in Giappone (13, 14, 16).
Dati precedenti indicano l'esistenza di una diversa sensibilità al trattamento
antivirale dei genotipi lb e 2 {10, I 1). Il primo sarebbe infatti associato ad una bassa
percentuale di risposta, mentre il genotipo 2 sarebbe più sensibile al trattamento. Anche
la presentazione clinica dell'infezione potrebbe essere influenzata dal genotipo infettante.
Infatti, in un gruppo di donatori -di sangue anti-HCV e HCV RNA positivi con livelli di
transaminasi persistentemente normali abbiamo rilevato una prevalenza del genotipo 2
significativamente maggiore rispetto ad un gruppo .di soggetti con transaminasi elevate. I
vari genotipi non sembrano però avere diversi livelli di replicazione.
n titolo di viremia,
analizzato mediante PCR competitiva in 86 campioni (38 infettati da sottotipo lb, 18 da
sottotipo l a, 4 da entrambi i sottotipi, 20 da genotipo 2, 5 da genotipo 3 e 2 da genotipo
4), ha permesso di osservare concentrazioni di HCV RNA compatibili con dati
precedenti (Il, 25), comprese tra Jo4.5 e JQ9.6 copie/m!. Non è stata tuttavia osservata
nessuna variazione significativa tra campioni di soggetti infettati dai genotipi la, Ib, 2 e
3, come già riportato in altri studi (26).
Caratterizzazione genomica di isolati appartenenti ai vari genotipi
Per un approfondimento delle possibili basi genetiche dell'infezione dovuta ai vari
genotipi, la sequenza nucleotidica ed arninoacidica dei genotipi 1-4 è stata caratterizzata
a livello delle regiorù C ed El. La sequenza di diversi isolati è stata comparata e le
percentuali di omologia hanno permesso di ottenere infol111llZioni sulla relazione genetica
tra i vari ceppi di HCV.
Nella regione Core l'allineamento di sequenza aminoacidica ha permesso di
osservare una maggiore omologia tra i genotipi l e 4, mentre il genotipo 3 e, soprattutto,
il genotipo 2 si sono rivelati molto più divergenti.
f:-' omologia
a livello aminoacidico
presente all'interno di ciascun genotipo era maggiore dCI 95%, mentre, tra il genotipo 2 e
gli altri genotipi, era pari al 77%.
(
}
37
Nonostante la maggiore percentuale di variabilità (omologia del 75-90% aU'intemo
di un genotipo e del 41)..80% tra diversi genotipi a livello aminoacidico), il grado di
relazione genetica tra geriotipi nella proteina E I è risultata sovrapponibile a quello della
proteina C. L'analisi di sequenza di due regioni codificanti (C ed El) ha pertanto
dimostrato un grado di divergenza particolarmente elevato tra il genotipo 2 e gli altri
genotipi considerati, in accordo con quanto descritto su isolati provenienti da altre aree
geografiche (6, 7). E' interessante notare come, in entrambe le regioni analizzate, la
maggiore divergenza di sequenza sia osservata tra i genotipi l e
2.
che, in base ai risultati
precedentemente esposti, sembrano essere associati a diversi profili di transaminasemia e
a differente risposta al trattamento. Non è però noto se la diversa presentazione clinica
sia legata ad una maggiore o minore evolutività dell'infezione.
Utilità clinica della determinazione del genotipo virate nell'infezione da HCV
I dati attuahnente disponibili indicano l'esistenza di differenze nel profilo clinico e
nella sensibilità al trattamento dell'infezione dovuta a genotipi diversi. Tuttavia.. il reale
significato clinico della determinazione del genotipo virate è tuttora in discussione, in
quanto sia le manifestazioni cliniche della malattia epatica, sia la eventuale risposta alla
terapia sono influenzate da molteplici fattori, quali l'età del soggetto, la durata
dell'infezione e lo stato immunitario, che interagiscono in modo complesso. Un nostro
studio (14) ha indicato una particolare distribuzione epidemiologica dei sottotipi la ed
l h: il sottotipo l h è infatti generalmente isolato da pazienti di età più avanzata. Il fattore
età potrebbe quindi influire sulla minore percentuale di risposta al trattamento dei
soggetti infettati dal sottotipo l b. Va inoltre sottolineato che, nella maggior parte degli
studi pubblicati, la risposta alla terapia è stata valutata in base alla normalizzazione della
transaminasemia; l'apparente sensibilità al trattamento deii'HCV di tipo 2 (11, 25)
potrebbe essere in parte legata ai valori persistentemente nonnali di transaminasi
riscontrati
nella
maggior
parte
dei
soggetti
infettati
da
questo
genotipo,
indipendentemente dalla terapia. Quindi, il criterio per stabilire la risposta dei soggetti
con infezione da HCV di tipo 2 dovrebbe basarsi su parametri virologici (scomparsa
38
deii'HCV RNA sierico) e non solo sui dati biochimici. Per valutare il reale impatto della
detenninazione del genotipo vira1e sulla decisione terapeutica sono pertanto necessan
studi ulteriori, che permettano una migliore conoscenza della storia naturale
dell'infezione dovuta ai vari genotipi e delf'importanza relativa dei vari fattori che
possono influenzare l'esito deJ trattamento.
Tabella 1. Principali dassifttuigai prepeste per i genotipi dell'H CV.
Classificazioni
Okamoto et al. (3) Cha et al. (5)
SUnmonds et al. (6)
Bukh et al. (7)
Mori et al.* (4)
la
l/la
llllb
Il
Il
ne
Re
Jb
le
III
IV
III
la
III/la
III
lb
IV/lb
ne
III
le
le
v•
IV
Ja
(V)/Ja
VI•
IV
Jb
ne
ne
ne
4a
4a
ne
ne
ne
4b
ne
ne
ne
4e
ne
ne
ne
4d
ne
v
~.
Sa
ne
ne
6a
6a
ne
ne: non classificato
t
.
.
'
T
57-71
NS2 l
l
7D-80
elicasi/proteasi
NS3
65-79
NS4
l
NS5
66-79
RNA polimerasi
RNA-dipendente
% di omologia nucleotidica tra i genotipi 1 e 2
ss-12
l
Il
Divergenze di sequenza tra i genotipi l e 2 dell'H CV nelle varie regioni genomiche (3, 5).
r 92-98 s1-91 55-75
Figura l
E2
glicoproteine
dell'envelope
l
(nucleocapside
J
T
eT E T
1
1
l GENOMA HCV l
.
26-671
:.
3'
"'
~
...... ~
40
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43
ASPE'ITI ISTOLOGICI DELL'EPATITE DA HCV
Luisa Bercich. Mariafausta Sonetti, Giovanna Fabbreti, Laura Lucini, Francesco Callea.
I Servizio di Anatomia Patologica Spedali Civili di Brescia.
Introduzione
Numerosi studi morfologici hanno concluso che l'epatite C non produce nel fegato
lesioni specifiche e tanto meno patognominiche.
Alcune lesioni nondimeno sono state da più parti considerate suggestive o più o meno
caratteristiche. Tra queste si annoverano: la steatosi, gli aggregati linfoidi, il danno dei
dotti biliari(!).
Studi clinici hanno dimostrato che una variabile proporzione di pazienti con epatite
cronica C risponde al trattamento con Interferone (IF). Le modificazioni istologiche
dopo IF non sono univoche.
Questo studio è stato intrapreso per valutare il significato delle principali lesioni
associate al virus C e per correlare le modificazioni istologiche con il decorso clinico
dopo terapia con IF.
Materiale dello studio
Sono stati reclutati 45 pazienti HCV positivi sulla base dei seguenti criteri:
negatività per HIV e HBV, ipertransaminasemia da almeno 6 mesi, epatite cronica
aggressiva (CAH) istologicamente dimostrata. trattamento con IF 3M per 12 mesi,
disponibilità di una biopsia epatica prima e dopo il trattamento.
l pazienti sono stati divisi in 3 gruppi sulla base della risposta aii'IF: gruppo 1
Resp<mder (R) (20 casi), gruppo 2 ~Non Resp<mder (NR) ( 17 casi), gruppo 3
Responder (PR) (8 casi).
~
=
Partia/
44
La valutazione istologìca delle biopsie epatiche è stata principalmente indirizzata a
piecemea/ necrosis, danno parenchimale, intensità della flogosi/fibrosi Questi parametri
fanno parte dello schema analitico di Knodell (2)
Parametri aggiuntivi da noi valutati sono stati: steatosi, aggregati linfoidi, danno dei dotti
biliari
Risultati
Le biopsie pre e post-trattamento sono state confrontate nei punteggi cumulativi ed
individuali dei parametri considerati e riassunti in quattro categorie miglioramento,
peggioramento, stazionario, normalizzazJone_
Per quanto riguarda lo sCore AHI totale si è avuto
Migtioram.
Peggioram
Gruppo I (20 paz.)
Stazion.
12
Normalizzaz
4
4
Gruppo 2 (17 paz.)
Il
3
3
Gruppo 3 ( 8 paz )
4
2
2
o
o
o
I parametri individuali sono risultati rispettivamente
A. Piecemeal necrosis:
Miglioram
Peggioram_
Normalizzaz_
Stazion
Gruppo l (20 paz.)
7
o
12
Gruppo 2 (17 paz.)
9
2
6
Gruppo 3 ( 8 paz )
3
2
3
o
o
8_ Danno parenchirnale:
Miglioram.
Peggioram_
Normalizzaz
Stazion
7
Gruppo l (20 paz.)
6
Gruppo 2 ( 17 paz.)
7
2
7
Gruppo 3 ( 8 paz.)
5
o
2
6
}
45
C. Flogosi portale:
Miglioram.
Peggioram.
Stazion.
Normalizzaz.
Gruppo l (20 paz.)
IO
o
IO
Gruppo 2 (17 paz.)
7
2
8
Gruppo 3 ( 8 paz.)
4
2
2
o
o
o
D. Fibrosi:
Miglioram.
Peggioram.
Stazion.
Normalizzaz.
Gruppo l (20 paz.)
2
5
6
7
Gruppo 2 ( 17 paz.)
2
2
IO
3
6
o
Gruppo 3 ( 8 p az.)
Gli altri parametri sono risultati: steatosi
presente nel 50% delle biopsie
iniziali=invariata; danno dei dotti presente nel 12% delle biopsie iniziali=invariato. Gli
aggregati linfoidi si sono comportati come segue:
Aggregati linfoidi:
Scomparsa
Comparsa de nova
Persistenza
Assenza
Gruppo l (20 paz.)
9
6
4
Gruppo 2 (17 p az.)
4
9
3
Gruppo 3 ( 8 p az.)
2
5
o
Conclusioni
I risultati di questo studio indicano che miglioramento istologico, valutato
semiquantitativamente attraverso l'AHI secondo Knodell, si è verificato in tutti i 3 gruppi
indipendentemente dalla risposta clinica.
In generale il miglioramento istologico è stato più significativo nei casi con punteggi più
alti alla prima biopsia.
46
Tra i parametri individuali, il danno parenchimale si è dimostrato il più sensibile,
specialmente nei pazienti responder (R), dei quali il 50% si è normalizzato.
In un certo numero di pazienti R con miglioramento dell'indice cumulativo di AHI
si è osservato aumento della fibrosi.
Questa osservazione giustifica recenti tentativi di scorporare gli indici necroinfiammatori
dalla fibrosi (3 ).
Tra i parametri aggiuntivi analizzati in questo studio (steatosi, danno dei dotti, aggregati
linfoidi), solo l'ultimo si è significativamente modificato dopo IF
infatti la loro
scomparsa nei pazienti responder (R) è stata del 50% rispetto al 25% dei non responder
(NR).
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)
47
STORIA NATURALE DELL'INFEZIONE DA VIRUS C
RaffAella Romeo e Massimo Colombo
Istituto di Medicina Interna Università degli Studi di Milano, Via Pace 9- 20122 Milano
Il virus dell'epatite C (HCV) è responsabile della maggioranza dei casi di epatite
trasfusionale e "sporadica". La fonte delle infezioni sporadiche è controversa poiché le vie
sessuale e perinatale sembrano solo marginalmente implicate nella trasmissione del virus.
Questo si trasmette con bassa efficienza anche attraverso i contatti familiari o per puntura
accidentale.
Epatite acuta
L'intervaUo di tempo tra esposizione al virus e sviluppo di epatite è di 2-26 settimane,
con un picco tra 6 e 12 settimane. L'intervallo medio tra esposizione e sieroconversione antiHCV è minore, circa 2 settimane, così come lo è l'intervallo tra esposizione e comparsa di
viremia (l). Durante la fase acuta, l'epatite ha generalmente un andamento clinico blando con
livelli di transaminasi che raramente eccedono le 1000 UI/1itro. Nel 75% dei casi, l'epatite è
anitterica Più difficile è definire il profilo clinico dell'epatite sporadica. poiché tutti gli studi
avevano come punto di inizio l'arruolamento di pazienti con malattie clinicamente rilevabili. Di
conseguenza l'epatite sporadica è stata sottostimata, visto il gran numero di casi subclinìci che
sfuggono al riconoscimento. Il decorso clinico dell'epatite è variabile. L'aspetto più
caratteristico è rappresentato dall'andamento fluttuante e polifasico delle transaminasi (2). La
maggior parte dei pazienti ha variazioni talvolta ricorrenti di alcune centinaia di IU/litro
nell'arco di una settimana. caratterizzate dalla progressiva diminuzione nel tempo dell'ampiezza
di queste oscillazioni. Alcuni casi mostrano apparente e protratta nonnallzzazione delle ALT
che potrebbe suggerire la guarigione. Tuttavia. in non pochi casi. questo andamento prelude ad
esacerbazioni enzimatiche asintomatiche. Accanto a questi casi acuti clinicamente silenti che
sono probabilmente la maggioranza., ci sono casi con andamento clinico severo, caratterizzati
da rapida progressione dell'epatopatia. L'epatite fulminante si verifica molto raramente nei
48
pazienti infettati per v1a parenterale, e forse solo in pazienti immunodeficienti o con
preesistente epatopatia (3}. Due pazienti sottoposti a trapianto allogenico di midollo osseo,
hanno sviluppato insufficienza acuta epatica dopo ripristino dello stato immunitario dovuto alla
sospensione della ciclosporina (4). In altri casi, l'HCV era implicato solo come cofattore
insieme ad altri virus epatitici come HAV, HBV, HDV o all'uso di farmaci.
Infezione cronica
V epatite cronica si sviluppa in oltre il 70% dei pazienti con infezione acuta posttrasfusionale e il 50% di quelli con infezione sporadica (5, 6). Esistono certamente casi di
infezione cronica con lesioni istologiche significative senza alterazione delle transaminasi (7).
Meno certo è che possano esistere portatori "sani" di virus, cioè senza apprezzabili lesioni
istologiche del fegato. Nella maggior _parte dei casi, l'infezione cronica è svelata dalla
persistente elevazione delle transaminasi per un periodo superiore ai 6 mesi dall'esordio acuto,
ed è accompagnata dalla sieropositività per anti-HCV e HCV-RNA. Circa il 20% dei pazienti
con epatopatia cronica evolve in cirrosi, con decorso per lo più asintomatico. Pertanto, la
sottostima dell'infezione cronica da HCV può avere conseguenze cliniche importanti. In uno
studio multicentrico di 568 pazienti trasfusi tra il 1967 ed il 1980, la mortalità in generale non
era aumentata., ma fu riportato un aumento significativo del numero dei decessi per epatopatia
(8). Il sanguinamento da varici esofagee e il carcinoma epatoceUulare sono le più comuni cause
di decesso nel paziente con cirrosi. In Giappone e in Italia, il carcinoma epatocellulare HCV
correlato è in aumento, poiché è una sequela a lungo termine di una epidemia di epatite C
trasfusionale verificatasi nella popolazione 20 o 30 anni fa (9). Non sono ben definiti i fattori
che influenzano la severità dell'epatopatia e il tasso di progressione a cirrosi nei pazienti con
infezione C. Le covariate cliniche ed epidemiologiche predittive di severità, includono età del
paziente, durata della malattia, profilo sierico delle ALT, presenza di cofattori quali infezione
da virus B o alcolismo, lo stato immunitario dell'ospite e fattori propri del virus quali il
genotipo e la carica virate (10, Il). Numerose evidenze indicano che esistono tipi virati
probabilmente dotati di maggiore patogenicità. Studi con4otti in Europa e in Giappone, hanno
suggerito una associazione tra genotipo lb e malattia s~a (11). E' invece controverso se
l'immunità dell'ospite può influenzare il corso della infezione, poiché a fronte di lavori secondo
(
}
49
i qua1i la presenza ad esempio di coinfezione HlV non modifica la storia naturale della malattia
c. altri dimostrano che la malattia epatica negli immunocompromessi può avere un andamento
particolarmente severo, in
r~lazione
alla elevata replicazione HCV dimostrata nei soggetti
coinfettati (12). Numerosi Pazienti emofilici multitrasfusi sottoposti a biopsia epatica
dimostrano prevalenza di malattie croniche non progressive (13). Tuttavia. una rianalisi di
questi punti ha dimostrato che in una parte di questi pazienti la malattia può evolvere fino al
cancro (14). L'HCV appare chiaramente il più importante fattore di rìschio nell'analisi
retrospettiva condotta su 135 pazienti con cancro del fegato, nei quali ben il 65% risultava
anti-HCV sieropositivo (9). Questo dato era convalidato in uno studio prospettico di 447
pazienti con cirrosi (15). In questo studio nel quale 20 l pazienti avevano cirrosi HCV
correlata, 90 svilupparono epatocarcinoma durante un periodo difollow-up di 7 anni.
Manifestazioni extraepatiche
L'HCV è implicato nella maggior parte dei casi di crioglobulinemia di tipo II, condizione
caratterizzata dalla presenza di immunoglobuline omogenee, per lo più a componente IgM-Km
e anti-IgG. Agnello e collaboratori (16) hanno dimostrato la presenza di HCV-RNA in 16 dei
l9 pazienti e anticorpi anti-HCV in 8. In 4 pazienti, quasi tutte le sequenze HCV-RNA erano
concentrate nel crioprecipitato. Una discreta percentuale di questi pazienti aveva sindrome di
!:-.)ogren, un'altra verosimile manifestazione extraepatica da HCV. In uno studio, il 29% di 20
pazienti con infezione cronica C aveva scialoadenite linfocitica focale, cioè una lesione
istologica delle ghiandole salivarie labiali caratteristica della sindrome di Sjogren, mentre
questa lesione era presente solo nel 5% dei controlli con varie malattie ( 17).
Benché questi studi dimostrino una stretta associazione tra HCV, crioglobulinemia e
scialoadenite, essi non provano l'esistenza di un legame patogenetico diretto. Numerose
osservazioni giocano a favore di un ruolo diretto deli'HCV nell'immunità. Esse sono la
replicazione del virus nelle cellule mononucleate (18), e la prevalenza di anticorpi
muscolo liscio,
anti-
anti-microsoma di fegato e rene (LKM). anti-tiroide e anti-GOR (epitopi
derivati dall'ospite), in molti pazienti con epatite.
.
j
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52
MECCANISMI VIROLOGICI DELL'INFEZIONE.
Maurizia Rossana Brunetto
Dipartimento Sperimentale di Gastroenterologia,
Patologia Epatica, Ospedale Molinette,
Corso Bramante 88, Torino
I virus parassitano organismi uni o pluricellulari, in grado di garantire la replicazione di
acidi nucleici e la sintesi proteica e, utilizzando le cellule come una fucina biologica, producono
un numero estremamente elevato di nuovi virus con lo scopo di perpetuare la specie ed
infettare nuove cellule. La progenie virale non è del tutto identica al virus progenitore, ma è
soggetta ad un1evoluzione conseguente alla selezione naturale delle mutazioni che
continuamente avvengono durante la replicazione virale. Tale condizione biologica costituisce
un vantaggio per la sopravvivenza virale, infatti la capacità di moltiplicarsi vertiginosamente
organizzandosi in popolazioni eterogenee, garantisce la capacità di adattarsi rapidamente alle
variazioni ambientali e di selezionare di volta in volta le varianti virati più efficienti. E' oggi
possibile studiare anche le singoli componenti di ogni popolazione virale amplificando
artificialmente i virus che la compongono e confrontandone le caratteristiche genetiche con
quelle degli altri virus della stessa popolazione virate. Studi di questo tipo hanno rivelato come
l'eterogeneità delle popolazioni virali possa essere paragonabile a quella delle popolazioni
umane ( 1). Alcune delle variazioni genomiche riscontrate nelle popolazioni virai i sono state
associate a particolari condizioni e fasi del ciclo vitale dei virus e si sono rivelate
particolarmente utili alla loro sopravvivenza Un tipico esempio di mutazioni utili alla
soprawivenza dei virus sono quelle che, detenninando variazioni dell'involucro, sono in grado
di non farli riconoscere dagli anticorpi neutralizzanti o dalle cellule del sistema immune, che è
deputato all'eliminazione di elementi estranei all'organismo (l). I virus, come forme viventi
difettive hanno bisogno di parassitare altri sistemi viventi e per tale ragione non causano
usualmente la morte od una grave sofferenza delle cellule iilfettate: molte malattie virali, come
la maggior parte delle epatiti, non sono causate direttamente dal virus, ma dal tentativo del
sistema immune di eliminare le cellule che li albergano. Svariate sono le strategie usate dai
{
53
virus per sfuggire all'eliminazione da parte del sistema immune (Tab. l). Ai fini di eludere la
sorveg]ianza immunitaria alcuni virus, come i retrovirus, hanno sviluppato la proprietà di
integrare il proprio acido nucleico in quello della cellula infettata. Un'altra strategia usata dai
virus per sfuggire all'eliminazione immunologica è quella di cercare di indurre il sistema
immune a tollerarli. Un modo tra i più evoluti ed efficaci è quello utilizzato dal virus dell'epatite
B (HBV) che ha entrambe le capacità suddette(!). L'HBV può nascondere il proprio acido
nucleico integrandolo in quello della cellula infettata e può indurre tolleranza producendo un
eccesso di materiale vira! e o particelle viraii difettive (almeno l 000 forme difettive per ogni
virus vero e proprio) che distraggono 'l'attenzione del sistema immune. In questo modo i virioni
completi possono passare inosservati nella moltitudine di falsi virus che circolano nel sangue.
L'alterazione dell'equilibrio tra replicazione virale, sintesi di proteine inducenti tolleranza
e risposta immune antivirale può determinare la perdita della tolleranza immunologica con
l'inizio della fase di immunoeliminazione e malattia (2). Alcuni dati sperimentali nell'uomo e
nello scimpanzé (vedi altre letture nella stessa sezione) indicano che anche nell'infezione da
HCV il meccanismo principale di danno epatico è di tipo immunomediato (3, 4). Queste
osservazioni pongono alcuni interessanti quesiti sui meccanismi di infezione e persistenza
deii'HCV in quanto esso è causa di infezione cronica in un numero di soggetti paragonabile a
quelli cronicamente infettati dali'HBV. L'HCV tuttavia non ha la proprietà di integrare il
proprio genoma nel DNA della cellula infettata (5) e apparentemente non induce una vera e
propria condizione di immunotolleranza (3). L'HCV come I'HBV è però in grado di infettare le
cellule mononucleate del sistema immune e questa via di infezione rappresenta verosimilmente
la sua porta di ingresso del virus nell'organismo (6). La prevalenza significativa dell'HCV nella
maggior parte delle patologie autoimmuni, sia sistemiche che organospecifiche, suggerisce che
uno dei meccanismi utilizzati per sfuggire all'eliminazione da parte del sistema immune sia
quello di alterare le reattività immunologiche dell'ospite utilizzando a proprio favore alcuni
meccanismi immunitari che sarebbero deputati all'eliminazione virale. Il virus infatti si
concentra e si maschera negli immunocomplessi circolanti e riesce abilmente a sfuggire a1Ja
neutralizzazione mutando rapidamente importanti epitopi del proprio mantello superficiale. La
frequenza ed il tipo delle mutazioni che awengono a livello di una piccola regione ipervariabile
localizzata a11'estremità NH2 della proteina di superficie E2 indicano che I'HCV ha un'elevata
54
capacita' di mutare con modalità simili a quelle del virus dell'immunodeficienza acquisita (IDV)
(7). La variabilità di questa regione appare associata alla persistenza virale ed è indipendente
dal tipo e dalla gravità della malattia di fegato. Tuttavia il sistema immune del soggetto
infettato può sviluppare una risposta naturalmente o con l'aiuto della terapia con interferone in
grado di eradicare l'infezione virale. Lo dimostrano studi immunopatologici che hanno rivelato
come la comparsa di cellule mononucleate del sangue periferico (CD4) in grado di riconoscere
un numero sempre maggiore di epitopi virali si associ alla guarigione dell'epatite C. I fattori
virologici e dell'ospite che condizionano l'efficienza di eliminazione del virus sono però
sconosciuti e solo il progresso delle conoscenze sulla biologia del virus e sui suoi meccanismi
di replicazione potranno permetterei di individuarli in futuro.
Tabella l.
Meccanismi di persistenza virale in soggetto immunocompetente
TOLLERANZA
RESISTENZA
Evadere la s01veglianza
Sfuggire ali' aggressione
del sistema immune
del sistema immune
*rimozione delle molecole di riconoscimento
sulle cellule infette
* cambiamento degli epitopi riconosciuti da
anticorpi neutralizzati
"escape" universali
*abrogazione delle funzioni leucocitarie
*localizzazione in cellule senza espressione di
HLA
*cambiamento degli epitopi riconosciuti
dai CTL
"escape" individuali
(
55
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56
AUTOIMMUNITA'.
Francesco B. Bianchi, Luigi Muratori, Marco Lenzi
Cattedra di Medicina Interna Il, Istituto di Clinica Medica Generale e Terapia Medica,
Università di Bologna_
Negli ultimi due anni l'epatite cronica a verosinùle genesi autoimmune, ridefinita tout
cours "epatite autoimmune" (EAl), è stata oggetto di attenta considerazione. Nell'autunno
1993 l 'lnternational Autoimmune Hepatitis Graup (IAHG) ha proposto i criteri diagnostici
dell'BAI sui quali i membri del Gruppo avevano raggiunto il consenso (1). Sulla base della
somma algebrica dei punteggi, positivi o negativi, attribuiti ad una serie di parametri di minima
(clinici, biochimici, positività di autoanticorpi sierici - ANA, SMA, LKMr, presenza di
marcatori virali, esclusione di eziologie note - farmaci, alcool - e presenza di patologie
autoimmuni associate) e di parametri addizionali (istologia, autoanticorpi diversi dai
precedenti, presenza di ffi..A B8wDR3 o DR4, risposta alla terapia) il paziente in oggetto è
considerato o meno affetto da c;matite autoimmune definita o probabile.
Nell'autunno 1994, in occasione del Congresso Mondiale di Gastroenterologia di Los
Angeles, è stata discussa, e contestualmente pubblicata (2), la nuova terminologia da usare
nella definizione delle epatiti
croniche~
accanto all'EAI figura una "Chronic Hepatitis,
unclassified as to Virai or Autoimmune Origin"· l'introduzione di tale entità nosologica è
motivata dal fatto che in un certo numero di casi non è possibile una chiara distinzione tra
eziologia virale, suggerita dalla positività di classici marcatori, ed eziologia autoimmune,
suggerita dalla presenza di autoanticorpi sierici, alcuni dei quali sono a tutt'oggi indistinguibili
da quelli presenti nella classica EAI. Viene in tal modo codificato quanto riportato da noi (3) e
da altri sulla sovrapposizione di momenti eziopatogenetici virali (in particolare I'HCV) ed
immunologici in un certo numero di casi di epatite cronica. ·.
Le caratteristiche deii'EAI, quali possono essere desunte dall'applicazione dei criteri
proposti dall'IAHG, sono quelle di una malattia con spiccate alterazioni dei parametri
(
57
biochimici (AL T, y-globuline) ed istologici all'esordio, che è più frequente in pazienti di sesso
femminile e risponde in modo in genere rapido e completo alla terapia steroidea, terapia che è
notoriamente in grado di modificare la storia naturale della malattia. In una analisi retrospettiva
della casistica di epatiti criptògenetiche con positività dei classici autoanticorpi sierici,
osservata in epoca pre-HCV, i soggetti che non sono risultati affetti da EAI, definita o
probabile, in base ai criteri IAHG si caratterizzano per una più moderata attività biochimica ed
istologica di malattia e risultano, nella maggior parte dei casi, anti-HCV e HCV RNA positivi
Emerge chiaramente in tutte le casistiche che l'EAI LKM 1-LC 1 positiva interessa, m
prevalenza, soggetti in età infante-giovanile (pediatrica in più della metà dei casi, imèriore ai
40 anni negli altri casi), mentre i soggetti anti-HCV!LKM1-LCJ positivi (quantiticabili tra il 3 e
il 5% dei soggetti con epatite cronica da HCV) hanno un'età significativamente piU elevata ed
una più moderata attività di malattia rispetto ai soggetti LKM 1-LC 1 positivi, anti-HCV
negativi, affetti da EAI. Questi dati, uniti all'osservazione della comparsa deli'LKM 1 in pazienti
già
infettati
dall'HCV,
fa
ritenere
che
il
fenomeno
autoimmune
(la
comparsa
dell'autoanticorpo) sia secondario all'infezione virale.
L'HCV non deve ritenersi pertanto causa di malattia autoimmune, come l'EAI, che
rimane una affezione criptogenetica; attraverso meccanismi non ancora chiariti (mo/uu/ar
mimicry? infezione di cellule immunocompetenti?) e probabilmente sulla base di una
predisposizione (geneticamente determinata?) a montare una risposta autoimmune, l'HCV può
indurre la comparsa di fenomeni autoimmuni: oltre all'LKM 1, ali'LC 1, all' ANA e nllo SMA
sono esempi pertinenti di una tale possibilità la comparsa di crioglobuline (Ig anti-Jg mano- e
policlonaJi) nella crioglobulinemia mista correlata all'infezione da HCV e di anticorpi antiGOR.
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J Hepatol
~
273-27)
\'l fu:.;
59
MODALITÀ DI TRASMISSIONE DELLE EPATITI NON-A, NON-B PARENTERALI
Alfonso Mele
Laboratorio di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Superiore di Sanità. Viale Regina Elena,
299-00161 Roma.
lntroduzione
Le epatiti non-A, non-B rappresentano circa il 20% delle epatiti acute notificate e, come
gli altri tipi di epatiti da virus, anche questo ha mostrato nell'ultimo decennio la tendenza alla
diminuzione (l). L'identificazione alla fine degli anni '80 del virus C (HCV) ha consentito di
attribuire a questo virus gran parte delle epatiti non-A, non-B.
Il ruolo deJJ'uso di droghe endovenose e delle trasfusioni nella trasmissione delle epatiti
non-A, non-B parenterali è ben noto, ma questi due fattori di rischio spiegano una quota di casi
non superiore al 500/o.
Obiettivo di questa presentazione è di illustrare altre possibili modalità di trasmissione
delle epatiti non-A, non-B.
Fonti dei dati e metodo
Vengono utilizzati i dati del Sistema di Sorveglianza delle Epatiti Virali Acute (SEIEVA)
(l) e quelli di uno studio caso-controllo ospedaliero condotto a Napoli tra novembre 1987 e
maggio 1991 (2).
Metodo Seieya
In seguito alla notifica dei casi di epatite virate acuta, ciascun paziente viene intervistato
da un operatore del Servizio di Igiene Pubblica della USL attraverso un questionario standard
e vengono registrati i risultati dei principali marcatori dell'infezione da virus epatitici.
n
questionario indaga sui principali fattori di rischio delle epatiti a trasmissione
parenterale e di quelle a trasmissione oro-fecale. Vengono indagati i sei mesi precedenti per
quanto riguarda l'esposizione ai fattori parenterali e sei settimane per quelle
feco~orali.
Copie
6<
dei questionari vengono mv1atc al centro d1 coordinamento situato presso l'Istituto Supenorc
ÙJ
Saniti.
Per la stima de1 tassi di incidenza vengono utihzzatc le popolazJOtlJ delle USL del
censimento 199 l
Un caso dJ epatite acuta v1cne classificato come non-A, non-H. se negativo per IgM antJHA V e per HBsA~
Per valutare l'associazione tra fatton d1 risch10 c malattw e stata usa1a una mctodoloi!l<·
come quella del caso-controllo I casi di epatite non-A. non-B sono stati confrontati con f]uell:
delle epatiti acute di tipo A
notificate attraverso lo stesso SIStema d1 sorveglianz•~
L:
definizione dJ caso di epatite A v1ene fatta attraverso la positività delle IgM anti-JIA V
vantagg1 e gli svantaggi dell'utilizzo di tale gruppo di controllo sono stati illustrati altrove (3)
Studio caso-controllo ospedaliero
Sono stati confrontati 333 casi di epatite non-A, non-B con 1095 controlli provenienti dallo
stesso ospedale dove erano stati reclutati i casi in reparti di pediatna , di neurochirurgia, d1
otorinolaringoiatria, m un reparto ortopedico, m uno di chirurgia elettiva ed infine in uno d1
pronto soccorso
Risultati
Nella tabella l vengono riportate le stime delle associaziom tra epatite non-A, non-B ed
alcuni de1 tattori di nschio considerati. Oltre alle trasmissioni d1 sangue e a l'uso d1 droghe
endovena, sono fattori di rischio positivamente associati con l'epatite non-A, non-B anche gl1
mterventi chirurgici, la terapia odontoiatrica, altre esposizioni parenterali (agopuntura,
tatuaggi, buchi alle orecchie, rasatura dal barbiere, mamcure e pedicure) e rapporti sessuali con
più di un partner (T ab l) Queste associazioni vengono
confermate dai risultati dello studio caso-controllo condotto a Napoli (Tab. 2 e 3)
Per quanto riguarda quest'ultimo studio è da notare che le associazioni sono più' forti per
1
casi anti-HCV positivi rispetto a quelli negativi Analizzando in dettaglio gli intervent1
chirurgici è risultato che i rischi più' elevati esistono per gli interventi ostetrico-gmecologici
-
~
OR
·.2
,·~·t
'i flJ_'i%
C
l-~
;t;~·lli dilli-l /CV
407_3()) per i casi anu-HCV
poSlll\1
tJR= 7
~
t'6°n C!
2 b_.22
O)
negativi
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r'·~··liHHlt_~ ~e·,s11<de.
,·:ro··:~·
rr:tlLltllèrHi
lntinc
ia
··r':ttlle. ha 1111 rtt,)l•.1
·:a detto che doptl
•lUtll,\
d1 epat1tc non-A.
62
Tabella 1
Rischi relativi aggiustati* (O.R.) ed intervalli
di confidenza al 95% (I.C. 95%).Epatite NonA,NonB
SEIEVA 1989- 1993
O.R.
(l. C. 95%)
•
Trasfusioni di sangue
6.62
(4.05- 10.8)
Uso di droghe
17.3
(12.7- 23.5)
Interventi chirurgici
3.75
(2.90- 4.85)
Terapia odontoiatrica
1.33
(1.13- 1.56)
Altre esposizioni
parenterali
1.27
(1.07 - 1.52)
Partners sessuali'
(2 o più)
1.34
(1.10-1.64)
Contatti con portatori"
HBsAg
•
Aggiustati anche per sesso,età, istruzione e
area geografica
*' Tatuaggio, agopuntura, buchi alle orecchie, rasatura dal
barbiere, manicure e pedicure.
'*' Età ;:,15
l
'
l
!
63
Tabella 2
Percentuale di casi e controlli esposti ad uso di droghe per via
endovenosa e trasfusione con Odds Ratios (95% Intervalli di
Confidenza) aggiustati, stimati con la regressione logistica
policotomica in base alla positività anti-HCV. Napoli, Italia 1987-91
l! CONTROLLI
Fattori di rischio
l
anti-HCV POSITIVI anli-HCV NEGATIVI
(No. 1095)
%
(No. 197)
%
(95~~.1.)
(No. 136)
%
(9S~~I.)
···········-··········--··--··························r······················-····························-············--·························-··············································-··········
Droghe endovenose •
O. 7
51.3
71.0
(32.0-160.0)
13.3
13.0
(5.3-31.0)
Trasfusioni
(periodo 1987-1989 )!
0.8
14.8
49.0
(17.0-140.0)
4.6
7.0
(1.9-27.0)
Trasfusioni
(periodo 1990-1991
ll
li
•
0.3
1.4
1.9
(0.01-270.0)
0.0
l
• Aggiustati per età, sesso, livello cl istruzione e per le abre variabili eklncate.
Non calcolabile
64
Tabella 3
Percentuale di casi e controlli esposti ai fattori di rischio
considerati dopo l'escuslone di soggetti trasfusi e tossicodipendenti,
con Odds Ratios (95% Intervalli di Confidenza) aggiustati, stimati per
regressione logistica policotomlca in base alla positività anti-HCV.
Napoli, Italia 1987-91.
iCONTROLLI
1
Fattori di rischio
l
anli-HC\t POSITIVI anli-HCV NEGATIVI
(No. 1081)
%
(No. 79)
%
,
(No. 114)
o.R.
. {95% C.l.)
%
o.R.
(95% C.l.)
-········-···---···········----r----··-···················--·······--·····-··········-·-·--··---··-··········-·-·····
Interventi chirurgici
i
2.4
16.5
12.0
(4.0-35.0)
12.4
4.9
(2.0-12.0)
10.3
22.8
0.8
(0.3-2.0)
17.5
1.1
(0.6-2.3)
Terapia odontoiatricai
11.0
22.4
Altre esposizioni
cutanee••
11
2.1
5.1
1. 7
(0.5-6.0)
5.4
1.8
(0.7-4.8)
i
Partners sessuate• .. ,
6.6
16.9
1.4
(0.7-3.0)
11.5
1.2
(0.5-2.7)
5. 7
16.7
1.4
(0.6-3.6)
13.6
2.2
(1.0-5.1)
i
Ospedalizzazione
•
Consumo di frutti
di mare
( 1 .~~. 5 )
13.2
(0.~~. 1 )
• Aggiustati per età, sesso, livello di istruzione e per le attre variabili delralenco.
•• Buchi alle orecchie, tatuaggi, agopuntura, pedicure e manicure.
·-Età superiore ai 14 anni.
(
65
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66
HCV: TRASMISSIONE INTRAFAMILIARE E SESSUALE
Maria Chiaramonte, Professore associato di Gastroenterologia, Divisione di Gastroenterologia,
Istituto di Medicina Interna, Università di Padova.
(con la collaborazione di Umberto Lorenzoni, Specializzando in Gastroenterologia, Università
di Padova).
L'infezione da HCV è una di quelle dimostrata essere trasmissibile con sangue e derivati.
( 1). La sua epidemiologia ha dimostrato delle rilevanti analogie con altri virus a trasmissione
ematica quali HBV ed IDV. In particolare si sono andati scoprendo sempre più casi di
infezione nei quali non era possibile identificare alcun rischio di tipo ematogeno. Tutto questo
ha portato ad ipotizzare una possibile trasmissione parenterale inapparente simile a quella che
si era dimostrata per I'HBV ed, in particolare, ad una trasmissione nell'ambito familiare e nella
comunità. Particolare attenzione suscita, naturalmente, la possibile trasmissione sessuale.
Epidemiologia di DCV nell'ambito familiare
É indubbio che la prevalenza di anti-HCV nell'ambito dei conviventi familiari dei
portatori cronici di HCV è Sl.V'eriore a quella che si osserva nella popolazione generale (Tab.
1). Tale fenomeno appare evidente soprattutto in aree geografiche ad alta endemia (Area
Mediterranea e Giappone rispetto al Nord-Europa)
Dagli studi epidemiologici più dettagliati nei particolari. emergono tuttavia alcune
caratteristiche peculiari:
a) 1 clusters familiari descritti sono in genere di pochi elementi ( 2-3 casi nell'ambito della
stessa famiglia);
b) 1 casi secondari di portatori di anti-HCV sono in genere adulti, i bambini o adolescenti
sono rarissimi ( Tabb. 2a, 2b, 2c, 2d);
c) 1 casi secondari sono prevalentemente coniugi, anche, se non si escludono fratelli e figli
(dati molto parziali sui genitori anche se indicativi di alta prevalenza) (Tab. 3) .
.,
(
_,_
67
Nell'ambito della convivenza familiare i fattori di rischio sono molteplici: possono essere
,,_
·~·
.,.
'~o;<
~·
c
'-'
-
':''
gli stretti rapporti interumani diretti (es. rapporto sessuale, allattamento, ecc.) ma sono anche
condivisione di abitudini di vita ed eventualmente anche di fattori di rischio comuni (es.
siringhe per iniezioni, oggetti d~ toilette, ecc.). Alcuni studi hanno evidenziato una correlazione
positiva molto significativa con tali fattori (2, 3, 4).
Altri studi hanno evidenziato una correlazione tra trasmissione intrafamiliare di HCV ed entità
di epatopatia nel caso indice, (5, 6, 7) storia di trasfusioni e/o uso di droga nel caso indice, (8)
ilwata di matrimonio, (9) età. (5, 9,
IO).
Trasmissione sessuale
La trasmissione sessuale dell'HCV è uno degli argomenti più studiati.
I dati a disposizione, tuttavia, derivano prevalentemente da informazioni epidemiologiche
indirette. A favore della possibile tramissione sessuale sono stati portati i seguenti dati:
I."
aumento di prevalenza di HCV in poPQiazioni con alta promiscuità sessuale, (3, Il, 12,
28) per altro non tutti concordi. (29).
n.
aumento di prevalenza in coniugi rispetto ad altri componenti familiari ed aumento di
prevalenza con la durata di matrimonio (ma anche con l'età). (13, 14, 15, IO)
m.
descrizione di alcuni casi aneddotici di epatite acuta in partner sessuali di pazienti HCV
positivi.
Non concordi con la trasmissione sessuale sono invece:
l.
la bassa prevalenza di anti-HCV in omosessuali maschi (16, 17) ed in prostitute. (18, 16).
II. la mancata trasmissione sessuale in esperimenti su scimpanzè. ( 19)
6b
Nella valutazione dei dati deve essere tenuto presente cht.:
- l coniugi riscontrati entrambi HCV positivi hanno. e vero, matnmoni più lungh1 ma sono di
fatto anche piu anziani (e nell'area Mediterranea la prevalenza di anti-HCY e massima nella
fascia d'eta tra 50 e 60 anni (20) J
Nelle coppie più giovani costituite da entrambi i comugi HCV positiVI, emerge molto spesso
come in entrambi sia presente una stona attuale o pregressa di tossicodipendenza
l coniugi condividono anche altri fattori di rischio In uno studio recente da noi condotto e
emerso come i principali fattori dt nschio per la trasmiss10ne di HCV in partner sessuali d1
paz1enti anti-HCV positivt, fossero rappresentati da trasfusiom e/o uso dt droga e v ne1 cas,
secondari nonché dalla condivisione di siringhe di vetro non a perdere nell'ambito familiare
-
Non esistono studi prospettici soddisfacenti (incidenza di nuovi casi in coniugi di portator1
cronici di HCV, la difficoltà di realizzare questi studi è soprattutto costituita dal fattore
tempo probabilmente importante per la trasmissione di tale agente virale)
-
E impossibile valutare con precisione l'avvenuto contatto con HCV a diftèrenza di HBY
(assenza di marcatori sierologici di "pregressa infezione". dato soprattutto importante ne1
coniugi)
-
La ricerca di HCV ~ RNA nel liquido seminai e e nella saliva ha dato risultati contrastanti
(21, 22)
In conclusione, l'ambito familiare rappresenta anche per I'HCV un'area di rischi<\
preferenziale.
La trasmissione
è però
legata a vie parenterali
abbastanza
complessivamente in via di sparizione
La trasmissione sessuale, pur non potendo essere esclusa, è sicuramente rara.
ovvie e
69
Tabella l.
l
n° familiari
casi secondari li CV+
riferirn.
studiati
bibliografico
l
l-SA, 1989
'
l
34
3/34
62
-
(8.8%)
l
l
23
'
' USA, 1990
l
Spagna, 1991
l
i
l
'
530
i
6
(4.9%)
5
302
(4.3%)
15
Spagna, 1994
401
(J.2C!fo)
14
(;iappone, 1991
196
5/196
rhailandia, 1992
92
5/92
(5.4%)
128
11228
(0.4%)
Spagna, 1992
l
126/530
l
i
!
'
(8%)
!
''
24
l
i
l
i
l
!
IO
!
( ;ermania, 1993
l
.
l
'
""_'_;•_I_L_o_m_b_•_r_d·_·•_1._1_9_9_1_-+-_ _x_s__
J
7/88
l
25
l
(7.9%)
26
Italia (Lombardia), 1993
107
16/107
(14.9%)
2
Italia (Toscana), 1994
159
14/159
(8.8%)
13
(6.5"!.,)
27
(8.7%)
nostra casisitica
Italia (multicentrico), 1994
Italia (Veneto), 1994
1400
lO!
l 35/401
l
l
'!
l
Tabelht 2.
cas1 secondan anti-HCV• m ambito famiharc. in rclaz10nc all et<:
Classi d'età (anni) dei familiari studim:
Tabella2tt
(da JMedViro1.199LD 114-1!6)
!
l
2-211
IHCVo
i
o
Lli C\-
''
34
Tabella 2h (do lnfection. 199!.
il
41-5(1
2
5
l
4
5
3R
l
29
p
l
31
i 51-611 l 61-78
31-411
47
l
l
(l 4~1-4lll
Familiari studiati
Anti-Uf'V+
126
2 (1.6%)
l2o- 34
181
3 (1.7%)
135- 49
79
5 (6.3%)
114
Il (9.7%)
3(1
5 (16.7%)
ttà (anni)
l < 20
50-
6~
l> 6S
Tabella 2c
-
l 21-30
(da Scand J Gastroenterol. !99l, 28. 343-34(1)
età media (anni)
!
55.1
25.7
-
j
Tabella 2d (nostra casistica)
prevalenza di cas1 in anti-HCV+m relaziOne all'eta cd al grado di parentela
Coniugi
Figli
Fratelli/Sorelle
Genitori
s 30
-
-
15.4%.
-
> 30
12.9 Yo
14.3%
35.3%
21.0%
1
71
I';Jbella 3.
rConingi (%)
Prevalenza di Anti-HCV in relazione al grado di parentela
Figli(%)
Fratelli/sorelle (o/o)
Genitori(%)
Rif.
bibliografico
l
28
6.9
n.d.
54
3
'
4.7
n. d.
n.d.
n. d.
14
12.7
12.7
Il
6.8
9
5.4
1.1
20.5
23
24
6.7
3
6.7
8.1
5
14.7
12.6
n.d.
n.d.
18
n.d.
n.d.
n.d.
'
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l
l
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74
TRASMISSIONE NEI GRUPPI A RISCHIO.
Pietro Dentice, Rosalba Buongiorno, Anna Volpe,
Antonio Miglietta, Gaetano Lonero,
Rodolfo Sacco
Istituto Policattedra di Clinica Medica e Malattie Infettive dell'Università degli Studi di Bari.
Piazza Giulio Cesare 70124 Bari
Introduzione
La disponibilità di metodiche immunoenzimatiche di seconda generazione per la ricerca
degli anticorpi specif1ci dell'Epatite da Virus C (HCV) ha fornito importanti conoscenze sulla
diffusione dell 1infezione da HCV in categorie considerate a rischio (l, 2)_ La trasmissione
dell'HCV per via parenterale o parenterale inapparentc e suffragata infatti dall'alta prevalenza
di soggetti anti-HCV positivi dopo epatiti acute post-trasfusionali e di donatori anti-HCV
positivi implicati in epatiti post-trasfusionali E' stato inoltre documentato Palto rischio d1
infezione da HCV dopo somministrazione di emoderivati o lotti di immunoglobuline.
Tossicodipendenti, emodializzati, trapiantati, soggetti sottoposti a cure odontoiatriche ed
operatori sanitari, contaminati da sangue potenzialmente infetto, rappresentano le categorie in
cui sono state verificate più elevate prevalenze di positività per l'anti-HCV
La trasmissione parenterale inapparente (sessuale, perinatale ed intrafamiliare) risulta
essere infrequente, probabilmente per la bassa concentrazione virale nei soggetti infetti
La prevalenza dell'ariti-HCV nei donatori di sangue in Italia e compresa tra l'l ed il 3%
con alcune significative differenze tra le regioni settentrionali e meridionali, sensibilmente più
elevate rispetto alle prevalenze rilevate nei restanti paesi Europei (3, 4). La prevalenza aumenta
proporzionalmente con l'aumentare dell'età e nei soggetti che presentano una alterazione del
valore delle transaminasi
La obbligatorietà introdotta in Italia nel 1990 dello screening per l'anti-HCV del sangue
da trasfondere e l'utilizzo di metodiche di seconda e terza .generazione, che risultano essere
maggiormente sensibili e specifiche, hanno drasticamente ridotto l'incidenza di epatiti acute
75
post-trastùsiOnali Negli ultimi anni e quindi disponibile nei centri trastUsionali un sangue p1ù
sa:uro e a minor nschio di infezione per l'anti-HCV.
l.a prevalenza di ant1-HCV in tossicodipendenti e risultata essere compresa tra i! 60 e
J'S0° o ( 5. 6, 7)_ Non si osservano differenze statiSticamente sigmfìcative tra tossicodipendenti
delle diverse aree geogratìche, ne si osservano d1flèrenze significative tra i pazienti HIV
pos!IÌVI cd HIV negativi. La trasmissione di HCV nei pazienti IIIV positivi e principalmente
legata alla tossicodipendenza, anche se non e del tutto esclusa la vta sessuale
tossJcodipendentl HCV ed HIV positivi presentano, inoltre, una evoluzmne peggiore della loro
epatopatia, nspetto ai soggetti HIV negativi, ed una minore nsposta all'eventuale trattamento
cun tnterferon.
~ci
pazienti con çpatopatia cromca alcool correlata la prevalenza di ant1-HCV
Italia e compresa tra il34 ed il 51% senza sostanziali dill'erenze geografiche tra il Nord ed il
111
Sud
.\!egli istituzionalizzati ricoverati per detìcit mentali e stata nscontrata una pn:valenza del
·l0 ·o 1X) Scarsa igtene e contatti interpersonah rosso no Jàvorire la trasmiSSIOne dell'H(' V
Sessll, età, grado di malattia e durata della istituLionalizzaz10ne non
~embrano
essere tintori dt
r·i'lchio influenti per l'HCV_
!l personale sanitario di
assistenza accidentalmente esposto a sangue potenZialmente
tntCtto e a rischio di poter contrarre l'infezione da HCV In Italia negli ultimi anm sono stati
-;egnalati casi di trasmissione de!I'HCV a seguito di puntura accidentale con strumenti int'etti o
per .:tmtaminazione mucosa attraverso micro-lestoni
Questa evemenza ha suggento di
:ntJctprendere studi epidemiologici sulla ditfus10ne degli dllttcorpl anu-HCV nella popola.lione
,-,"P!Jllaliera. In questi studi e stata osservata una prevalenza di anti-HCV (l,;l,!ruticatlvamente ptu elevala nspetto alla popolaz10ne dt comrnllo (9, IO,
,-,r,Jspettici .:ondotti in operaton
~amtari
li l
'i 0 'o)
'itullt
esposti al rischio di infez10ne hanno permesso
.11
r:,nare il tasso d1 sieroconverstone per !'HCV dopo puntura accidentale con ago infetto usato
'r1
paziente HCV positivo_ Il tasso di sieroconversione c compreso tra lo 0,6 ed 11 2. 7~ 11).
La prevalenza dell'anti-1-ICV negli emotìlici ragg1unge percentuali anche del 90%, specie
<'l
pazrent1 con una magg1ore esposizione agli cmoderivat1 Prevalenze sensibilmente p1u basse
;rl 0-~
circa) s! osservano negli ernotìlic1 che utilizzano emoderivati trattati con il calore o con
•liventt-detergentl
Si evidenzra Inoltre una correlazione statisticamente sigmticatrva tra
7b
pazienti con aumento persistente o transitorio de!!c transammas1 e positivna per anti-HC\'
Interessante e l'osservazione d1 assenza di anti-HCV positivita m un gruppo di emofìhc1 nn
trattati con sangue o plasma. con transaminas1 nel! a norma e trattati esclusivamente con fattor'
VIII pastorizzato
Nei talassemici trasfusione-dipendenti la prevalenza supera il 60%. senza significati\,_
differenze geografiche (l, 2) La positivita rer anti-HCV e strettamente correlata con il numc11 ·
delle trasfUsioni, età c l'ipertransaminasemJa persistente
Negli urem1ci cromci in emodialisi periodica s1 osservano prevalenze variabili da centro ;
centro (40-60%) Con le metodiche d1 pnma generaziOne e stata documentata una significati\'':
correlazione tra HCV positività ed età del paziente. durata della dialisi e numero di trasfusion.
(13, 14) Con l'aumento della prevalenza ottenuta con metod1che di seconda generazione. nn1
sempre e stata osservata una chiara correlazione tra numero delle trasfusioni ed HC\
positività. Recentemente nelle unita dialitiche si registra un decremento dei soggetti HC\
positivi Ciò e dovuto all'uso di un sangue controllato ed alle diminuite trasfusioni per l'impieg(,
dell'eritropoietina nella
prevenzwne dell'anemia dell'emodializzato_
Queste precauzioni
associate all'isolamento dei pazienti anti-HC\' positivi, spec1e se con transaminasi elevatt
hanno contribuito a ridurre il tasso annuo di infez10ne nei nuovi pazienti immessi in dialisi ne_l!l:
ultimi anni
La trasmissione di virus epatitici in soggetti sottoposti a trapianto d'organo suggensn·
cautelativamente di non utilizzare organi di soggetti anti-HCV positivi Si potrà procedere s0ln
in casi d1 estrema urgenza e di pericolo di vita, fornendo debita autorizzazione da parte del
ncevente
In uno studio condotto in pazienti affetti da /.1chen Planus, affezione cronica cutaneomucosa ad eziopatogenesi multifattoriale e complessa, e stata dimostrata un'associaziOne
significativa fra Lichen Planus erosivo della mucosa orale ed epatopatia HCV correlata ( 15 l
La prevalenza di anticorpi anti-HCV in questo gruppo di pazienti e risultata del 36% facendo
intravedere una possibile associazione tra Lichen Planus ed epatite cronica HCV
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C virus in haemodialysis patients. Nephron Ql: 307-308
15 Foti C, Novielli G, Coviello C, Velia F, Vena G, Volpe A Angelini G, Schiraldi O,
(1994). Lichen planus e virus dell'epatite C Giorn Ital Dermatol Venereo! 129 93-96.
l
79
LA TRASMISSIONE VERTICALE l PERINATALE DEL VIRUS HCV
Alessandro Zanetti e il Gruppo di Studio*
Istituto di Virologia, Università degli Studi di Milano, via Pascal38, 20133 Milano.
Il rischio potenziale di trasmissione del virus dell'epatite di tipo C (HCV) per vm
verticale/perinatale rimane ancora in buona parte da chiarire. I dati disponibili in letteratura
sono mfatti molto contradditori dal momento che alcuni Autori riferiscono frequenze
di
trasmissione elevate mentre altri riportano tassi molto modesti o addirittura nulli (l).
Con lo scopo di valutare la presenza dell'anticorpo
anti~HCV
nelle donne gravide e
l'incidenza di infezione da HCV nel neonato, abbiamo esaminato, nel periodo gennaio 1990 giugno 1993,21516 gravide (età media 28 anni, range 16-44 anni) afferenti a diversi ospedali
della Lombardia (2). Tutti i bambini nati dalle madri riscontrate positive per anti-HCV sono
stati seguiti per un periodo di 3-46 mesi.
A1l'esame sierologico, 250 donne ( 1.2%) sono risultate ripetutamente positive
all'anticorpo anti-HCV mediante EIA e RIBA e 195 (78%) hanno dato il loro consenso ad
essere arruolate nello studio. Alla nascita 193 dei 198 (99%) bambini esaminati risultavano
positivi per anticorpi anti-HCV. La percentuale di soggetti sieropositivi si riduceva al 60.6%
(74/142) a 6 mesi di età e al 15% (18/116) al 12o mese di vita. Ai controlli effettuati
successivamente, solo 4 bambini, tutti nati da madri co-infette con HIV, rimanevano
persistentemente anti-HCV positivi. Infine due bambini sono diventati. nel corso delfnl/ow-up,
anti-HCV negativi e successivamente ancora positivi (produzione ex novo di anticorpi attivi).
Al momento 116 bambini sono stati seguiti per più di un anno (media 18 8 mesi, intervallo 12-l6 mesi). Di essi, 94 erano nati da madri con sola infezione da HCV e 22 da madri
tossicodipendenti con doppia infezione da HCV ed HIV. Nessuno dei 94 bambini nati dal
primo gruppo di donne si è infettato con HCV, anche se al parto il 55% di queste madri erano
positive per HCV-RNA. Al contrario, 8 dei 22 (36.4%) bambini nati dalle madri co-infette con
IIIV si sono infettati con il solo HCV (5 bambini) o con entrambi i virus HCV e HIV (3
bambini) Tutti i bambini che si sono intèttati esibivano lo stesso genotipo materno (genotipo
80
la in 4 coppie, 3a in 2 coppie ed lb e 2a nelle rimanenti 2 coppie). Nessuna differenza
significativa è stata osservata nella distribuzione dei diversi genotipi di HCV tra le madri
tossicodipendenti che hanno trasmesso e quelle che non hanno trasmesso l'infezione da HCV. I
livelli di HCV-RNA (Quantiplex Assay) erano significativamente più elevati nelle donne coinfette con HIV rispetto a quelle con la sola infezione da HCV (mediana 77.55x I05
equivalenti l mi, range 12.56-351 7 vs 9.3337x w5 equivalenti l mi, range
3.5-104.8 x 1Q5
equivalenti l mi; p< 0.05 mediante test di Wilcoxon)
In conclusione i nostri dati indicano che il rischio di trasmissione materno-fetale
dell'HCV
è modesto quando la madre risulta infetta con il solo HCV, mentre diventa
notevolmente più elevato quando la madre è contemporaneamente infetta con HIV
~~
la
presenza in circolo di un maggiore carica virale
Bibliografia
Tanzi E, Stringhi C, Paccagnini S, Profeta ML . Zanetti AR, (1993). ls HCV transmitted
by the vertical/perinatal route? Arch Viro!, Suppl 8: 229-234
2.
Zanetti AR, Tanzi E. Paccagnini S et al.. Mother -to-infant transmission of hepatitis C
virus. Lancet, in press.
Gruppo di Studio: Bresciani Susanna, Mario Maria Grazia, Rodella Anna. Pizzocolo
Giuseppe, Padula D. (Brescia); Bulgarelli Jolanda, Caccamo Maria Letizia, Chiodo F.,
D'Amico Elio, Magliano Enrico, Muggiasca Maria Luisa, Paccagnini Susanna, Pilloton
Enrico, Pozzoli R., Romanò Luisa, Stringhi Carlo, Tanzi Elisabetta (Milano); Cambiè
Giuseppe, D'Agostino Francesco (Lodi), Vecchi Laura, Zapparoli Barbara (Monza).
·.--
81
TRASMISSIONE NELLA POPOLAZIONE GENERALE: FATTORI DI RISCHIO
Tommaso Stroffolini
Ospedale di Montefiascone (Viterbo)- Divisione Medicina
L'HCV è un virus presente nel sangue dei soggetti infetti, ove generalmente circola a
basso titolo.
Le modalità di trasmissione più efficienti sono rappresentate dalla trasfusione di sangue
infètto, dalla somministrazione di emoderivati infetti, dal trapianto di organi da parte di
donatori infetti e dall'uso di aghi contaminati con sangue infetto, come frequentemente avviene
per i tossicodipendenti. Più della metà dei soggetti con epatite C non riporta alcuna delle
suddette esposizioni.
Sono ammesse, anche se con diverso grado di efficienza, altre vie di trasmissione:
perinatale, sessuale ed intrafamiliare.
I risultati degli studi svolti per valutare il grado di efficienza di queste vie di trasmissione
sono legati sia alla sensibilità e specificità del test anti-HCV utilizzato che alla possibilità d1
quantizzare il livello di infettività del caso indice mediante titolazione dell'RNA virale.
In generale il rischio di trasmissione di HCV è funzione del grado di viremia del soggetto
intètto, della durata della esposizione, della modalità ed entità dell'inoculo, della via di
trasmissione, dello stato immunitario del soggetto esposto.
Un soggetto con alti livelli viremici di HCV può trasmettere l'infezione ad altri soggetti
per semplice esposizione percutanea o mucosa di non eccessive quantità di sangue od altri
liquidi biologici.
Un soggetto con bassi livelli viremici di HCV può infettare altri soggetti solo mediante
esposizione percutanea di una notevole quantità di sangue.
'
82
Il livello di viremia di un soggetto infetto è comunque fluttuante, pe11anto la probabilita
di un soggetto di infettare un altro e variabile nel tempo, aumentando ovviamente con la durata
di esposiziOne Differenze talvolta nscontrate nei risultati di studi sulla trasmissione sessuale ed
intrafamiliare riflettono differenti livelli di viremia dei soggetti studiati Inoltre al momento non
VI sono sufficienti dati sulla soglia minima di VJrcrnia necessana per trasmettere l'infeZione
In generale st può affermare che le vie di trasmissione sessuale, perinatale ed
intrafamiliare svolgono un ruolo nella diffusione dell'infezione da HCV
L'efficienza di queste vie è legata a fattori dell'ospite, del v1rus. de\ soggetto esposw
(condizioni di immunodepressione facilitano notevolmente l'acquisizione dell'infezione) e delll'
modalità con cui sì verifica l'incontro tra soggetto infetto e soggetto suscettibile
L'efficienza di queste vie di trasmissione è comunque per I'H('V più bassa che per altn
virus ematici quali I'HBV e l'Hl\'
Prevalenza nella popolazione generalt'
Indagini sulla prevalenza di anticorpi verso il virus C (anti-HC'V) nella popolazione
generale in differenti aree geografiche del modo sono state generalmente svolte sui donatori
volontari di sangue
E' noto che tale popolazione non è rappresentativa della popolazione generale in quanto
è già sottoposta ad altri screening per virus ematici (HBsAg, HIV), all'autoesdusione da par1L'
di soggetti appartenenti a determinati gruppi a rischio ed al fatto di non rappresentare tutte le
fasce d'età
Le prevalenze osservate sono in un rangç che và dallo 0,3% della Danimarca al 2% di
T aiwan. La sola eccezione è rappresentata dall'Egitto, ove la prevalenza è del 13.6%_ In questo
Paese il solo fattore di rischio indipendentemente associato all'infezione da HCV risultato la
pregressa schistosomiasi
83
Pochi studi sono stati effettuati nella popolazione generale utilizzando corretti criteri d1
..:arnp10narnento che potessero fornire validi dati di prevalenza Una sintes1 di alcuni di questi
~tudi è riportata nella tabella l
Dall'insieme delle indagini svolte
generale emerge in tutti
1
s1a
SUl
donatori di sangue che nella popolaziOne
raesi del mondo una prevalenza etit·specitìca dell'infezione
estremamente bassa in età infantile e giovanile con un marcato incremento dopo i 50 anni
In Italia la prevalenza di antl·HCV è nsultata di 0,4% m un campmne naz1onale di 27-l9
~o~getti
d'età 3-19 anni ( 1) e di 0.48 1n un campione di 4()78 reclute tn1litari d'eta 18-26 anm
provenienti da tutte le Regioni (2)_
l n contrapposizione alla bassa CJrco!azione del virus C nelle p1u giovani generaziom,
l'Italia è un Paese con un'elevata prevalenza di soggetti adulti con epat1te cronica
HCV
correlata (3, 4). Tale tènomeno piuttosto che riflettere un'esposizione al virus m etil adulta
~embra
essere l'espressione di un tipico etfetto coorte. Gli attuali soggetti adulti sarebbero stati
esposti al virus anni addietro, allorquando carenti condizioni igieniche e socio·sanitarie ne
favorivano la circolazione.
Faltori di rischio
E' importante premettere che nel valutare soggetti con intèzione cronica da HCV si deve
tenere conto che l'esposizione al virus risale ad anni precedenti, anche oltre JO nel caso di
·,\Jggclti con cirrosi, considerata la lunga stona naturale della malawa Pertanto sia l'attuale
hvdlo di endemia osservato che i tàttori di rischio nportati dai soggetti infetti fi:ltogratàno una
',nuazione di anni addietro.
l làttori di rischio associati all'intèzione da v1rus C sono statJ valutati in uno studio caso·
(Ontrollo recentemente conclusosi
tn
! !CV +/HBsAg· sono stati contì-ontati
Italia nord·orientale, nel quale 500 epatopatici cronici
con 500 soggetti non epatopat1c1 HCV ·li fl3sAg·
84
Utilizzando la regressione logistica multipla per eliminare l'effetto confondente dei vari
fattori di rischio in esame si è evidenziato che le esposizioni indipendentemente associate
all'infezione
da
HCV,
accanto
alle
tradizionalmente
note
trasfusioni
di
sangue e
tossicodipendenza endovena, erano costituite dall'utilizzo di siringhe di vetro sia in famiglia che
fuori dall'ambito familiare, dall'ospedalizzazione prima del 1970 e dall'essere stato in sanatorio
Inoltre stratificando i principali fattori di rischio per fascia d'età si è evidenziato che mentre la
tossicodipendedenza era riportata solo dai soggetti al di sotto dei 40 anni, gli altri tàttori di
rischio erano più frequentemente riportati in soggetti d'età superiore ai 60 anni
Nel corso degli anni '50 e '60, fino alla prima metà degli anni '70, l'uso di siringhe di vetro
era estremamente frequente; le siringhe e gli aghi venivano bolliti per alcuni minuti
raggiungendo temperature non sufficienti ad inattivare i virus parenterali quali i virus
dell'epatite B, delta e C. Inoltre sovente, soprattutto nelle fasce di popolazione meno abbiente,
infermieri non professionali somministravano con proprie siringhe terapie parenterali al
domicilio dei pazienti Essendo utilizzata la stessa siringa per terapie parenterali a diversi
soggetti è facile comprendere quanto ampia potesse essere la catena di trasmissione creata da
un eventuale soggetto infetto
Tale modalità di esposizione ha svolto un ruolo importante anche nella diffusione degh
altri virus epatitici parenterali B e delta, come evidenziato da numerosi studi_ Fortunatamente
dalla metà degli anni '70 l'uso delle siringhe di vetro è stato progressivamente abbandonato e
gi<l da alcuni anni è di regola l'utilizzo di siringhe monouso.Pertanto tale modalità di diffusione
del virus C, che nel passato ha generato una notevole quantità di infezioni, ha attualmente
esaurito il proprio ruolo_
Via di trasmissione estremamente efficiente, anche se limi~ata ad una limitata percentuale
della popolazione generale, è stata fino al 1991-1992 quella trasfusionale. Attualmente, con
l'introduzione del test di screening altamente sensibile di ELISA Il, l'incidenza dell'epatite C
85
post-trasfusionale è quasi del tutto scomparsa, essendo i pochi casi ancora riscontrati
attribuibili all'intervento chirurgico cui i soggetti si erano sottoposti.
Accanto alla tossicodipendenza per via endovena, che comunque interessa solo una
piccola percentuale della popolazione italiana, esposizione tutt'oggi a rischio di infezione da
HCV sono gli interventi chirurgici (particolarmente ginecologici) e la terapia dentaria, come
evidenziato da uno studio caso-controllo di recente effettuato sull'epatite acuta nonA, nonB
Poichè tale esposizione interessa un'elevata percentuale della popolazione italiana è tàcile
comprendere che verso la prevenzione di tale modalità di trasmissione vanno indirizzati i
maggiori sforzi.
Negli ultimi anni in Italia studi di incidenza e prevalenza
banno chiaramente
documentato una drastica riduzione della circolazione del vims 8 e delta dell'epatite quale
conseguenza
dei
miglioramenti
delle
condizioni
igienico-sanitarie
e
SOCIO-
demografiche che hanno fortemente influito sulla forza di queste infezioni virati. Poichè il virus
C dell'epatite condivide con tali virus molte modalità di trasmissione, anche se a più basso
grado di efficienza, è ipotizzabile che i suddetti tàttori abbiano comportato anche una sua
ridotta circolazione.
Lo scenano, peraltro drammatico, di alta diffusione del virus C tra gli epatopazienti
sarebbe la conseguenza di un evento prodottosi anni addietro. Con il progredire delle coorti di
giovani attualmente poco esposti al virus C . è ipotizzabile che tra qualche lustro si potrà
assistere ad una notevole riduzione delle epatopatie croniche e degenerative correlate a tale
VI fU S.
86
Tabella l. Prevalenza di Anti-HCV nella popolazione generale.
Paese
Fasce di età (anni)
ELISA
HCV+
Arabia Saud.
l -IO
I
0,9%
Alfaleh et all991
Taiwan
l - 12
II
O, l%
Chang et al 1993
18-44
II
0,4%
Graig et al 1993
5-70
II
12,5% Louis et al 1994
Belize
Cameroon
Italia
3- 19
II
0,4%
Autore
Romanò et al 1994
.
'
~•
•
Italia
18-26
III
0,5%
D'Amelio et al 1994
l
~•
1
1
·~
•
87
Bibliografia:
1.
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2.
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force recruits. Scand J Infect Dis (In Press).
3.
Chiaramonte M, Stroffolini T, Caporaso N, Coppola R, Craxi A, Gaeta GB, Sagnelli E,
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HCV chronic infection: A case-contro! study in ltaly. J Hepatology (Submitted for
pubblication).
88
FATIORI DI RISCHIO PER EPATITE C NELLA POPOLAZIONE GENERALE:
UNO STUDIO CASO-CONTROLLO.
Mauro Zaccarelli, Maria Antonella Longa, Pasquale Noto, Gianna Tossini, Fabrizio Ferri,
Ubaldo Visco Comandini*, Giuseppe Visco.
Azienda Ospedaliera San Camillo, Forlanini, Spallanzani - Ospedale "Lazzaro Spallanzani" -
Roma
"' Istituto Malattie Infettive Università di Roma "La Sapienza"
Introduzione e obiettivi
La scoperta e l'utilizzazione, negli ultimi anni, di nuovi, più sensibili e specifici metodi
(EIA e RIBA 2) per la ricerca degli anticorpi anti epatite C (HCV Ab) ha rivelato l'esistenza, in
vaste aree del globo, fra cui l'Italia, di una endemia di proporzioni imprevedibili, provocata da
questo virus.
Nell989, nell'ambito di una nostra indagine sierologica trasversale, finalizzata allo studio della
prevalenza dell'infezione da IDV e da HBV, erano stati anche ricercati gli HCVAb sui sieri di
9.037 reclute (di 17-20 anni di età), presentatesi alla visita di leva della Marina Militare
Italiana. Su questo campione di popolazione gli HCVAb erano presenti soltanto in n.18
soggetti, con una prevalenza dello 0.2 %.
Avendo la possibilità di analizzare i dati relativi a un elevato numero di pazienti che si erano
sottoposti al test per l'epatite C in cinque grandi nosocomi romani, abbiamo effettuato uno
studio caso·controllo, allo scopo di definire i possibili fattori di rischio per l'acquisizione
dell'infezione da HCV nella popolazione generale.
Materiali e metodi
I soggetti che, nel corso di tre bimestri (maggio-giugno e settembre·ottobre 1993 e
febbraio-marzo 1994), si erano presentati agli ambulatori 'di 3 Ospedali pubblici (Spallanzani.
San Camillo, Forlanini) e di due Case di Cura Private (Ars Medica, Guamieri), site in 3
diversi quartieri della città di Roma, onde effettuare prelievi ematici per indagini cliniche di
(
'i
.
89
vario tipo, sono stati intervistati mediante un questionario standard. Sui sieri di questi soggetti
ò stata eseguita la ricerca deii'HCVAb (IDA. Riba 2. [Orthol) e deii'HCVAbllgG (Qenbioco
[Medi~al Svstem]).
t. :·
A tutti i pazienti testatf per HCVAb è stato somministrato un questionario, che
raccoglieva dati demografici e informazioni su precedenti interventi chirurgici, terapie
endovenose, ricoveri per parto o interruzione di gravidanza, donazioni di sangue, malattie quali
il diabete e trasfusioni di sangue. In particolare per gli interventi chirurgici e le pratiche
sanitarie che richiedevano somministrazione di terapia per via parenterale si è stabilito come
;;
,-,_-..
punto di cut--offl'anno 1975, anno in cui sono entrate stabilmente in uso siringhe monouso
presso ospedali e strutture ambulatoriali, mentre per le trasfusioni si è cercato di valutare il
rischio prima del 1991, da quando cioè il test per HCV Ab sui donatori è entrato stabilmente in
uso presso i centri trasfusionali.
I soggetti risultati HCVAb' positivi sono stati scelti come casi e per ciascuno è stato
scelto un controllo random, HCVAb negativo, accoppiato per sesso ed età (±l anno).
Lo scopo dello studio era quello di determinare i fattori di rischio per HCV nella popolazione
generale, pertanto i tossicodipendenti (TD) per via endovenosa sono stati esclusi in quanto
l'uso di droghe per via endovenosa era la via attraverso cui passava l'acquisizione
deU'infezione. Analogamente, poiché si voleva valutare il rischio legato a pratiche sanitarie
avvenute prima dell975, sono stati esclusi dallo studio i soggetti nati dopo ilt970.
I dati raccolti con il questionario sono stati inseriti in un database insieme al risultato del
test per HCVAb. L'esistenza di associazione statisticamente significativa con la positività per
HCV Ab per ciascuna variabile di interesse è stata verificata mediante il test del chi-quadrato
(analisi univariata); è stata inoltre effettuata un'analisi multivariata attraverso un modello di
regressione logistica per determinare l'effetto indipendente delle variabili di interesse sulla
positività per HCV Ab. Nell'analisi multivariata sono state incluse le variabili significative
(p<0.05) o marginalmente significative (p<O.l) all'analisi univariata più la positività per
HBV Ab (anti-HBc IgG) come fattore di correzione.
90
Risultati
In totale sono stati tostati 5018 soggetti, di questi 226 (4,5%) sono risultati HCVAb
positivi.
Quarantanove erano TD (33 HCV Ab positivi, 67,4 %).
La prevalenza di HCVAb tra i non-TD era pertanto 3,9% (193/4969).
Tra gli HCV Ab positivi 13 sono stati esclusi perché nati dopo il 1970 e Il per dati
mancanti.
A 169 pazienti HCV Ab positivi (l 06 maschi e 63 femmine) sono stati pertanto
accoppiati 169 controlli come descritto nei metodi; l'età media dei casi era 55.9 anni (range
25-79) e quella dei controlli 55.7 anni (25-80).
In tabella l è descritta la distribuzione dei casi e dei controlli per le variabili considerate
nello studio.
La tabella 2 mostra il risultato dell'analisi univariata. Associazione statisticamente
significativa con la positività per HCV Ab era presente per quattro variabili: intervento di
piccola chirurgia prima del 1975; ciclo di terapia endovenosa prima del 1975; storia di diabete
antecedente il 1975 e trasfusione prima del 1991. Al contrario non risultava associazione
significativa per le stesse variabili dopo le stesse date.
Le quattro variabili, più il ricovero per parto prima del 1975, rimanevano significative
anche nell'analisi multivariata, aggiustata per positività per anti-HBV (Tab. 3).
Discuuione
l dati desumibili dalle nostre osservazioni empiriche sembrano indicare la presenza di
un'endemia di infezione da HCV con le seguenti caratteristiche epidemiologiche:
prima comparsa del virus a partire dal quarto decennio di età e soprattutto suUa sua larga
presenza fra gli ultra-50enni;
baasa circolazione di HCV nei soggetti al di sotto dei 20 anm, al di fuori del
tossicodipendenza per via endovenosa.
Questa endemia, già da tempo in atto prima del 197S·.appare in regressione, dopo tale
epoca, per un qualche possibile cambiamento intervenuto nella situazione epidemiologica.
Questo cambiamento sembrerebbe essere costituito dalla cessata utilizzazione delle siringhe di
..
(
92
Tabella l. Distribuzione delle variabili per casi e controlli
Fattori di rischio (RF)
HCV+
IN 169
IHCV1%
IN 169
l%
Donatore sangue prima 1975
15
9.2
7
j4.3
Donatore sangue dopo 1975
16
9.5
16
9.5
Terapia endovenosa prima 1975
51
31.3
14
21.5
118
IO .i
~
• dopo 1975
113
17 7
Intervento grande chirurgia prima 1975
32
19.6
39
23.9
Intervento grande chirurgia dopo 1975
23
13.6
24
14.2
Intervento piccola chirurgia prima 1975
102
62.6
65
39.9
130
117.8
141
]24.3
Ricovero per parto prima 1975
6
9.2
l
1.5
per parto dopo 1975
2
J31
14
162
Interruzione di gravidanza prima 1975
2
3.1
6
92
• dopo 1975
3
4.6
5
17 7
Diabete prima 1975
8
4.9
l
0.6
e dopo 1975
IO
IOO
IO
0.0
8
4.9
"&- •
'di
dopo 1975
Trasfusione di sangue prima 1991
e di sangue dopo 1991
Operatore sanitario
. . pei"'iiBcAb
conHBV
24
14.7
l
I06
12
lj 2
4
2.5
7
4.3
Il
6.7
16
J37
4
2.5
12
11.2
-
.
l '·
l
h
_-,,
,!>·
l!·
•
~
(
93
Tabella 2. Analisi univariata
.-'
- · Fattori di rischio
OR
!C al95%
p
' Donatore sangue prima I 975
2.3
0.8-6.4
0.08
Donatore sangue dopo 1975
LO
0.5-2.2
NS
Terapia endovenosa prima 1975
4.9
2.4-9.8
< 0.001
Terapia endovenosa dopo 1975
0.7
0.3-L6
NS
' ' b.tervento grande chirurgia prima 1975
0.8
0.4-L4
NS
. Intervento grande chirurgia dopo 1975
LO
0.5-L8
NS
Intervento piccola chirurgia prima 1975
2.5
L6-4.1
< 0.001
' Intervento piccola chirurgia dopo 1975
0.7
0.4-L2
NS
Ricovero per parto prima 1975
6.5
0.7-150.3
0.06
Ricovero per parto dopo 1975
0.5
0.1-3.2
NS
Interruzione di gravidanza prima 1975
0.3
0.04-L8
NS
Interruzione di gravidanza dopo 1975
0.6
0.1-2.9
NS
Diabete prima 1975
8.4
L00-183.4
0.02
Diabete dopo 1975
-
-
-
Trasfusione di sangue prima 1991
3.4
1.4-8.5
< 0.01
Trasfusione di sangue dopo 1991
0.5
0.02-7.2
NS
Operatore sanitario
0.6
0.1
2.2
Positività per HBcAb
1.9
0.6-6.0
NS
Convivenza con HBV positivo
2.0
0.3-16.4
NS
'.
.·
'
'
;-!)>
;~
•
94
Tabella 3. Analisi multivariata
Fattori di rischio
OR
!Cal95%
p
Donatore sangue prima 1975
2.3
0.8-6.5
NS
Terapia endovenosa prima 1975
5.4
2.7-10.8
< 0.001
Intervento piccola chirurgia prima 1975
2.7
1.6-4.2
< 0.001
Ricovero per parto prima 1975
10.9
1.1-105.6
0.04
Diabete prima 1975
24.1
2.9-202.0
< 0.01
Trasfusione di sangue prima 1991
4.0
1.6-10.1
< 0.01
;
•'
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95
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RUOLO DEL VIRUS DELL'EPATITE C NELLE INFEZIONI PROFESSIONALI
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DEGU OPERATORI SANITARL
Nicola Petrosillo, Francesco Albèrtoni, Vincenzo Di Nardo, Vincenzo Puro, Carla D'Ubaldo e
Giuseppe Ippolito,
Coordinamento del Programma Italiano per la Sorveglianza e il Controllo del Rischio
Occupazionale da IDV ed altri Patogeni a Trasmissione Ematica c/o Centro Riferimento AIDS
-Ospedale Spallanzani- Via Portuense n, 292, 00149 ROMA
Gli operatori sanitari (OS) rappresentano una categoria a rischio per l'acquisizione di
infezioni da virus a trasmissione ematica. Prima dell'introduzione della vaccinazione, numerosi
sono stati i casi di infezione occupazionale, manifesta e non, da HBV. In letteratura sono
inoltre descritti casi di trasmissione parenterale occupazionale dell'epatite non-A, non-8 (l). La
messa a punto di test di lahoratorio (EIA, RIBA, PCR, etc,) diretti nei confronti del virus
dell'epatite C (HCV), il maggior responsabile delle epatiti non-A, non-B a trasmissione
parenterale, ha fornito nuove infonnazioni sul rischio da patogeni ematici degli OS,
Stima del rischio
Le principali fonti di informazione sul rischio di infezione da HCV negli OS sono
rappresentate da: l) i casi riportati in letteratura internazionale, 2) gli studi di prevalenza, 3) gli
studi di incidenza.
Il primo caso di infezione occupazionale da HCV con sieroconversione documentata in
OS e' stato descritto nel 1990 (2), ed in totale, a tutt'oggi, sono stati riportati in letteratura
almeno 18 casi. La puntura accidentale con ago cavo contenente sangue e' la modalità più
frequente di acquisizione dell'infezione, mentre più rara e' la possibilità di trasmissione per via
mucosa, come documentata in un'infenniera italiana di dialisi (3). Da rilevare inoltre che in
letteratura e' stata documentata la trasmissione dell'HCV con il morso umano (4 ), eventualità
possibile in ambito occupazionale nosocomiale.
96
L'analisi dei casi riportati in letteratura internazionale, oltre a risvegliare l'interesse
sull'esistenza di un rischio occupazionale, offre una panoramica delle circostanze in cui si
verificano le esposizioni, ma non pennette una stima del rischio. Gli studi trasversali, pur con i
loro limiti, permettono di conoscere la prevalenza di infezione nelle popolazioni di OS studiati,
di confrontarle con quelle della popolazione generale o di altre popolazioni e di identificare
alcune associazioni tra la presenza di infezione e fattori di rischio (occupazionali e non).
Il tasso di prevalenza di anticorpi anti-HCV negli OS varia dallo O al 4,8% (5-13) a
secondo della numerosità della popolazione studiata, dell'area di servizio, de1la provenienza
geografica e del tipo di test usato.
Mentre nella maggior parte degli studi la prevalenza di anticorpi anti-HCV non e' molto più
elevata rispetto alla popolazione generale o ad altre popolazioni di riferimento (es. donatori di
sangue), si e' spesso riscontrata una associazione tra prevalenza di anti-HCV e fattori di rischio
comunitario (es. pregressa trasfusione) (13), mentre l'associazione con una pregressa
esposizione professionale (puntura accidentale) e' risultata debolmente significativa in alcuni
studi (13) e assente in altri (6).
Gli studi prospettici offrono dati più precisi sulla stima del rischio di infezione da HCV
negli operatori sanitari. I vari studi eseguiti hanno evidenziato tassi di sieroconversione, a
seguito di esposizione professionale a fonte anti-HCV positiva, dallo O al IO% (7,9,14-17): ciò
riflette le differenze tra le diverse indagini in termini di numerosità del campione, selezione dei
casi e modalità di diagnosi.
In particolare, Kiyosawa e coli. (15) hanno riscontrato 3 sieroconversioni per I'HCV in
IlO OS esposti all'HCV (2,7%), mentre Mitsui e coli. (16) hanno sottoposto afollaw-up gli
OS esposti a puntura accidentale da pazienti in cui era noto lo stato anti-HCV e HCV-RNA. In
quest'ultimo studio, tra i 130 OS esposti che al momento dell'incidente erano anti-HCV
negativi si sono verificate 8 sieroconversioni; 7/68 da pazienti HCV-RNA positivi, 1154 da
pazienti anti-HCV negativi. Il tasso di sieroconversione in caso di puntura accidentale da
paziente fonte HCV-RNA positivo e' risultato del IO%
Lanphear e coli. (17) hanno rilevato in IO anni 6 casf.di epatite occupazionale non-A,
non B (4 con anticorpi anti-HCV) tra gli OS di un ospedale di 732 posti Ietti, con un'incidenza
di 21 casi per 100.000 OS per anno (tasso standardizzato di incidenza 2,96, 95% LC: 1,83-
(
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-~-
97
4,36), che e' circa tre volte maggiore di quella in un popolazione di riferimento. Tra i 50 OS
con puntura accidentale da paziente fonte anti-HCV positivo vennero documentate 3
sieroconversioni (tasso di sier?conversione : 6%).
In Italia, Petrosillo '(7) e Stellini (9) non hanno riscontrato sieroconversioni
rispettivamente in 120 e 30 OS esposti ad HCV, mentre Ippolito (!4)
ha riscontrato 2
sieroconversioni (1,6%) su 123 OS esposti contestualmente ad HIV ed HCV.
Gestione dell'OS esposto ad HCV
La possibilità di una profilassi post-esposizione dell'infezione da HCV attraverso la
somministrazione di immunoglobuline standard e' stata suggerita sulla base dei risultati ottenuti
in alcuni studi sulla prevenzione dell'epatite non-A, non-B post-trasfusionale.
L'efficacia
di tale profilassi nei confronti dell'HCV non e' stata tuttavia definitivamente dimostrata ed e'
oggetto di contrastanti opinioni, anche per il fatto che non e' ancora chiaro quali siano gli
anticorpi neutralizzanti e se essi siano presenti nei preparati di immunoglobuline standard.
Inoltre, in Italia dal 1992 tutti i derivati plasmatici prodotti nel nostro Paese devono provenire
da donatori anti-HCV negativi, e dal gennaio 1993, in accordo con le direttive CEE, tale
nonnativa e' stata estesa a tutti i derivati plasmatici anche se prodotti fuori dell'Europa. Di
conseguenza. le Ig standard non dovrebbero più contenere gli anticorpi anti-HCV attualmente
evidenziabili.
Il follaw-up dell'OS esposto all'HCV prevede una visita medica e l'esecuzione del test
anti-HCV al tempo O e a 6 mesi di distanza. L'OS deve essere invitato a segnalare in qualsiasi
momento la comparsa di eventuali disturbi (18).
Conclusioni
Il rischio di infezione occupazionale da HCV degli OS e' basso ma non trascurabile.
Non disponendo attualmente di un vaccino nei confronti di questo virus, l'unica prevenzione
attuabile e' quella della riduzione delle esposizioni professionali. Un maggior rispetto delle
precauzioni universali e, probabilmente, l'introduzione di presidi sanitari più sicuri possono
ridurre al minimo il rischio degli OS di contrarre questa infezione.
98
Ringraziamenti
Lavoro realizzato nelrambito del Programma Italiano per la Sorveglianza e il Controllo
del Rischio Occupazionale da HIV ed altri Patogeni a Trasmissione Ematica, Progetto di
Ricerca sull'AIDS del Ministero della Sanità- ISS, Contratto 9201.04.
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100
VALUTAZIONE CLINICA DEL PAZIENTE CRONICO SINTOMATICO.
Luigi Ortona, Andrea De Luca
Istituto di Clinica delle Malattie Infettive, Università Cattolica del S. Cuore, L.go A. Gemelli 8,
00168 Roma, Italia.
Introduzione
Gli studi di clonaggio e sequenziamento del genoma del virus dell'epatite C (HCV)
hanno reso possibile lo sviluppo di varie metodiche per la ricerca nel siero degli anticorpi antiHCV (l) e dell'RNA genomico di HCV (2). Grazie a tali test è stato provato che l'HCV è
l'agente eziologico di oltre il 90% dei casi di epatite non-A non-B (NANB). L'infezione acuta
da HCV decorre per lo più in maniera asintomatica e tende a cronicizzare nel 60% dei casi.
L'epatite cronica da HCV mantiene per lo più un decorso subclinico ed evolve, nell'arco di 10
anni, in circa il40% dei casi in cirrosi epatica (3) e, in un ulteriore 10% in epatocarcinoma (4).
Recenti stime hanno evidenziato come il numero dei portatori di HCV in Italia sia di circa
L 700.000 (5). Considerando il fatto che la maggior parte di essi presenta forme cliniche più o
meno sintomatiche, nel nostro paese l'epatopatia cronica da HCV rappresenta un problema
clinico rilevante.
La valutazione clinica del paziente con epatopatia cronica sintomatica associata alt 'HCV
è un processo complesso. La stessa definizione di malattia cronica sintomatica si riferisce ad
una serie ampia di situazioni cliniche e patologie epatiche che spaziano dal paziente pressoché
asintomatico con parametri bioctùmici solo transitoriamente alterati e malattia epatica minima
al paziente con grave cirrosi epatica scompensata. La valutazione clinica del paziente cronico si
prefigge inoltre diversi scopi a seconda della situazione. L'esame clinico sarà inizialmente volto
a stabilire l'effettiva cronicità del paziente e la diagnosi eziologica, oltre che il suo status
complessivo. Sarà inoltre importante acquisire gli elementi necessari a stabilire la suscettibilità
del paziente alla terapia interferonica ed il tipo di trattamento da effettuare. La valutazione
clinica è infine indispensabile nel monitoraggio della risposta al trattamento instaurato.
{
.
..
lO!
Per effettuare una valutazione clinica completa sarà necessario analizzare congiuntamente
diversi parametri clinici, biochimici, virologici, immunologici ed i dati istopatologici, assieme ai
dati epidemiologici del pazient~- Analizzeremo di seguito i suddetti parametri, riportandone la
relativa importanza in- quantO indicatori diagnostici di stato della malattia. come fattori
prognostici o predittivi di risposta alla terapia e la lorO utilità nel monitoraggio terapeutico.
Valutazione dei Parametri Epidemiologici, della Storia e dello Status Clinico del
Paziente.
La storia clinica ha lo scopo di mettere in evidenza i fattori di rischio e quindi la modalità
f.---
di acquisizione dell'infezione. In Italia, i fattori di rischio più frequentemente individuabili sono
la tossicodipendenza da sostanze per uso endovenoso (25% dei casi) e le trasfusioni di sangue
o derivati (10%). Percentuali minori sul totale riguardano pazienti emodializzati, trapiantati,
soggetti sottoposti a cure odontoiatriche, tatuaggi, agopuntura. personale sanitario, soggetti
con storia di alcoolismo. Possibili anche se rare appaiono la trasmissione sessuale, maternofetale e intrafamillare. In circa la metà dei casi resta comunque impossibile stabilire un fattore
di rischio (6). L'individuazione di tale fattore, oltre che uno scopo epidemiologico, ha un
significato clinico. L 'appartenenza ad una determinata categoria a rischio può ad esempio
indirizzare il clinico verso la ricerca di eventuali coinfezioni con altri virus a trasmissione
analoga (come HBV o IDV).
Determinate modalità di
acquisizione dell'infezione
sembrerebbero inoltre correlate con i livelli di viremia e quindi con la risposta alla terapia con
interferoni: i pazienti con epatite post-trasfusionale presentano livelli di viremia sierica
superiori a quelli degli operatori sanitari o dei tossicodipendenti (7).
Nella storia clinica del paziente meritano particolare considerazione pregressi episodi di
epatite clinicamente evidente, coinfezioni con altri virus epatitici, eventuale infezione da IDV e
relativo stadio di malattia, patologie autoimmuni, assunzione di farmaci epatotossici ed
eventuali emorragie digestive da varici esofagee. Occorre inoltre porre attenzione, nella storia
del paziente, ad aspetti clinici che rappresentano una controindicazione alla terapia con
interferone, come cardiopatie gravi, ipertensione non controllata, insufficienza renale, una
storia
di
comizialità,
disturbi
psichiatrici.
Anche
la
gravidanza
rappresenta
una
102
controindicazione al trattamento. L'età ed il peso corporeo del paziente come l'eventuale
durata della malattia rappresentano importanti fattori predittivi di risposta alla terapia (7, 8)
(vedi tabella).
L'esame clinico completo del paziente ha lo scopo di mettere in evidenza sintomi e segni
clinici di interessamento epatico. Nel paziente "sintomatico" il quadro clinico è spesso subdolo:
egli lamenta per lo più una modica astenia con modesti disturbi digestivi e presenta al massimo
epatomegalia. Ben più evidenti appaiono i segni dell'eventuale scompenso epatico. Questi
vanno sempre attivamente ricercati, poiché costituiscono una controindicazione alla terapia
antivirale e necessitano di un trattamento specifico. Dovranno quindi essere valutati eventuali
segni di ipertensione portale, ritenzione idrosalina ed encefalopatia epatica (anche subclinica).
La presenza di varici gastroesofagee è frequente nei pazienti cirrotici, anche in fase di
compenso e va ricercata attivamente mediante esame radiologico o endoscopico. Esse sono
responsabili, in un numero rilevante di casi, di emorragia digestiva con mortalità elevata e
rischio di risanguinamento del 70% entro un anno (9). In circa il 6% dei casi, l'emorragia da
varici rappresenta il primo segno di cirrosi, fino a quel momento ignota. Va posta inoltre
attenzione ai dati clinici, strumentali e di laboratorio indicativi delle patologie prima
menzionate che rappresentano controindicazioni al trattamento con interferoni.
Parametri Biochimici, Emocoagulativi ed Immunologici.
Le
transaminas~
ed in particolare le ALT, rappresentano naturalmente l'indice
biochimico di necrosi epatocitaria maggiormente affidabile per la diagnosi di epatopatia cronica
ed il suo monitoraggio. La stessa cronicità viene definita, da un punto di vista biochimico, dal
persistere di livelli di transaminasi al di sopra dei limiti superiori della norma per più di sei mesi.
Tutti i parametri di funzionalità epatica possono apparire alterati in misura variabile, a seconda
della gravità del danno istopatologico. Tuttavia non esisté una correlazione costante fra
parametri biochimici ed istologici: si verificano infatti diversi casi con valori nonnali di
bilirubinemia, fosfatasi alcalina e globuline, con livelli di transaminasi appena al di sopra della
norma ed un quadro bioptico indicativo di una forma cronica attiva grave. I pazienti con forma
più grave ed avanzata possono presentare iperbilirubinemia, ipoalbuminemia ed allungamento
del tempo di protrombina. L'ipergammaglobulinemia è frequente, particolarmente in pazienti
..
(
..
103
con infiltrati plasmacellulari estesi a livello epatico. Livelli elevati di alcuni parametri biochimici
quali le yGT e la ferritina sierica, oltre che de!le ALT, sono predittivi di una scarsa risposta alla
terapia con Interferoni (8) (vedi tabella).
I livelli sierici di ALT · costituiscono il parametro biochimico principale per il
monitoraggio della risposta alla terapia interferonica. Appare ormai sempre più evidente come
una risposta biochinùca non sia, da sola, sufficientemente indicativa di un'autentica risposta
clinica, ne' tantomeno di guarigione, tuttavia il monitoraggìo di tale parametro mantiene una
discreta affidabilità e, soprattutto, un insostituibile praticità rispetto a quello istopatologico e
.)·
r.'~
virologico. La risposta completa viene definita dalla no1111,alizzazione delle ALT a fine
trattamento, mentre la riposta prolungata dalla persistenza delle ALT nei limiti di nonna fino a
6 mesi dopo la sospensione della terapia.
;:
La presenza di autoanticorpi (ANA. anti-DNA, anti-muscolo liscio, anti-mitocondrio,
anti-LKM) va sempre ricercata per valutare la presenza di forme autoimmuni anche in pazienti
anti-HCV positivi. Queste ultime necessitano infatti di un trattamento proprio. Nei pazienti
anti-ffiV positivi è fondamentale stabilire il livello dei linfociti CD4+.
Il dosaggio dell'a-fetoproteina quale marcatore di epatocarcinoma epatico va sempre correlato
al quadro clinico ed ecografico del paziente. in quanto da solo è scarsamente sensibile (spesso
è positivo solo nei tumori epatici di grandi dimensioni) e specifico (si innalza in tutte le
condizioni di replicazione cellulare elevata).
Parametri Virologid.
Ormai da 4 anni sono disponibili diversi saggi immunoenzimatici (ELISA) per la
rilevazione degli anticorpi anti-HCV. La specificità del risultato positivo di questi ELISA può
essere verificata mediante immunoblot con antigeni ricombinanti (RIBA). I test di seconda
generazione, presentano una sensibilità maggiore dei precedenti nella diagnosi eziologica
dell'epatite cronica C. Nei pazienti con fattore di rischio evidenziabile e malattia epatica
clinicamente evidente, un risultato positivo con l'ELISA è teoricamente sufficiente per indicare
l'HCV come causa di malattia: il 91-100% dei casi è confermato dal RIBA di seconda
generazione ( 10). Una piccola percentuale di pazienti può presentare un risultato indeterminato
con il saggio RIBA di seconda generazione. Nei pazienti con epatite cronica sintomatica
104
questo rappresenta più frequentemente rispetto agli asintomatici un risultato realmente
positivo, in particolare in presenza di positività della banda degli anti-C22. L'impiego di saggi
di terza generazione o la determinazione dell'HCV-RNA può essere utile nel chiarire il reale
stato di una parte di qUesti risultati indeterminati (Il).
Alcuni autori hanno mostrato l'utilità del dosaggio quantitativo degli anticorpi anti-HCV
nel monitoraggio della risposta terapeutica. In particolare la negativizzazione o la riduzione
degli anti-CIOO è stata dimostrata essere un utile marcatore di soppressione della viremia (12)
ed è risultata significativamente correlata con una risposta biochimica prolungata alla terapia
con lnterferoni ( 13). Gli anticorpi di classe lgM diretti contro antigeni del core virate (IgM
anti-HCV core), per la determinazione dei quali non sono disponibili saggi commerciali, sono
presenti in una ristretta percentuale dei pazienti con epatopatia cronica HCV-relata e non
mostrano tanto una correlazione con l'attività della malattia quanto con i livelli di viremia (14).
La ricerca di HCV-RNA mediante reazione polimerasica a catena dopo trascrizione
inversa (RT-PCR) nel siero dei pazienti con epatopatia cronica è raramente necessaria nei
pazienti immunocompetenti per indicare l'HCV come agente eziologico. Essa può invece
rivestire un ruolo diagnostico in pazienti immunocompromess~ poiché questi possono rimanere
anti-HCV negativi pure in presenza di infezione attiva. La determinazione della viremia sierica
mediante RT ..PCR si sta dimostrando sempre più utile nel monitoraggio della risposta alta
terapia. La persistenza di HCV-RNA nel siero nei pazienti con risposta biochimica completa al
tennine del trattamento è predittiva di recidiva precoce (15). La viremia si negativizza nei
pazienti con risposta biochimica prolungata. ma in una parte di questi, una positivizzazione
tardiva può essere predittiva di recidiva biochimica tardiva (16). Il dosaggio quantitativo
deii'HCV-RNA (mediante RT-PCR o amplificazione del segnale tramite il nuovo saggio
quantitativo bDNA) riveste un'importanza crescente nella selezione e nel monitoraggio della
terapia antivirale. E' stato infatti dimostrato che i pazienti -con livelli più elevati di viremia .
pretrattamento presentano più difficilmente una risposta clinica completa o prolungata (6, 11)
(vedi tabella).
L'influenza dei vari genotipi deii'HCV sulla progn~i della malattia epatica e
risposta alla terapia con Interferoni è oggetto al momento di grande interesse. I genotipi l a ed ,·
lb (secondo la classificazione di Simmonds (18)), sono associati ad una malattia epatica più'
}
105
grave e ad una peggiore risposta alla terapia, mentre i genotipi 2a, Ja e 4 mostrano risposte
terapeutiche migliori (19), anche indipendentemente dai livelli viremici pretrattamento (20).
Quando la detenninazione ;deJ genotipo potrà essere effettuata da un maggior numero di
strutture, essa potrà divenirè un elemento di valutazione indispensabile per la decisione della
strategia di trattamento da seguire. In tal senso appare promettente la messa a punto di un test
sierologico per la differenziazione di tre sierotipi, corrispondenti ai tre genotipi prevalenti in
Europa (21 ), che si è dimostrato efficace nella valutazione delia predittività della risposta
all'lnterferon (22).
Nei pazienti con epatopatia cronica da HCV deve essere valutata la presenza dei
marcatori sierici di altri virus epatitici, quali I'HBV e I'HDV. Data la sovrapponibilità delle vie
di trasmissione infatti, la coinfezione è relativamente frequente. Le percentuali più elevate di
coinfezione si trovano nei pazienti di età più avanzata e con epatopatia più grave (23). Il
fenomeno è frequente anche nei tossicodipendenti, spesso anche anti-fDV positivi.
L'associazione HBV+HCV determina un'aumentata frequenza di sviluppo di epatocarcinoma
(24). I pazienti con doppia infezione tuttavia, spesso non presentano segni di replicazione
dell'HBV, lasciando ipotizzare che il virus C sia la causa principale del danno epatico (25). I
pazienti anti-IHV positivi presentano una carica virate di HCV più elevata e questa appare
ulterionnente incrementare con il progredire dell'immunodeficienza (26). E' quindi probabile
che tali pazienti mostrino una minore risposta alla terapia con lnterferone. Pazienti anti-HIV
positivi immunocompetenti tuttavia, hanno presentato risposte biochimiche sovrapponibili agli
anti-HIV negativi (27).
Parametri Ecografici ed !sto patologici.
L'esame ultrasonografico viene utilizzato aJlo scopo di escludere altre possibili cause di
ittero ed ipertransaminasemia e di evidenziare alterazioni parenchimali epatiche compatibili con
epatopatia e segni di ipertensione portale non evidenti clinicamente, quali aumento dei diametri
dell'albero portale o minime quote di versamento ascitico. La guida ecografica in tempo reale
appare inoltre estremamente utile nella riduzione del rischio connesso all'esecuzione
dell'agobiopsia epatica. L'assenza di invasività. la riproducibilità, il relativo basso costo e la
sensibilità nell'identificazione di masse focali epatiche rendono infine tale tecnica utile nella
106
diagnosi precoce dell' epatocarcinoma mediante screening su larga scala di soggetti a rischio
quali i pazienti con epatopatia cronica da HCV (28).
L'esame istologico della biopsia epatica è un procedimento indispensabile per
l'accertamento della patologia epatica e l'eventuale inizio di un trattamento antivirale. Alla
divisione istopatologica classica in malattia minima. epatite cronica persistente, epatite cronica
attiva e cirrosi epatica. può essere affiancata una più fine detemùnazione, mediante punteggio,
dell'indice di attività istologica (29). La presenza di cirrosi epatica (8), di aggregati Jinfoidi e di
lesioni dei dotti biliari (7) ed un punteggio elevato dell'indice di attività istologica (20) sono
associati a livelli di viremia più elevati e ad una peggiore risposta alla terapia. L'HCV può
essere messo in evidenza nel preparato istologico mediante immunoistochimica (30),
ibridizzazione in situ (31) o RT-PCR (16). L'esame istologico a fine terapia è utile per
documentare la risposta istologica alla terapia antivirale. La negativizzazione del virus nel
campione bioptico a fine trattamento può essere predittiva di risposta biochimica prolungata
(16) ma non in tutti i casi (32).
Parametri predittivi di una probabile risposta sfavorevole agli interferoni
maggiore durata della malattia
pARAMETRI CLINICI
età avanzata (>50 anni)
nresenza di obesità
pARAMETRI BJOCHJMICI
valori elevati dì ALT, gGT, ferritina sierica
PARAMETRI VIROLOGICI
genotipo lb
· viremia elevata
presenza di cirrosi epatica
pARAMETRI ISTOLOGICI
punteggio di fibrosi (Knodell) elevato
presenza di flogosi lobulare, aggregati
linfoidi, lesioni dei dotti biliari
(
.
. . .j
}
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IlO
ASPETII CLINICI NELL'INFEZIONE DA HCV: VALUTAZIONE CLINICA DEL
pAZIENTE CRONICO ASINTOMATICO
Nicola Caporaso, Giovanna Del Vecchio-Bianco, Eny Crafa, Mariella Forestieri,Gabriella
Sessa, Iole Falzarano, Pino lasevoli, Concetta Tuccillo, Filomena Morisco
Cattedra di Fisiopatologia della Digestione, Dipartimento di Intemistica Clinica e Sperimentale
"F. Magrassi 11 , Università degli Studi di Napoli- Via Pansini 5- 80131 Napoli
Definizione di portatore asintomatico di infezione da HCV
Per "portatore asintomatico" di HCV si dovrebbe intendere un soggetto positivo per
indici di infezione da virus epatitico C ( HCV ) che non presenti sintomi di patologia epatica.
Da una definizione di questo tipo nasce un problema :
quali sono i sintomi specifici di patologia epatica che bisogna escludere per definire un
soggetto asintomatico ?
Nel 1978 abbiamo valutato la sintomatologia di esordio neUe epatiti croniche e nella
cirrosi HBsAg positiva e negativa ( l ). Da quello studio emergeva che non esisteva un profilo
sintomatologico che consentisse di differenziare in marùera significativa i pazienti HBsAg
positivi da quelli negativi e che. quando presenti. i sintomi erano spesso generici ( astenia,
i
dispepsia, turbe delflalvo, dolorabilità in ipocondrio destro, dimagramento ecc.), sovrapponibili
e facilmente confondibili con quelli presenti in disordini funzionali dell'apparato digerente. Non
esisteva inoltre sintomatoiogia di esordio capace di differenziare le epatiti croniche dalla
cirrosi. Nella maggioranza dei casi Jlevidenziazione della malattia era dovuta a reperto
j
occasionale. Concludemmo allora che "spesso le epatiti croniche presentano quadro clinico
sfumato e scarsamente utile, da solo, per affermare l'esistenza
••
l
ed il tipo di patologia
epatica".
l'
Dopo 16 anni abbiamo voluto rivedere le modalità di presentazione della
malattia in 357 pazienti affetti da epatite cronica
consecutivamente venuti aJia nostra
osservazione daJ gennaio 1993 al dicembre 1994.
(
'
t
.
III
E' emerso che :
l- attualmente la maggioranza ( 87%) deUe epatiti croniche osservata nei nostri reparti o
ambulatori riconosce etiolo~ da virus dell'epatite C;
2- nella quasi totalità dei casi ( .90%) alla diagnosi di epatite cronica si giunge non per ipotesi
diagnostiche e quindi per indagini ricttieste per sintomi "sospetti" ma per indagini eseguite
occasionalmente (donazioni di sangue, screening di massa e/o di familiari ecc. ).
Da questi dati emerge in maniera chiara che la stragrande maggioranza delle epatiti
croniche è priva di sintomi specifici o anche solo sospetti di patologia epatica.
Se quindi "per portatore asintomatico" si dovesse intendere un soggetto affetto da infezione da
HCV con scarsa o nulla sintomatologia in questa categoria rientrerebbero la grande
maggioranza degli epatopatici cronici anti-HCV positivi.
In realtà nell'uso comune si intende per portatore asintomatico di infezione da HCV il
soggetto che in pieno benessere è occasionalmente rilevato essere anti-HCV positivo~ la
maggioranza degli studi sui portatori asintomatici riguardano infatti i donatori di sangue che
all'atto della donazione risultano anti-HCV positivi. In questo caso l'asintomaticità è garantita
dal fatto che questi soggetti si sentivano bene a tal punto da compiere il gesto della donazione.
Dai numerosi studi eseguiti in questa categoria di soggetti è emerso (2,3.4,5,6);
l. Asintomaticità non va intesa come assenza di malattia epatica.
Circa la metà dei donatori volontari di sangue risultati anti-HCV positivi hanno evidenziato
ipertransaminasemia e quindi patologia epatica a vario grado di evolutività.
2. Normalità delle transaminasi non significa assenza di patologia epatica.
3. E' stata documentata presenza di patologia, anche severa, in soggetti che si presentavano
con normalità del quadro clinico e biournorale.
./. Asintomaticità, normalità de/Je transaminasi e del quadro istologico non indicano in
assoluto assenza di replica vira/e.
In conclusione esiste il portatore asintomatico con segni clinici, laboratoristici e/o istologici
di patologia epatica ---> malato ed il portatore asintomatico senza segni clinici,
laboratoristici ed istologici di patologia epatica ---> sano. Nell'ambito dei portatori sani
esistono soggetti con persistente replica virale nonostante l'assenza di malattia.
112
Approccio al portatore asintomatico
11 soggetto " occasionalmente " risultato anti-HCV positivo pone una serie di problemi
clinici e di rapporto medico-paziente. Le domande che più frequentemente vengono poste
sono:
- sono ammalato ?
- se sono ammalato, posso guarire ?
-sono "pericoloso" per gli altri ?
- come ho preso l'infezione ?
Nel rispondere dobbiamo tenere ben presente che le conoscenze sulla storia naturale del
portatore asintomatico sono tuttora largamente incomplete e che ci si trova molto spesso di
fronte ad un soggetto che si sente bene (spesso donatore di sangue) e che fino a qualche ora
prima era convinto di essere privo di qualunque tipo di patologia. Ipotesi di storia naturale (
possibile sviluppo di cirrosi ed epatocarcinoma) o di pericolosità per l'ambiente ( diftùsione
dell'infezione) vanno evitate o comunque non date per certe.
Presenza/assenza di patologia epatica (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)
Alterazioni deiie transaminasi, anche lievi o fluttuanti, esprimono quasi sempre presenza di
patologia. l livelli di elevazione delle transanùnasi non si correlano in maniera stretta con
presenza 0 assenza istologica di cirrosi o con l'entità dell'attività istologica .
Deriva da quanto esposto che, in presenza di elevazione degli indici di citolisi, è utile
proseguire l'iter diagnostico anche con l'esecuzione di biopsia epatica, indispensabile in questi
casi per la diagnosi e l'impostazione terapeutica corretta. Infatti in presenza di attività
istologica e di elevazione delle transaminasi è da consigliare terapia con interferone. La storia
successiva è quella delle epatiti croniche da HCV.
Jn assenza di qualsiasi segno clinico e Jaboraloristico di patologia epatica è utile controllo
periodico mensile, sia clinico che laboratoristico, per almeno sei mesi: in caso di persistente
normalità delle transaminasi è consigliabile detenninazione di HCV-RNA sierico. In caso di
negatività di HCV-RNA abbiamo elevate probabilità che si tratti di pregressa infezione da
HCV guarita, con scomparsa anche della viremia e persistenza anamnestica di reazione
.,
(
1!3
antieorpaJe anti-HCV. In questo caso si può rassicurare il soggetto anti-HCV positivo e
consigliare quaJche altro controllo di transaminasi a distanza di 6-12 mesi.
In caso di positività di HC'-:-RNA il discorso è più complesso.
Alcuni Autori ritengono che tutti o quasi tutti i soggetti anti-HCV /HCV -RNA positivi, anche
in presenza di normalità delle transaminasi, abbiano segni istologici di patologia epatica. per cui
consigliano sempre l'esecuzione di biopsia epatica. Altri Autori invece sostengono che esiste il
portatore sano di HCV per cui in presenza di normaJità persistente delle transaminasi non sia
del tutto giustificata resecuzione di biopsia epatica.
E' largamente probabile che i differenti dati ottenuti sui soggetti anti-HCV positivi con
transaminasi nonnali e quindi le diverse modalità di comportamento consigliate dipendano dal
tipo di casistica studiata : se si prendono in considerazione i soggetti anti-HCV positivi che
giungono alla nostra osservazione, avendo eseguito una sola determinazione delle
transaminasi risultata nella norma, è possibile che alla biopsia epatica si evidenzino casi con
epatopatie anche evolutive~ se invece si prendono in considerazione soggetti che in un follow-
up lungo hanno sempre evidenziato normalità delle transaminasi aJiora è più probabile che si
tratti di soggetti sani. E' infatti noto che nella storia naturale dell'epatite cronica da HCV
esistano periodi anche lunghi di normalità delle transaminasi che si aJtemano a periodi di
citolisi anche intensa. E' quindi probabile che, più lungo è il periodo
di nonnalità delle
transaminasi osservato, maggiore è la probabilità che il soggetto anti-HCV positivo sia sano,
nonostante la persistenza di viremia.
Meccanismi di diffusione neO'ambiente
I meccanismi di diftùsione dell'infezione da HCV non sono del tutto ben definiti. E'
largamente documentata la possihilità di trasmissione dell'iniezione per via parenterale
(trasfusione di sangue o emoderivati, siringhe e strumentario infetti ecc.); non sono a tutt'oggi
ben chiari gli altri meccanismi di trasmissione dell'infezione che certamente esistono. Emerge
infatti dalle varie casistiche che solo la metà, o addirittura meno, delle epatiti croniche da HCV
riconoscono nella esposizione parenteraJe manifesta
il momento di contagio. NeUa
maggioranza dei casi è da ipotizzare trasmissione parenterale inapparente.
114
E' stata documentata elevata prevalenza di anti-HCV positività e patologia epatica
correlata nei familiari conviventi, specie coniugi, di propositi anti-HCV positivi (IO), ma
questo non indica in maniera assoluta che la convivenza (intesa come mero contatto) con
soggetti anti-HCV positivi ti& da considerare fattore di rischio di infezione da virus epatitico C.
In famiglia, infatti, si condividono altre abitudini che potrebbero giustificare le aggregazioni
familiari di anti-HCV positività (stesso dentista, uso - specie in passato - di siringhe di vetro,
uso promiscuo di forbici, lamette ed altri strumenti taglienti ecc.).
Sono in corso studi prospettici per valutare se la eliminazione di questi potenziali
momenti contagianti elimina il rischio di acquisizione familiare di infezione da HCV. Nell'attesa
di avere dati certi e definitivi appare prudente e giustificato dare al soggetto anti-HCV positivo
le seguenti raccomandazioni:
l. non donare sangue
2. awertire i sanitari dello stato di anti-HCV positività
3. evitare l'uso promiscuo di strumentario potenzialmente contagiante
4. evitare che altre persone vengano a contatto con il sangue potenzialmente infettante.
Esistono ancora dubbi sulla possibilità di trasmissione dell'infezione con i contatti sessuali o
per via materno fetale. Queste vie di trasmissione sono quasi esclusive dei soggetti
contemporaneamente anti-HIV positivi.
Storia naturale e monitoraggio dd portatore sano di anti-HCV
Per portatore sano di infezione da HCV si deve intendere il soggetto anti-HCV positivo
senza segni clinici, laboratoristici ed istologici di patologia epatica. .
Non è nota la storia naturale di questi soggetti: non è definito cioè se il portatore sano di HCV
con il trascorrere degli anni
l - si ammala
2 - diventa HCV-RNA negativo
Uno studio preliminare (Il) di storia naturale di soggetti anti-HCV positivi, HCV-RNA
positivi , sani anche istologicamente, sembra indicare che nel cors@ di due anni di monitoraggio
clinico e laboratoristico:
a- nessun soggetto diventa HCV-RNA negativo
(
}
115
b - nessun soggetto mostra modifiche dei livelli di tt1111S8!1linasi
AJio stato attuale delle conoscenze il soggetto riscontrato occasionaJmente anti·HCV
positivo deve essere
controiJ~to
periodicamente (ogni mese per i primi sei mesi) mediante
monitoraggio delle transaminasi. In caso di alterazioni anche lievi di ALT è consigliata
esecuzione di biopsia epatica; in caso di persistente nonnaJità di AL T e di positività per HCV ~
RNA, il monitoraggio di questi parametri neJ tempo e maggiori conoscenze di storia naturale ci
indicheranno il comportamento da seguire. Dati preliminari sembrano indicare che è
inopportuno iniziare terapia con interferone in soggetti con AL T normali anche in presenza di
HCV-RNA positività (12). La detenninazione di lgM anti-HCV non offie in questa categoria
ulteriori infonnazioni. I dati della letteratura (13) indicano, intàtti, che le IgM anti-HCV sono
negative nei portatori sani di HCV ma anche che circa la metà dei soggetti anti-HCV positivi
affetti da epatite cronica non hanno reattività anticorpale di tipo IgM anti-HCV.
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-t
(
l
·-~-
)
117
VALUTAZIONE CLINICA DEL PAZIENTE CRONICO ASINTOMATICO
Giovanni Raimondo
Dipartimento di Medicina Inteina - Policlinico Universitario 98100 Messina
Possiamo definire portatore cronico asintomatico di virus dell'epatite C ogni soggetto
con positività per anticorpi anti-HCV, confermata con test RIBA, che presenti indici
bioumorali di funzionalità epatica normali e nessun segno clinico di malattia di fegato.
L'individuazione di un portatore asintomatico è, ovviamente, un evento occasionale,
tanto che tali soggetti vengono in genere identificati tra i donatori di sangue risultati anti-HCV
positivi ai routinari test di screening (1-3). Si tratta di una condizione che spesso crea dubbi
diagnostici e terapeutici al clinico (4), e quanto essa sia rilevante è confermato dal numero di
studi che continuano ad essere condotti su questo tema (5).
Sono principalmente due le problematiche riguardanti lo stato di portatore asintomat_ico di
HCV:
l) non si è certi se un'infezione da HCV possa esitare nella completa eliminazione del virus, e
quindi se, in caso di mancata evidenziazione deii'RNA virale, gli anticorpi anti-HCV siano solo
segno di pregressa infezione. Infatti, il non rilevare I'HCV-RNA nel siero potrebbe essere
dovuto ad una transitoria riduzione della viremia a livelli talmente bassi da non essere rilevati
dalla pur sensibilissima tecnica deJia doppia reazione a catena della polimerasi (nested PCR).
2) E' incerto se un portatore "asintomatico" di HCV possa essere realmente e stabilmente
"sano", non essendo stato ancora appurato se un'infezione cronica da HCV (confermata dalla
positività per HCV-RNA) possa instaurarsi senza che si produca, nel corso degli anni, alcun
danno epatico, come può verificarsi nel caso di infezione da virus B (HBV). Tra l'altro,
ancora oscuri sono i meccanismi patogenetici alla base della epatopatia da HCV. Ritengo
importante ricordare che portatore sano di virus B è definito ogni soggetto positivo per
HBsAg ed anti-HBe, negativo per IgM anti-HBc e HBcAg intraepatico, con funzionalità e
quadro istologico del fegato assolutamente nonnali (6, 7) e con attività replicativa del virus
-118
soppressa a tal punto che la viremia non può essere rilevata con la tecnica di ibridizzazione dot
b/ot, ma solo attraverso l'amplificazione del DNA mediante PCR (8).
Nel caso di pazienti anti-HCV positivi ed HCV-RNA negativi, malgrado i sopracitati
dubbi di interpretazione, l'atteggiamento clinico è solitamente univoco, soprattutto se il test
anti-HCV RIBA dà un risultato indetenninato (positività per uno solo degli anticorpi
evidenziabili): non si opera alcun tipo di intervento, anche se è consigliabile eseguire unfol/owup di questi soggetti controllando periodicamente gli indici bioumorali ed i rnarcatori virali.
Per quanto riguarda i soggetti HCV-RNA positivi (da considerare
i portatori
asintomatici propriamente detti) l'approccio clinico è controverso. Per meglio comprendere il
motivo di tanta incertezza
dobbiamo considerare i dati contrastanti emersi da studi di
valutazione del quadro istologico epatico in questi individui. Sono stati infatti pubblicati dei
lavori in cui si dimostrerebbe che tutti i pazienti asintomatici, con persistente viremia e costante
nonnalità degli indici di funzionalità epatica, presentano un quadro istologico di epatite cronica
di vario grado, e, in alcuni casi, anche di cirrosi (9, 10). D'altra parte, altri studi indicherebbero
che lo stesso tipo di pazienti possa presentare un quadro istologico del tutto normale (Il, 12).
Attenendoci ai primi lavori citati, dovremmo effettuare l'agobiopsia epatica in tutti i soggetti
risultati HCV-RNA positivi, indipendentemente dai segni clinici e dagli indici bioumorali, in
quanto l'esame istologico del tessuto epatico indicherà il grado di malattia cronica del paziente.
Gli altri lavori, invece, dimostrerebbero J' esistenza di portatori cronici sani di infezione da
HCV, per i quali, owiamente, l'agobiopsia epatica sarebbe una procedura inutile. Quale sarà
allora l'approccio clinico a questi pazienti?
E' sicuramente importante effettuare dei controlli rawicinati (mensili) degli indici
bioumorali di necrosi epatocitaria per un periodo di tempo prolungato (almeno un anno). In tal
modo è di solito possibile riconoscere quelle forme, relativamente frequenti, di epatite cronica
con andamento ondulante delle transaminasi,
caratterizzate da periodi, anche lunghi, di
normalità dei test di funzionalità epatica, intervallati da improvvise pousées di riattivazione
della malattia con picchi di ipertransarninasemia. Una volta identificate, la valutazione clinica di
queste forme sarà analoga a quelle delle epatiti croniche sintomatiche. Nel caso in cui,
nonostante i ripetuti controlli, non si evidenzi alcuna alterazione degli indici bioumorali,
l'atteggiamento del clinico potrebbe essere quello di astenersi da qualsiasi intervento, tenendo
(
..
)
119
presente, però, che soltanto l'esame istologico di un frammento bioptico può documentare con
certezza l'assenza o meno di malattia epatica.
Per concludere, un
pr~blema
recentemente aperto riguarda l'eventuale trattamento
terapeutico con interferone 'dei portatori asintomatici di HCV con ma1attia epatica
istologicamente dimostrata. Alcuni studi in tal senso sono in corso, ma. fino ad ora, sono stati
riportati solo i dati preliminari di uno di questi (13). Tuttavia l'uso dell'interferone in questi
soggetti desta più di una perplessità, e questo in quanto a) come già riportato in precedenza. la
mancata evidenziazione deli'HCV-RNA nel siero non è indice sicuro di completa eliminazione
del virus, b) l'efficacia terapeutica dell'interferone nei pazienti con fanne tipiche di epatite
cronica si osserva solo nel 20-25 % dei casi (14, 15), e c) una parte di questi, pur con
persistente nonnalità delle transaminasi, presenta permanenza della viremia ( 16, 17).
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121
VALUTAZIONE CLINICA DEL PAZIENTE CRIOGLOBULINEMICO E DEL
PAZIENTE AUTOIMMUNE
Francesco B. Bianchi, Luigi Muratori, Marco Lenzi
Cattedra di Medicina Interna Il, Istituto di Clinica Medica Generale e T era pia Medica,
Università di Bologna.
La disponibilità di test affidabili e routinari per la dimostrazione di anticorpi
circolanti diretti contro proteine del virus dell'epatite C (HCV) ha stimolato l'estensione
della ricerca di anti-HCV in patologie ad eziologia non nota, verosimilmente virale. Il
campo che si è
dimostrato a tutt'oggi il più fecondo di risultati è quello della
crioglobulinemia mista (CM), definita essenziale (CME). La supposta operatività di
virus epatitici nella genesi di tale situazione morbosa non è nuova: in passato è stato
sostenuto l'intervento deWinfezione da HBV (l); questi risultati non sono stati peraltro
confermati.
Le prime osservazioni, condotte in paesi dell'area mediterranea, hanno segnalato che
la prevalenza dell'anti-HCV nei pazienti con CME oscilla tra il 50 ed il 60% (2, 3, 4).
Tali osservazioni sono state confermate negli studi successivi. Una volta acquisita la
nozione dell'associazione tra HCV e CME, il problema che immediatamente si è posto è
stato in buona misura nosologico: infatti i contributi più significativi hanno cercato di
definire i pazienti in studio suddividendoli in gruppi omogenei, che oggi possono essere
così schematizzati:
l. pazienti con epatite da HCV, in cui si ricerca la presenza della crioglobulinemia;
2. pazienti con epatite cronica da HCV che, oltre al quadro clinico dell'epatopatia,
presentano sintomi e segni di interessamento multisistemico extraepatico (cutaneo,
renale, neurologico), indistinguibili da quelli che definiscono la CME;
3. pazienti reumatologici, renali, neurologici in cui la diagnosi di CME induce a ricercare
la presenza di infezione e di malattia epatica correlata aii'HCV.
122
Nel primo gruppo la ricerca delle crioglobuline (C) sieriche ha dato esito positivo in
più della metà dei casi In una delle casistiche più numerose (4) si tratta, nei due terzi dei
casi, di C policlonali (tipo III, secondo Brouet et Al -5), presenti a bassa concentrazione
nel siero_ Nel restante terzo dei casi è in causa una forma di tipo Il, in cui la componente
monoclonale è, nella grande maggioranza dei casi, di classe lgM k. Va segnalato che
un'affidabile caratterizzazione del tipo di C richiede l'applicazione di tecniche
immunochimiche (come l'immunoblotting-IB) di uso non routinario; J'IB si è dimostrato
infatti più sensibile e specifico nell'identificazione di mono- o oligocloni rispetto alle
tecniche correnti (immunoelettroforesi, immunofissazione) (6). Nell'ambito dei pazienti
anti-HCV positivi il gruppo di pazienti con C si differenzia dal gruppo senza C per una
più lunga durata di malattia, più elevati livelli di lg sieriche ed una maggiore frequenza di
CIITOSI.
Indizi di associato interessamento extraepatico sono presenti in un quarto circa dei
casi, che vengono per questo a costituire il secondo gruppo_ La presenza o meno di
sintomatologia extraepatica sembra disgiunta dal tipo (II o Hl) di CM sierica. l sintomi
più frequenti sono, in ordine decrescente, porpora, neuropatia periferica, interessamento
renate, fenomeno di Raynaud e, più raramente, artralgie o artrite e vasculite.
Il terzo eterogeneo gruppo è costituito da pazienti in cui la presenza del classico
quadro di CME (definito dalla triade sintomatologica "porpora, artralgie, astenia")
stimola la ricerca dell'anti-HCV e dell'HCV RNA e lo studio del fegato. Nel 1992
Agnello et Al (7) hanno confermato quanto già in precedenza segnalato (2) sulla stretta
associazione tra HCV e CME di tipo Il; riferiscono inoltre interessanti osservazioni
aggiuntive che riguardano:
una sorprendentemente maggiore sensibilità deii'HCV RNA rispetto all'anti-HCV di
seconda generazione nell'identificazione dell'infezione da HCV;
2. il fatto che l'HCV RNA (e quindi il virione HCV) ed i complessi anti-HCV/HCV si
concentrano significativamente nel crioprecipitato: questo suggerisce che I'HCV
giochi un ruolo nella patogenesi della CM;
123
3. il Fattore Reumatoide (FR) monoclonale rinvenuto nell'infezione da HCV è di tipo
W A: questo lo caratterizza come un anticorpo naturale, codificato da geni della linea
germinativa senza o con poche mutazioni somatiche_ li FR monoclonale di tipo W A
potrebbe essere un anticorpo naturale diretto contro l'HCV, prodotto da specitici B
linfociti e l'infezione da HCV (degli stessi linfociti?) potrebbe essere responsabile della
loro proliferazione.
Il riscontro di CM associata ad infèzione da l-l CV, con o senza segni di malattia
epatica, pone oggi pochi problemi sotto il profilo della terapia farmacologica: numerosi
.~tudi,
anche controllati (8, 9), indicano un etfetto benefico dell'aiFN con risultati positivi
s1a sulle manifestazioni cliniche, epatiche ed extraepatiche, sia sui parametri bioumorali.
In generale i risultati sembrano tuttavia leggermente inferiori a quelli osservati nella
malattia da HCV senza crioglobulinemia.
Rimane aperto il quesito che riguarda l'approfondimento diagnostico da mettere in
atto nel caso del riscontro di una CM con positività deii'HCV, con o senza epatopatia.
L'osservazione che la presenza dì lg monoclonali si associa spesso alla presenza di
monotipi midollari che configurano la presenza dì un linfoma non Hodgkìn a basso grado
(segnalazione effettuata in epoca pre-HCV -l O) è attualmente oggetto di attiva ricerca.
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125
INFEZIONE DA VIRUS DELL'EPATITE C (HCV): PROBLEMATICHE CONNESSE
AL TRAPIANTO DI FEGATO
Erica Villa, Antonella Grottola, Paola Buttaloco, Annalisa Merighi, llva Ferretti, Federico
Manenti
Cattedra di Gastroenterologia, Università di Modena
L'infezione con il vtrus dell'epatite C {HCV) è un evento piuttosto comune dopo
trapianto epatico: la recidiva è molto frequente (l, 2) mentre nuove infezioni si verificano in
percentuali variabili anche se no p molto elevate (l, 4). I problemi principali, fra loro
strettamente collegati, che si pongono in questi pazienti sono essenzialmente tre: l. le
caratteristiche dell'infezione dal punto di vista biologico-molecolare; 2. l'interazione fra HCV e
situazione immunologica del paziente dopo il trapianto (situazione questa che condiziona
notevohnente la diagnostica dell'infezione); 3. l'effetto a lungo termine dell'infezione da HCV
sulla situazione clinica epatica.
Per quanto riguarda le caratteristiche dell'infezione dal punto di vista biologicomolecolare, i pazienti in cui si ha una recidiva, presentano elevati livelli di viremia già pochi
giorni dopo il trapianto. Questo dato contrasta in parte con la valutazione che era stata fatta
inizialmente con i tests anticorpali (l). Questi infatti mettevano in evidenza una percentuale di
infezioni da HCV nel post-trapianto molto inferiore a quelle poi dimostrata successivamente
c-A)n le tecniche di biologia molecolare che, valutando direttamente la presenza del genoma
virate, owiavano alla sottostima del tests anticorpale (5, 6). Verosimile responsabile di questa
scarsa positività anticorpale è la pesante immunosoppressione del periodo post-trapianto che
può determinare una diminuzione marcata (nei p. già infetti prima del trapianto) o
un'incapacità a produrre anticorpi anti-HCV (nei p. neo·infetti). Dal punto di vista dei genotipi
deii'HCV, vi sono numerose indicazioni in letteratura che in caso di reinfezione, il ceppo che si
ritrova dopo il trapianto è lo stesso che il paziente presentava prima del trapianto (6, l l) anche
se il virus tende a diminuire la sua eterogeneità con solo modeste differenze di sequenza fra i
vari sottotipi che lo costituiscono (7, 8).
126
Più interessanti sono gli eventi che si presentano nei pazienti trapiantati che non erano
precedentemente anti-HCV positivi: in una serie di pazienti osservati nel nostro Istituto, in un
intervallo di tempo che va da un mese a quattro-cinque mesi dopo il trapianto, è identificabile
una transitoria positività per I'HCV RNA Successivamente, nonostante non si sviluppi alcuno
degli anticorpi identificabili con le metodiche attuali, l'infezione non cronicizza, tanto che a
distanza di un anno o più dal trapianto, solo uno di sei pazienti risulta cronicamente infettato
da11'HCV (6). Una parziale spiegazione di questa peculiarità si può trovare nel fatto che solo
uno dei pazienti si è infettato con un HCV di genotipo Il mentre tutti gli altri si sono infettati
con un genotipo l o III (che possono essere genericamente considerati meno patogeni).
probabilmente in conseguenza della differente provenienza geografica dei donatori (essendo
questi pazienti stati trapiantati in Belgio, in cui il genotipo II è meno frequente rispetto
all'Italia). E' sicuramente curioso considerare il fatto che questi pazienti non diventano
cronicamente infetti con I'HCV nonostante l'immunosoppressione a cui vengono sottoposti
nello stesso momento in cui vengono in contatto con lHCV. Non è ben chiaro il meccanismo
con cui questi soggetti riescono a superare l'infezione da HCV; è possibile che questi soggetti
producano anticorpi che non sono
attualmente identificabili per la limitatezza dei metodi
disponibili. D'altro canto, la peculiarità del sistema immunitario di questi soggetti è ben
illustrata dall'unico caso che dopo essersi infettato non è riuscito ad eliminare l'infezione_
Questo soggetto, dopo due anni ed oltre di infezione dimostrata solo dalla presenza di HCV
RNA, nel momento in cui l'immunosoppressione è stata notevolmente diminuita, ha sviluppato
una reattività C33 isolata, che tale si mantiene a distanza di altri due anni di osservazione.
Questo profilo immunologico ristretto è abbastanza tipico dei soggetti immunedepressi, che lo
mantengono immutato per anni dopo l'infezione primaria (9, 10).
Per quanto riguarda l'effetto a lungo termine dell'infezione da HCV sulla situazione
clinica epatica, il dato più rilevante non sembra essere tanto la recidiva dell'infezione quanto il
genotipo che la caratterizza. Quando questo è di tipo II infatti (senza nessuna differenza se
dovuto ad una recidiva o ad una nuova infezione) la malattia epatica che si viene a creare è
molto spesso severa (Fig. l). Ad ~rnpio, di ventidue pazienti traPiantati che abbiamo seguito
per un tempo medio di 3 anni, 8 avevano un'infezione dopo il trapianto caratterizzata da un
genotipo II: tutti questi presentavano un'epatite cronica severa ed un di questi, dopo tre anni
127
dal primo trapianto, aveva già sviluppato una cirrosi epatica. Al contrario, dei 5 pazienti che
nel post-trapianto risultavano
anti~HCV
positivi ma con genotipo diverso dal Il, solo uno
aveva un'epatite cronica severa mentre gli altri non presentavano alterazioni epatiche rilevanti
(Fig. I) (6). Ancora migliore ·(e in accordo con quanto segnalato in letteratura) (Il) la
situazione epatica dei pazienti anti-HCV negativi prima del trapianto e che si sono solo
transitoriamente infettati dopo il trapianto: in questo piccolo sottogruppo, la sporadica
presenza di alterazioni epatiche era dovuta esclusivamente a complicanze di tipo colangitico e
non epatitico.
Nel complesso, quindi, l'infezione da HCV, soprattutto quando è caratterizzata da un
genotipo II, condiziona pesantemente l'esito a lungo termine del trapianto epatico. Ovviamente
questi dati suggeriscono alcune considerazioni di carattere generale: a) poiché il trapianto
epatico non è purtroppo una possibilità terapeutica disponibile per tutti i pazienti che ne
avrebbero necessità, nella decisione di chi mettere in lista di trapianto preferenziale dovrebbero
essere favoriti quei pazienti che hanno una malattia epatica non dowta aii'HCV, in quanto essi
hanno una possibilità di sopravvivenza a lungo termine sicuramente migliore dei pazienti antiHCV positivi; b) la genotipizzazione deli'HCV dovrebbe far parte dello screening pre-trapianto
ed i pazienti con genotipi diversi dal II dovrebbero essere considerati in prima istanza rispetto a
quelli infettati con genotipo Il
,
128
Figura l.
Caratterizzazione dei genotipi deii'HCV (valutati secondo la metodica di Okamoto
et al., 1992) prima e dopo il trapianto epatico in relazione con la diagnosi
istologica a tre anni dal trapianto.
Pre-Ull'
l Il
Gemtipo
N. 1.
2
3.
4.
5.,
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18
19.
20.
21.
22.
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ECA
ECA Moderata
ECA
ECA
ECA
ECA
ECA
Cirrosi*
Colangite
ECA
Fegato normale
ECA Moderata
ECA
Fegato normale
EC persistente
Colangrte
Colangite
ECA
Fegato normale
Fegato normale
Fegato normale
Fegato normale
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INTERFERON
IN
CHRONIC
HEPATITIS
C:
AN
EVALUATION
Of'
EFFECTIVENESS AND UNRESPONSIVENESS,
Antonio Craxi, Cristina Linea, Silvio Magrin
Istituto di Medicina Generale e Pneumologia, University of Palermo, c/o Divisione di Medicina
Interna, Ospedale V_ Cervello, Via Trabucco 180,90100 Palermo, Italy
lntroduction
lnterferons are a part of a complex network interacting with other regulatory factors,
such as cytokines and cellular growth factors, which serve as a defence mechanism against virai
infections The activity of a1pha-IFN against hepatitis C virus is due to a direct antiviral effect,
namely the induction of an antiviral state in the infected celi by enhancement of 2-5
oligoadenylate synthetase, protein Kinase P l, ribonuclease L activities. Immune recognition
and clearance ofvirus-infected cells is facilitated by IFN-induced enhancement of MHC class l
antigens expression on the hepatocytes, in association with virai proteins. IFN can modifY the
cellular
membrane,
thus
making
diffkult
the
release
of virìons_
Moreover,
the
immunomodulatory actlvity of IFN, causing activation of NK cells and macrophages and also
increased cytotoxic T celi function, is probably important in reducing the number of cells
harboring replicating virus_ These activities of IFN can be affected by many variables, related
t o the infected host. t o the virus and to the drug itself (Fig
l), mutuously influencing
themselves in a complex interplay.
Since the early pilot studies of alpha-interferon therapy for chronic non-A, non-B
hepatitis, an enonnous amount of experience on the use of interferons has accumulated
through uncontrolled and controlled studies. lnitial enthusiasm toward antiviral treatment with
IFN has however been progressively mitigated by the fact that not ali patients with chronic
hepatitis C respond to the drug, and that only a proportion ofresponders will mantain a longlasting benefit, hence being truly cured of the disease Review by metaanalysis of therapeutic
trials performed up t o 1991 ( 1) shows that 5O t o 600/o of ali patients with chronic hepatitis C
receiving IFN at a dosage
==
3 MU t.i.w. for at least six months reach norma! alanine
•
131
aminotransferase levels while on therapy. However half or more of these responders to IFN
rclapse to high AL T levels within a few months after stopping the drug, thus reducing the
Jong~term
response rate to
20~25%.
Retreatment of relapsers may obtain a new response,
usually followed again by relapse, in a substantial proportion of cases, while non-responders
Jre refractory to retreatment
Unsatisfactory results of IFN, and therefore the need fora better selection of patients to
be treated and of alternative approaches for non-responders. might be mitigated by a better
understanding of the mechanisms underlying the unresponsiveness to IFN_ In this review. we
..,hall reassess some of the available knowledge on the etfectiveness of IFN. in the light of the
posstble mechanisms of non-response.
llost-related factors
Slage of liver disease: The stage of liver disease is probably the most important tàctor m
Jetermining the response to IFN Two different points need t o be considered, 1 e. the degree of
tntlammatory activity and the amount of fibrosis_
Chronic HCV infection causes liver celi damage by both direct cytopathicity and
1mmune-mediated mechanisms (2). The relation between histological activity of liver disease
md likelihood of response is less clearcut than in chronic hepatitis B ( 3 ). Most studies in tàct
'>uggest that the effectiveness of IFN is similar in patients with chronic persistent and in those
with chronic active hepatitis.
Fibrosis is a hallmark in the natura! history of chromc hepatitis, signalling the evolution
roward cirrhosis Once severe tihrosis and cirrhotic nodules appear in the liver, the likelihood
1lf
response to lFN is diminished. AJmost ali large studies of prognostic tàctors tn chronic
hepatitis C (4-9) are actually concordant in establishing ctrrhosis as the single item most
predictive of non-response to IFN. The long-term response rate tn patients with cirrhosis can
he as low as 5% (4) Unresponsiveness could be due to the long time elapsed since tirst contact
·.vith the virus, but a/so to intèction with a more pathogenic and IFN-resistent strain of HCV
'Sdection of IFN-resistent virai mutants under the pressure of endogenous IFN is also
conceivably involved (IO, li)_ Vascular factors intrinstc to c1rrhosis might also conceivably
'-liter the biovatlability and pharmacokinetics of fFN A recent study (l 2) and preliminary data
132
(Asciane, Hepatology, 20, 294A, 1994} indicate that high serum levels of hyaluronate and of
laminin, both indicators of active collagen metabolism, are predictive of unresponsiveness to
IFN in chronic hepatitis C, independently from cirrhosis This suggests that increased collagen
deposition on the sinusoidal pole of hepatocyte might affect IFN tumover in the liver
Timing of infection: Chronic hepatitis C infection display a complex kinetics of events,
unfolding over many years with alternate phases of virai replication or quiescence and of
immune tolerance or clearance to an heterogeneous virai population (13). IFN is likely to be
more etfective when at the same time the immune mechanisms involved in virai clearance are
already activated and the replicative drive of the virus is failing
HCV infection of children is rare, due to the ineffectiveness of mother-to-child
transmission (14). Experience with treatment of pediatric HCV infection is hence limited. The
only published study (15) report an incidence ofnon-response similar to adults.
The length of time elapsed since primary infection at the moment of starting IFN treatment is
an important variable in determining response. The longer the virus has been in the host, the
higher is the JìkelihOod of selectìon of IFN-resistent virai strains. The probability of
development of cirrhosis, which is in itself a major determinant of non-response, is clearly
time-dependent. Long-term presence of virus-encoded proteins in the host might mantain and
enhance tolerogenic mechanisms in the immune System ( 16, 17) The effect of duration of
infection on non-response is quite clear for HCV. A recent study from our group (4) identifies.
besides the absence of cirrhosis, a short (lower than 24 months) disease duration as strongly
predictive of primary and long-term response t o IFN. In this study known hepatitis C infection
since over 60 months was associated to a low chance of normalizing aminotransferases.
independently from cirrhosis at multivariate analysis. This suggests that resistence to IFN,
when HCV infection has been present for a long time, is due both to virus-related factors
( selection of strains less sensitìve to IFN) and to cirrhosis itself
Race: Trials of IFN for chronic HCV infection in Orientai (mostly Japanese) patients show
rates of response comparable to those of Caucasians. Some inconsistencies in the response
rates can be attributed to the different pattern of infecting HCV types ( 18). Some Japanese
133
trials bave also used schedules of IFN administration which are not comparable for Iength and
dosage to Western studies.
Sex: No clear etfect of sex on the rate of response t o IFN in chronic hepatitis C is seen by
metaanalysis (l).
A.ssociated diseases:
I I:MMUNOSUPPRESSION· A sizable proportion of subjects with chronic hepatitis C are
coinfected by the human immunodeficiency virus (HIV). The drastica! reduction in CD4
lymphocytes in the advanced phase of HIV infection causes profound hyporesponsiveness t o
HCV-encoded proteins. The clinical expression, natura! course and response to antiviral
therapy are ditferent in the HIV infected subject who already has clinica! evidence of
immunosuppression. Virai interference can be important, in these patients often harboring
multiple infections, in determining loss of HBV, HDV or HCV replication (19). Ultimately the
prognosis and survival of the individuai patient are strictly related to HIV infection and t o the
degree ofimmunosuppression.
HCV-related chronic
liver disease,
albeit
also
linked
to
immunopathogenetic
mechanisms, is strictly dependent on direct virai cytotoxicity (2, 13). Chronic hepatitis C in
HIV infected subjects behaves similarly than in normally immunocompetent individuals. A
more severe course of disease has been reported (20, 21 ), and might be due to the lack of
mechanisms of containment of HCV infection. It is difficult however to assess in these very
sick patients the possible negative role of other cofactors. A summary of published results of
IFN therapy in these patients is presented in Table l The overall short-term response rate,
measured on ALT normalization, is 29%_ This compares unfavourably with the 50% response
rate (l) reported in non-HIV infected patients, but stili suggest some effect ofiFN. In fact, the
only study assessing long-term HCV-RNA loss reports disappearance of viraemia in 4/14 cases
(29%), showing that HCV clearance can be obtained also in immunosuppressed hosts. These
results are comparable to those obtained
in
subjects undergoing
immunosuppression after liver (22.23) or kidney transplantation (24-26).
pharmacological
!34
li. IRON OVERLOAD. lt has been recently reported that, in patients with chronic virai
hepatitis of any etiology, the hepatic iron content was almost twice in non-responders to IFN
therapy as compared to responders (27). The same study showed a weak correlation between
serum ferritin and hepatic iron leve!. Since iron is a necessary cofactor for DNA and RNA
synthesis, an excessive hepatocyte iron pool might facilitate the intracellular assembly of
virions. Phlebotomy has been proposed as a mean to enhance response to IFN by causing
depletion of liver iron. Clinica! experience is stili awaited. Results in subjects with massive iron
overload, such as polytransfused 13-thalassaemia patients with chronic hepatitis C, are
conflicting. Ali published studies (28-30) find a negative correlation between iron overload and
likelihood of biochemical and histological response. However, in the absence of cirrhosis, the
overall rate oflong-term success is similar to that obtained in non-thalassaemic subjects. This
shows that even in the presence of massive iron overload IFN can stili affect replication of
HCV.
III. AUTOIMMUNE PHENOMENA: Evidence of autoimmunity may coexist with chronic
virai hepatitis, more often with HCV or HDV than with HBV (31-35). While earlier studies
debated whether the presence of autoantibodies represented true autoimmunity or a secondary
response to infection, it is now clear that up t o 1O% with otherwise typical chronic hepatitis C
may bave serum autoantibodies at significant titres in serum, coexisting with active HCV
replication. These antibodies are mostly anti-liver/kidney microsomes (LKM), but sometimes
anti-nuclear. IFN therapy in these subjects has usually been avoided, on the basis of possible
reactivation ofunderlying autoimmune hepatitis. A small-scale study (F. Bianchi, unpublished)
actually reports ineffectiveness of IFN treatment in 6 patients with LKM-positive chronic
hepatitis C, with disease reactivation in 3 However in our experience (36) no significant
ditferences in the rate of response to IFN are observed when treating such patients. It is
conceivable that, among a vast majority of cases with "true" hepatitis C and secondary immune
phenomena, a few subjects with autoimmune hepatitis and associated HCV infection may hide
IV. CHOLESTASIS: Mild features of biochemical cholestasis are not uncommon in chronic
hepatitis C. These consist mostly in a raised gammaglutamyltransferase and alkalyne
•
135
phosphatase, without hyperbilirubinemia or symptoms. Bile duct damage and epithelioid
granulomas around biliary structures in the portai tract are often seen in liver biopsies from
patient with HCV-related liver disease (37). Cholestatic features and the presence ofbile duct
damage are variably related to HCV replicative levels (38-40).
Elevated levels of
gammaglutamyltransferase are predictive of a poor response to lFN {8,41,42), albeit less
strongly than cirrhosis or HCV-RNA level (4). Subjects with chronic hepatitis C and
cholestasis might be infected by a more resistent HCV strain. No association with a specitic
HCV genotype has been demonstrated. In these patients a moderate efficacy of
ursodexoycholic acid (UDCA) in normalizing liver tests and improving liver biopsy tèatures
has already been demonstrated (43,44) No convincing effect on HCV viraemia was however
found. Randornized trials exploring combined therapy with UDCA and IFN are under way.
Virus-related factors
Virai type: HCV is a highly heterogeneous virai agent, encompassing a range of different virai
types and subtypes (18,45,46). Many classifications of HCV types based on sequence
variations of different HCV region have been proposed. Thus, studies dealing with the
relationship between HCV type and response to IFN are not stnctly comparable, since ditferent
region of the HCV genome have been used for genotyping. Earlier studies mostly used
Okamoto's classification (47), while the most recent attempts of HCV classlfication ha ve been
perfOrmed on the 5' UTR region (48). The following comments relate to HCV dassitìcation
0ased on S' UTR. Differences in the pathogemcity of the various types of HCV have been
reported. Some studies show a higher prevalence of cirrhosis among subjects mtected with
type lb (49-51), but other workers (52) do not confirm this issue. Geographical heterogeneity
·.1f distribution of HCV infection ( 18, 53-55) might be partly respons1ble for discordance, since
the prevalence ofgenotypes supposed to be less pathogenic (types la, 2 and 3) is low in some
...:ountries (18, 53). The relationship between HCV type and response to IFN is also
.:ontroversial. In tàct, there is clear evidence that subjects infected with genotype l b responde
less well to lFN treatment than those infected by genotype l a, 2a or 3 (56-60) This ditference
1n response might be at least m part rel~ted to the leve! of pre-treatment viraemia and to the
'itage of liver d1sease (leve! of histological fibrosis and/or definite c1rrhosis). Studies assessing
136
clinica1 and virological variables of responsiveness to IFN have shown that pre-treatment
viraemia and cirrhosis are independent predictive factors of response to JFN_ However, there
are conflicting results for the inclusion of HCV type as an independent predictive factor. In
fact, the link betewen HCV type and response to IFN is more evident in some geographica!
areas where the infection is frequently due to HCV of non- I b genotype. In areas of high HCV
type 1 endemicity such as Southern Europe, the majority of responders to IFN are actually
infected by HCV type l (53,61), confinning that unresponsiveness of this virai type is a
relative, rather than absolute, phenomenon In these patients, typing of the virus in regions
other than the currently used 5' non coding terminus might disclose other virai (sub)types The
biologica! mechanisms linking a specific virai type to IFN responsiveness is currently unknown
Vira/ mutanls: Occurrence of virai mutation during chronic infection is a well-known
phenomenon for HCV (62-67). Mutations may exert a profound influence on virai replìcative
ability, pathogenicity and sensitivity to endogenous and exogenous antiviral actions
The infection may be due to a virai strain whose likelihood of responding to IFN
1s
already low at the time of starting therapy. Variations of the HCV quasispecies under IFN
therapy are known to occurr_ This is especially frequent in the hypervariable E2/NS l region
( 1O, 11 ), and seems to correlate both to reactivation ofliver disease and to IFN resistance.
Drug-related factors
Dosage and schedule of IfN: Patients with chronic hepatitis C usua1Jy receive alpha-IFN at
dose of3 MU t. i. w. for 6 months, according to the experience accumulated in the earlier trials
Since only o ne every four treated subjects obtain a sustained remission ( 1) an d at least another
one relapse after therapy, patients who respond and relapse may require retreatment. Efficacy
of retreatment in obtaining long-term remission is actually unknown. Some investigators
suggest that prolonged treatment ( up to 12 months or more) might reduce the relapse rate in
subjects obtaining complete ALT nonnalization (68). Our expe.rience in patients predominantly
infected by genotype 1b suggests that treatment with high doses of alpha-IFN over a brief
period (to tal dose of 420 MU in 6 months) is equivalent, in terms bot h of respOnse rate an d of
1)7
1lrevention of relapses, to a longer treatment period (total dose of 600 MU in 12 months)
(69,70). Prolonged interferon adrninistration to patients with chronic hepatitis C is poorly
.1ccepted and might favour drug resistance. A pulse~treatment schedule would be preterred for
,·ornpliance and costs. Preliminary evidence (71) suggests a comparable sustained response
'<1te The intermittent administration can be proposed no t only t o elicit a sustained biochemical
Uld virological remission but also to circumvent the development of drug resistance due,
c: g ,W selection of drug resistant strams or to drug adaptation and cven toxic1ty Alternative
tpproaches such as escalating dosages or weekly administration do not alter the likelihood of
espanse (72-75) Escalation ofthe dose mav achieve response in some non-responders
One of the earlv RCTs (76) showed that a low dose of alpba-IFN
(!
M() t t w)
!s
I!Iterior to a higher dose (3 MU t i w ) in promoting a decrease of hepatic necroinflammation
J'his was later contirmed by studies using dose-adjustment regimcns. where reduction of the
Jose at l MU often caused "breakthrough" ALT elevations (77)_ We recently compared the
results of trials pertòrmed at our lnstitution with Jifferent doses of alpha-IFN, and t()und a
,.:Jearcut dose-etfect relationship with a peak etfectiveness at a schedule of6 MUti w (78)
rl-pe of IFN: Recombinant ( alphaza or alphazb) and lymphoblast01d (al p han 1) mterferons have
fleeen used in most studies. Natura! human leukocyte (alphanJ) interteron
lS
also enecttve
!11
normalizing AL T in chronic hepalltis C ( 79) fhe resu!ts obtained w1th this kind of IFN are
::umlar to tlmt observed usmg ,!Jtferent IFN preparations ( 76,80.8 l)
A tnal companng
, ..::combinant .tlphazd. ,md lv mphl)blash1iJ ,tlphdn 1 ì FN l!Jd nut _,ho v. <tHV dJtlt:rence
Hl
the ra t~
,1t response or relapse l X2)
Beta-interteron has bcen used, ch1elly by Japanese mvesugators. rn chromc hepatJtts U
:md C (83)_ !t shou!d be administered on!y by intravcnous IOJCCUon, smce Jntramuscular ur
-;ubcutaneous injections Jo not grve Jetectab!e .:;erum levels
U~4)
Whcn th1s condition
JS
!"ultilled, the ettectiveness scems t o be comparable t o t ha t of alpha-IFN lntramuscu!ar 111JCCtJon
Jf heta-IFN was. m
,1
comparattve
~tudv
1btaming response in chronJC hepatltiS C
\VJth alpha2h or alphan1 lFN. rather mctlec!lve in
(}~))
!38
Anti-interjeron antibodies (anti-IFN): The appearance of anti-IFN antibodies has
been
documented in treated patients with chronic hepatitis B and C (86-91 ). The prevalence of such
antibodies, classified as neutralizing or non-neutralizing according to their abilìty to block the
biologica! effects of IFNs, is highly variable in published studies, ranging from 1 to 20 % in
relation to schedule of IFN and also to the assay used for their detection. When enzyme
immunoassays (EIA) and the antiviral neutralization bioassay (ANB) are compared, anti-IFN
antibodies occurr earlier by EIA t han by ANB. The higher sensitivity of the former test is
however counterbaJanced by the lack of clinical significance of non-neutralizing antibodies.
The latter are detected by EIA, but not by ANB, which discloses only blocking factors (i.e.
neutralizing antibodies).
The influence of IFN antibodies on the ther.apeutic effectiveness of IFN is stili
controversia!, and at least partly related to the discordance between assay systems. High titers
of anti-IFN antibodies seem to modulate the biologica! properties of IFN, reducing its antiviral
effect and immunomodulatory actions. Actual interference on the clinical course of infection
may depend from the timing of onset of the antibody response. In chronic hepatitis C
appearance of anti-IFN antibodies after ALT normalization is not associateci to a significant
loss of IFN effect. Anti-IFN antibodies bave also been included among the causes of AL T
elevation during IFN treatment (so-called breakthrough) when high titers are produced (90).
Breakthrough hepatitic reactivations are found in less than 5% of subjects with chronic
hepatitis C treated with doses ofOIFN
=
3 MU t.i.w_ Failure ofiFN therapy can be attributed
to anti-IFN antibodies only if the biochemical reactivation is concomitant with the appearance
ofantibodies (91).
Anti-IFN antibodies may bave a role in the failure of response to IFN both in patients
who show an initial response and in those who never respond to therapy. However only a small
minority of subjects who do no t respond have an ti-IFN antibodies, confinning t ha t blocking of
IFN actions occurs only in selected cases. Antibodies to IFN are on the other band found also
in patients with a complete and long-lasting response. Hence the appearance of anti-IFN
should not be considered as an indication to stop treatment, when otheJ;Wise effective.
•'
(j
139
Figura I. FACTORS lNFLUENCING THE EFFECTIVENESS OF INTERFERON IN
CHRONIC HEPATITIS C
------------------·
fabella I. CHRONIC HEPATITJS C IN HIV-INFECTED INDIVIDUALS IFN TRIALS'
t riai
pls
C04 status
SA'
ALT
40
~
2
78
~400
3
11
any
4
6
any
3
s
7
dny
5
6
14
2 400
5
7
12
any
4
OVERALL
161
200
$ Shor1· Term respor1se
• Long- TeiTTl response
• alfa-IFN ~ 3 MU 1.1 w tor ~ 6 months
1
2.
3.
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SR'
RNA
LA"
ALT
LA'
RNA
9
19
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3
3
4
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149
VALUTAZIONE DEL TRATTAMENTO A LUNGO TERMINE CON IFN
Giuseppe Visco, Evangelo .Boumis, Fabrizio Ferri, Maria Antonella Longo, Pasquale Noto,
Gianna Tossini, Mauro Zaccarelli.
Centro di Epatologia Ospedale "L. Spallanzani", Via Portuense 292-00149 Roma
Come è noto, i decreti di registrazione dei preparati a base di alfa-lFN, che risalgono
ormai ad alcuni anni or sono, indicavano in 6 mesi la durata prevista per il trattamento per
l'epatite cronica C (E.C.C.). Essi. inoltre, precisavano che, in caso di pazienti non responsivi,
dovesse essere presa in esame l'interruzione della terapia dopo 16 settimane di trattamento
e che l'esperienza in materia di ripetizione del trattamento era limitata. Si noti che la
risposta terapeutica viene ancora oggi espressa soltanto in termini di livelli di GPT_ [n
effetti, la ricerca del genoma virale deli'HCV (con la PCR o con altri metodi, oltretutto
piuttosto costosi), nonostante l'aiuto fornito alla conoscenza di questa malattia, ha un valore
soltanto complementare, non essendo di pratica utilità nella clinica: non lo è prima di
iniziare la terapia né per monitorizzare l'efficacia di questa né, infine, a fini prognostici (8).
In questi ultimi anni si sono avute però varie segnalazioni indicative di una possibile
maggiore efficacia di cicli di cura prolungati e/o ripetitivi Ci sembra quindi utile tentare una
messa a punto sullo "stato dell'arte" dell'argomento, finalizzata all'ottimizzazione della durata
dei trattamenti con lFN deii'E.C C
Nel 1989 Davis (l) e Di Bisceglie (2), con i loro studi
controllati avevano dimostrato r,he ridirli
~lfa-IFN
(a J MU x 317 gg) per 6 mesi consentono
la normalizzazione (per oltre l anno la c.d . .~uslained re:-.ponse [R.S.]) dei valori delle SGPT
in un quarto circa dei casi trattati_
Studi ulteriori hanno però segnalato che, prolungando i trattamenti fino a 12 mesi, le
percentuali di S. R. potevano salire dal 18,8 al27,7 (3) o dal29 a oltre il 50% (4)(5). Se pero
il fo/Jow-up dei pazienti era mantenuto per 3 anni, le S R. si riducevano poi a1 36% (6).
Si è quindi giunti alla conclusione che, quanto meno nei responders, il trattamento possa essere
mantenuto
per almeno 12-14 mesi (7)(8): soltanto, però, se a dosi piene, in quanto la
successiva riduzione della dose, dopo 1 primi 6 mesi, sembra tàvorire le recidive (9).
150
Resta però ancora da chiarire:
a) se. nei non-responders (N.R.), sia remunerativo protrarre il trattamento oltre
le lb
settimane di cura; b) se vi sia evidenza di vantaggi reali nel ritrattare i pazienti, già re.sponders
(R), che recidivano dopo la sospensione dell'IFN (8), c) come ci si debba comportare in quei
pazienti, inizialmente R, nei quali le GPT risalgono in corso di trattamento con IFN (c.d
hreakthrough (Bt.))
Esperienze personali
AHo scopo di fornire un contributo alla definizione di questi 3 punti, abbiamo esaminato
retrospettivamente le cartelle cliniche di n_ 1878 pazienti affetti da E.C.C. e sottoposti a
trattamento con IFN presso il nostro Centro, dal 1.1 O. 1984 al 30.9.1994
Criteri di selezione. Dal suddetto materiale sono stati scelti
1
pazienti che ottemperavano ai
requisiti riportati in tabella l. Nell'ambito di questi, abbiamo ulteriormente selezionato tutti
quelli ai quali era stato applicato il protocollo terapeutico attualmente vigente nel Centro,
consistente nelle alternative di seguito riportate ed anche riassunte in tabella 2.
1 Nei R.I.
(re~ponders
iniziali}, mantenimento della cura (stesso IFN, stesse dosi)
11 fino all2° mese di trattamento_ Questo protocollo è stato applicato fino al 1.6.1988 e.
successivamente
1.2. mantenimento del trattamento con IFN per oltre il 12° mese, nelle seguenti circostanze e
modalità·
l 2. l In caso di R.S., stesso IFN e stessa dose fino all2° mese di normalità delle GPT
l 2. 2. 1 ln caso di Bt., raddoppio della dose di lFN ----+
l 2.2.2 ----+Se N.R. ·cambio del tipo di alfa-IFN, sempre a dose doppia. ----+
1.2_2 3 ----+Se ancora N.R.· aumento della dose dell'IFN in uso. fino ad un massimo di 9-10
.
MU x 317 gg owero di 9-1 O MU/2 gg
1.2.2.4. Se RS. ma effetti collaterali così gravi da suggerire la sospensione dell'alfa-IFN.
passare al beta-IFN. 6 MU x3!7 gg
2 e 3. Nei NRJ (non responder!ì iniziali) e nelle RE •. passaggio al protocollo 1.2.2
151
I dati dei pazienti così selezionati sono stati analizzati e per Ciascuno è stata fatta una
valutazione finale, secondo i criteri riportati in tabella 3.
Risultati
Come risulta dalla figura l, applicando i criteri sopra riferiti sono stati ammessi allo
studio n. 218 pazienti trattati con IFN, di cui 29 per un massimo di 12 mesi (media 8.5), detti
gruppo C (controlli) e n. 189 per oltre 12 mesi (media 32.8) (gruppo T o testandi).
f ,a distribuzione delle diagnosi istologiche e del numero di IFN usati nei 218 pazienti sono
riportati nelle figure 2 e 3, mentre in tabella 4 vengono confrontate le caratteristiche
Jemografiche dei due gruppi (T e C), con la conferma della sostanziale omogeneità dei due
gruppi.
Nella figura 4 sono riportati i risultati terapeutici globali, mentre nelle Tabelle 5~ 8 i
"iuddetti risultati sono stati messi a reciproco contfonto, con analisi uni- e multivariata.
Discussione
l problemi ancora da risolvere per poter ottimizzare la durata dei trattamenti con
IFN sono, a nostro giudizio, i seguenti:
l) Se sia corretto interrompere la cura di una E.C.C, dopo soli 4 mesi nei N. R., senza aver
saggiato l'effetto di dosi più elevate dello stesso IFN, o di un altro tipo di IFN
Orbene, i dati ricavati dal nostro studio controllato ma retrospettivo sembrano, in merito.
'
fornire indicazione sul fatto che il prolungamento della cura, m una con l'utilizzazione
consecutiva di più tipi di IFN, può portare a un aumento significativo delle R. S.
E' pur vero che nel medesimo studio i risultati erano apparentemente meno brillanti ne1
pazienti trattati con più tipi di IFN, ma si tratta di un dato chiaramente deformato dal fatto
..:he proprio nei pazienti più resistenti erano stati usati più tipi di IFN.
2) Se esistano reali vantaggi, e quali, nel protrarre il trattamento con IFN da l a 2, 3 o p1ù
anm.
!52
Come abbiamo già detto, anche sotto questo aspetto sia i dati della letteratura (Il, 12) che
le nostre esperienze ( 13) sembrano fornire indicazioni positive.
3) Se esistano reali vantaggi, e quali, nel modificare, nell'uno o nell'altro senso, il dosaggio
deli'IFN in corso di trattamento, e cioè
a)
iniziando con dosi basse e raggiungendo gradualmente quelle di mantenimento_
Da questo punto di vista il nostro studio non fornisce risposta ma, in un recente
convegno ( 14 ), si è giunti alla conclusione che questa modalità di cura sia accettabile
soltanto nel trattamento dei pazienti che hanno anche una cirrosi epatica, che potrebbe
scompensars1
b) iniziando con dose piena e riducendole in seguito. Non abbiamo espenenza
personale in merito, dato che il nostro protocoilo non prevedeva questo indirizzo e la
letteratura non sembra orientata in tal senso (9). Peraltro, sempre nella citata
Conferenza (14) sono state portate anche varie segnalazioni favorevoli
c)
iniziando con dose piena ed aumentando in caso di non completo successo Qui
l'applicazione del nostro protocollo sembra essere stata vantaggiosa, in quanto (Tabb.
7, 8) il rischio di ottenere una risposta negativa dalla cura è significativamente più basso
nei pazienti trattati per oltre più di l anno e con dosi crescenti_
4) Se ci sia un vantaggio nel riprendere il trattamento con IFN in quei pazienti, già R., ricaduti
dopo la prima sospensione. Anche in questo campo le nostre esperienze sembrano fornire
una indicazioni positive.
5) Se esista uno spazio per il trattamento protratto con
~-IFN
nei pazienti intoJleranti
Esistono già numerosi contributi favorevoli a tale indirizzo. Anche una parte dei nostri
pazienti è stata trattata con questo protocollo (Tab. 2) ma i dati finora in nostro possesso
non consentono di giungere a conclusioni definitive
153
TABELLA l. Criteri iniziali di ammissione allo studio
l. Diagnosi clinica e biQPtica di eoatite cronica (attiva o persistente, con o senza cirrosi).
2. Sierologia positiva per HCV Ab (ELISA e RIBA)
3 Transaminasi GPT elevate (x almeno l ,5 i v.n.) per almeno 6 mesi, anche non
consecutivi.
4 Trattamento iniziale alfa-IFN (r2a, r2b, N· l, o N-3) 3 MU x 317 gg o 3 MU/2 gg x 16
settimane. (+ deflazacort 6mg + ranetidina 150mg p.o, con le prime 6 dosi di
IFN(!O))
5. Follow-yp oer almeno 2 anni, do oo la sospensione.
Protocollo terapeutico nell'E. C.C.
TABELLA 2
(su pazienti già selezionati in base alla Tab. l)
Gruppo RI.
RS
SE R.E
Trattamenti
Sosp.
mese
terapia
Tipo IFN
lu
al
12' Sosp. al 12'
di mese diR S.
Dose
+
-
o
stessi iniziali
+
-
+
-
o
stessi iniziali
-
l 2.2.1. +
-
-
o
stesso
doppia
-
+
+
+
1.2.2.3. +
12.2.4. +
2.
-
o
altro
doppia
-
-
-
o
stesso
tripla
-
+
+
o
beta- 6MUx3/7gg
o
-
o
l passa a
l 2.2
-
+
+
+
+
+
o
+
l passa a
1.2.2
-
+
i 1.2.1.
+
+
1222
3.
+
R.I.= GPT normalizzate entro
r
mese
R.S.= GPT sempre normali sotto trattamento
S.E.= effetti collaterali gravi
R. E.= risalita GPT per oltre 3 mesi, dopo la sospensione
-
.,
154
TABELLA 3 -Criteri di valutazione dei risultati
f-'-'-"Ri::'.s""oco,st,a"n"u"ll"'~'-"(rNl_:L:='--"m"a'"n"ca,t.,a-'n"o"rm:c.ea1,iz,zeea"-zi,o:cn"e~G,.,P_T,__ _ _ _ _ _ _ J
"---1
f'2c_.2Ri~·IS~SP;c<o"'s~ta'J'o~arrz~ii!Ja1~e.l.(IP!.Z~Oc=.J.re.,.c"'ideoi"'va'è"'di'..!e~p1at~it'=e-l"
( IR,c.E'e::·:.!..'
)n.,eleJDgowll
!
o~w~-;\u~
~3~.~R,,~·sEpco~s~t.ea.J.to~t~a~le~(~T~)=~It~S~.fi~In"'o~al~t"'e~rm~in"'e-'d"e-'l~fo~l~logw~-~u~P-_ _ _ _ _ j
TABELLA 4
Caratteristiche demoj!,rafiche
'
12 mesi (n. 29)
> 12 mesi (n. 189)
'
_l
23(793%)
127 (67 2 %)
Epatite cronica evolutiva
4(138%)
25 (13 2%)
''
Cirrosi attiva
2 (6 9 %)
37(197%)
!
Unico tipo di IFN
22 (75.9 %)
54 (28 5 %)
.l
Più tipi di IFN
7(24.1%)
115(714%)
i'
Maschi
17(58.6%)
112(593%)
l
Femmine
12(414%)
77 (40_7 %)
Età media
50.3 (27-70).
Epatite cronica attiva
ls15(25-721
'
155
TABELLA 5
1v
1
. bT
ana
11
Analisi univariata per pazienti con risposta nulla verso risposta parziale
ototaea
l d a lmeno un anno d a Ila sospens1one d el trattamento con IFN
Odds Ratìo* l1c 95%
lP
'
' Di'!lf_no.-.,i istoloJ!ica
i' Epatite cronica attiva
IO
: Epatite cronica evolutiva
l 6
0.6-4.4
0.9
o 3-2 5
NS
NS
o 6-5 4
NS
i
0.01
l
!
1
Cirrosi attiva
l
l
i
·. Ourata trattamento
i
!2 mesi
-
IO
18
12 mesi
' l FN u.<ìato
l
o
[}nico tipo di IFN
l
Più tipi di IFN
l 5
l 1-2 2
* Probabilità di presentare risposta nulla nspetto a parztale o completa.
6 Analisi univariata per pazienti con risposta parziale o mdlt1 verso
nsposta total e a d a l meno un anno da Il a sospensmne d el t ra tt amen t o con IFN
. Variabili
Odds Ratio* l1c 95%
lP
fAB~LLA
'
l
, IJùlf(nw•i ;.-.tologica
~E patite
o
Il o
cronica attiva
'l
l
' Epatite cronica evolutiva
! _Cirrosi
'
attiva
-
----·-
-------
----
!2 9
'
'
l
i 0.4-2.6
l 0.9~85
NS
NS
---
!
: Durata franamento
) ·12mesi
IO
!•
l 8
12 mesi
: IFN u.vato
!
1Unico tipo di IFN
) Più tip1 di lFN
0.5-6 6
NS
l 7-4 4
<o 001
IO
12 7
., Probabilita di presentare risposta purziale o nulla rispetto a completa.
156
TABELLA 7
Analisi multivariata per pazienti con risposta nulla veno risposta
paniale o totale.
l Odds Ratio•
Variabili
IC95%
]l'_
Epatite cronica evolutiva
1.7
0.6-4.4
Cirrosi attiva
0.8
0.2-2.3
NS
NS
12 mesi
3.4
1.0-11.3
0.04
1.8
1.2-2.7
0.004
~
Più tipi di IFN
* Probabilità di presentare risposta nulla rispetto a parziale o completa_
TABELLA 8
Analisi multivariata per pazienti con risposta earziale o nulla verso
risposta totale.
Variabili
l Odds Ratio•
IIc 95%
lP
Epatite cronica evolutiva
0.9
0.1-0.9
Cirrosi attiva
2.2
0.3-2.4
NS
NS
.s 12 mesi
4.5
1.2-16.9
0.02
< 0.001
3 .l
1.8-5.1
Più tipi di IFN
* Probabilità di presentare risposta parziale o nulla rispetto a completa_
157
Figura l. Distribuzione dei pazienti per durata di trattamento (218 pazienti)
. .--.'.
.
--
·----------
IO
media 32.8 mesi
o
--
1--
medi1 8.5 mesi
l
o
'•o
o
:
...
< 12
ll-11
IJ.U
Js..JO
>li
mal di trattamento
Figura l. Distribuzione delle diagnosi istologicbe all'inizio deUa terapia (218 pazienti)
Cirrosi aWw 39
EC evolutiva 19
17.9%
13.3%
~...,_~--~-
ECA ISO
68.8%
Figura 3. Distribuzione dei pazienti gruppo T per numero di tipi di IFN somministrati
durante il trattamento (189 pazienti)
l tipi diiFN
4 dpl di IFN
26•.. 1:_·~,.~--~.~
7.8-to
l tipo diiFN
:zt.7•t.
l tipi diiFN
44.4%
!58
Figura 4. Distribuzione dei pazienti per risposta clinica ad almeno un anno dalla
sospensione del trattamento (218 pazienti)
Risposti! totale 48
Risposta nulla 32
14. 7°/o
Rlsposla parzJalt 138
63.3°/o
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160
FATTORI PREDITfiVI DI RISPOSTA ALL'INTERFERONE NELL'EPATITE
CRONICA DA HCV.
Alfredo Al berti, Liliana Chemello, Patrizia Pontisso.
Clinica Medica II, Università di Padova, via Giustiniani, 2 - Padova
L'epatite cronica da virus C è malattia spesso asintomatica, ma che può avere decorso
subdolo ed evolvere in cirrosi in una percentuale significativa di pazienti. L'evoluzione è lenta,
awiene in genere nell'arco di 15-20 anni, e non esistono elementi predittivi certi capaci di
identificare con soddisfacente specificità e sensibilità i pazienti destinati ad esito sfavorevole e
distinguerli da quei casi nei quali l'infezione cronica non si complica con patologia epatica
clinicamente significativa. D'altra parte i pazienti asintomatici portatori dì infezione cronica da
HCV rappresentano una riserva di infezione per la comunità e sono molto probabilmente
importanti fonti di diffusione della malattia. Queste considerazioni sono la base razionale della
intensa attività di ricerche sperimentali e cliniche condotte negli ultimi anni allo scopo di
definire interventi preventivi e terapeutici efficaci al controllo dell'epatite da HCV.
Dal punto di vista terapeutico gli interferoni, ed in particolare l'interferone alfa, si sono
dimostrati efficaci nel trattamento dell'epatite cronica da HCV. Sfortunatamente, solo la metà
circa dei pazienti risponde con completa scomparsa dell'attività di malattia, e una percentuale
ancora minore dimostra efficace soppressione dell'attività virate, ed in molti pazienti la malattia
riprende vigore subito dopo la sospensione della terapia. Questi risultati, ancora deludenti in
termini di reale efficacia clinica del trattamento interferonico, sono ottenuti con una
controparte di costi senz'altro elevati e di effetti collaterali frequenti, spesso fastidiosi e talvolta
anche pericolosi per la salute del paziente.
In questi ultimi anni quindi gli sforzi maggiori sono stati concentrati da un lato sullo
studio dei fattori predittivi capaci di identificare i pazienti con epatite C suscettibili di cura
radicale con interferone e dall'altro sulla ricerca di altri fartÌlaci eventualmente efficaci nei
pazienti non responsivi all'interferone.
161
Numerose variabili sono state descritte associarsi ai diversi tipi di risposta all'interferone.
L'approccio utilizzato nei vari studi è stato essenzialmente quello dell'analisi univariata eJo
multivariata dei fattori
pred~ttivi
ampie casistiche, in genere
in
nell'ambito di numerosi parametri pretrattatamento valutati su
studi clinici condotti per valutare l'efficacia dell'interferone alfa
nel trattamento dell'epatite cronica da HCV. Il significato, ed anche alcuni limiti interpretativi,
di questi approcci metodologici sono stati recentemente focalizzati da Davis (l).
La maggior parte degli studi ha preso in considerazione innanzitutto le variabili associate
a risposta primaria aWinterferone, owero al realizzarsi di una risposta in terapia, con
normalizzazione completa delle transaminasi ed eventualmente scomparsa di HCV-RNA nel
siero, indipendentemente dal fatto che la risposta fosse poi mantenuta dopo sospensione della
terapia. Altri studi hanno invece valutato i fattori predittivi di risposta più a lungo termine.
analizzando quelli che si associano a risposta sostenuta, ovvero che si mantiene anche dopo
sospensione della terapia presupponendo una possibile guarigione definitiva dall'epatite C con
eradicazione della infezione, nonché quei fattori che si associano a risposta transitoria seguita
da ricaduta di malattia dopo sospensione dell'interferone e a non risposta, ovvero ad un
mancato effetto significativo della terapia sia durante che dopò il ciclo di trattamento. Sono
state identificate variabili di tipo clinico, così come fattori di tipo virologico, associati ai diversi
profili di risposta ed eventualmente utili nel fornire una previsione attendibile sull'esito del
trattamento. Altri studi, infine, sono stati dedicati all'analisi di modificazioni precoci in corso di
terapia che possono essere utilizzati per predire eventi più tardivi, quali l'efficacia a lungo
termine del trattamento.
Le variabili pre-terapia identificate nei vari studi come associate a risposta completa sono
riassunte nella tabella l. Come si può evincere da questa tabella, si sono dimostrati associati a
risposta all'interferone numerose variabili demografiche, cliniche e di laboratorio caratteristiche
del paziente, così come alcune variabili più strettamente connesse con ragente infettivo.
Ovviamente i dati hanno dimostrato una notevole variabilità, con differenze da studio a studio
alquanto significative, conseguenza soprattutto dal fatto che spesso le casistiche analizzate
differivano in modo sostanziale per tipologia di pazienti e stadio di malattia, così come per il
tipo e dosi di IFN utilizzate.
162
Anche noi abbiamo di recente studiato con analisi univariata e multivariata i principali
fattori predittivi di risposta all'interferone nell'epatite cronica da HCV (12; 13).
Sono stati analizzati i dati relativi a 481 pazienti consecutivi trattati m 3 studi
randomizzati condotti fra il 1988 ed il 1993. I criteri di inclusione ed esclusione erano identici
per i tre studi e i trattamenti previsti variavano da un ciclo convenzionale di 6 mesi di
intetferone alfa somministrato alla dose di 3 MU per 3 volte alla settimana a cicli più aggressivi
con dosi iniziali di 6 MU e prolungamento del trattamento sino a 12 mesi La dose totale di
interferone somministrata variava quindi fra 240 e 620 MU. Tutti i pazienti sono stati osservati
per almeno 12 mesi dopo la sospensione della terapia rendendo così possibile una
classificazione in 3 gruppi di risposta:
l)
Risposta sostenuta a lungo termine, con normalità-delle transaminasi mantenuta sino a 12
mesi dalla sospensione della terapia.
2)
Risposta trasitoria, con normalizzazione delle transaminasi durante il trattamento e
riattivazione di malattia dopo la sospensione dell'interferone
3)
Assenza di risposta significativa, ovvero assenza di normalizzazione delle transamìnasi
durante la terapia.
Le tabelle 2 e 3 descrivono le variabili che sono state ritrovate associate con la risposta
tipo l e tipo 3 nell'analisi univariata. Questa analisi non prevedeva la valutazione dei livelli
basali di viremia dal momento che questo parametro è stato valutato solo in un sottogruppo di
pazienti, dati gli elevati costi della metodica. Anche nella nostra esperienza, come in numerosi
altri contributi della letteratura, bassi livelli di HCV-RNA sono risultati associati a riposta
sostenuta mentre i livelli più elevati si sono osservati nei pazienti senza risposta.
Per meglio definire il valore predittivo dei diversi parametri esplorati, è stata quindi
eseguita un'analisi multivariata per ogni tipo di risposta alla terapia. In questa valutazione, la
variabile più significativa a livello statistico nel predirne la risposta tipo l è risultato il genotipo
virale, con risposta sostenuta significativamente più elevata per i genotipi HCV-3 e HCV-2a
rispetto al genotipo HCV-lb. Altre variabili risultate associate alla risposta tipo l erano la
durata di malattia e l'età di paziente, così come l'uso degli schemi" .di trattamento più aggressivi.
Per quanto concerne la risposta tipo 2, le variabili associate sono risultate le seguenti: durata di
malattia, infezione da HCV-lb, e sesso femminile, mentre la risposta tipo 3 risultava
163
dipendente dai livelli basali di GGT, dal peso corporeo e dall'uso dei dosaggi
mtnlffil
di
interferone. E' da notare che in queste analisi i livelli basali di transaminasi e soprattutto il
quadro istologico pre-terapia non sono risultati parametri significativi per quanto concerne una
associazione con la risposta all'interferone. I pazienti cirrotici dimostravano anche nel nostro
studio, come in molte aJtre analisi, una ridotta risposta alla terapia ma ciò è risultato evidente
solo neWanalisi univariata mentre neWanalisi multiva[iata la cirrosi usciva dal gruppo delle
variabili significative in quanto colineare ma meno potente del rilievo di GGT elevate.
Sulla base dei risultati dell'analisi multivariata e del diverso "peso" statistico delle diverse
variabili ritrovate significative, è stato possibile elaborare una semplice formula per calcolare
l'indice predittivo di risposta alla terapia in pazienti con epatite cronica da HCV (Tab_ 4)_
L'indice predittivo è stato quindi valutato in una casistica di 170 pazienti trattati con
intertèrone per epatite cronica C ma non utilizzati per il calcolo dell'indice. E' stata così
evidenziata una discreta linearità fra indice prognostico e probabilità di risposta alla terapia,
che variava dallo 0-5% in pazienti con indice inferiore a 2 sino al 60-80% nei casi con indice
superiore a 4 .5. La validazione prospettica dell'indice predittivo è attualmente oggetto di uno
studio multicentrico.
E' interessante notare come la maggioranza dei pazienti con c1rros1 da no1 osservati
ottenevano un indice predittivo basso, motivato soprattutto dall'età spesso avanzata, dalla
prevalenza di genotipo HCV-Ib e dai livelli elevati di GGT e si collocavano quindi nell'ambito
rlei pazienti con minor probabilità di risposta alla terapia.
A fianco dei parametri utilizzabili per una valutazione pre-terapia delle probabilità di
risposta all'interferone, dati di notevole interesse applicativo derivano anche da quegli studi che
hanno valutato le modificazioni precoci delle transaminasi e della viremia in corso di terapia
allo scopo di utilizzarli come marcatori predittivi di risposta a lungo termine_ In quest'ambito.
una precoce nonnalizzazione delle transaminasi (2), la scomparsa di HCV -RNA dal siero e dal
fegato (14) sono risultati associati ad aumentata probabilità di sviluppare una risposta che si
mantiene anche dopo sospensione delrinterferone.
Il dato più interessante dal punto di vista pratico è senz'altro quello relativo al rilievo,
confermato da più studi, che la normalizzazione precoce delle transaminasi è correlata ad una
più elevata probabilità di una risposta che si mantiene anche dopo sospensione del trattamento
164
Questo parametro, nella nostra esperienza, dimostra senza dubbio elevata sensibilità, ma
specificità appena soddisfacente, mentre meno solido appare il valore predittivo della
scomparsa di HCV-RNA dal siero in corso di terapia. Nei pazienti che dimostrano
normalizzazione delle transaminasi in corso di terapia la persistenza di positività sierica per
HCV-RNA è senz'altro predittiva di
riattivazione della malattia dopo
sospensiOne
dell'interferone ma la scomparsa di HCV-RNA dimostra scarsa efficacia predittiva.
I risultati sin qui ottenuti hanno quindi permesso di identificare numerosi parametri utili
per predire la risposta alla terapia interferonica in pazienti con epatite cronica da HCV.
Ulteriori studi sono peraltro necessari per definire la loro validità nell'ambito prospettico e il
modo più razionale di un loro impiego nell'approccio clinico al singolo paziente, tenendo conto
anche degli aspetti etici e dei costi della terapia.
Tabella l: Fattori
pre~terapia
associati a risposta completa al trattamento interferonico
nell'epatite cronica da HCV.
Analisi
Univariata
Autore
Fattori associati a risposta
Davis (2)
Dose di IFN, peso corporeo, istologia
Weiland (3)
Peso corporeo, durata malattia, istologia
Causse (4)
Sesso femminile, età, istologia
Serfaty (5)
Età, storia di tossicodipendenza, AST,
bilirubina, carico di Fe
Multivariata
V an Thiel (6)
Carico di Fe
Okada (7)
Genotipo HCV
Kobayashi (8)
Livelli di viremia
Davis (2)
Peso corporeo, istologia
Perez (9)
Istologia, ferritina
Serfaty (5)
GGT. sali biliari, RIBA
Tsurbata (l O)
Genotipo HCV
Hagiwara (Il)
Livelli di viremia
~··
165
Tabella 2:
variabili associate a risposta sostenuta a lungo termine (analisi univariata)
Variabile
p
Dose IFN
0.002
Età
0.002
Durata di malattia
0.002
GGT basali
0.0001
Genotipo HCV-2
0.0001
Genotipo HCV-3
0.0001
ALT basali
ns
AST basali
ns
Sesso
ns
Peso corporeo
ns
Istologia epatica
ns
Profilo anti-HCV (RIBA)
ns
Tabella 3:
Variabili associate a non risposta all'interferone (anaJisi univariata).
Variabile
p
Dose IFN
0.05
Età
Peso corporeo
Cirrosi
GGTbasale
0.002
0.05
0.006
0.0001
Sesso
ns
Durata di malattia
ns
ALT basali
ns
AST basali
ns
Profilo anti-HCV (RIBA)
ns
166
Tabella 4:
Indice prognostico per predirre la probabilità di risposta sostenuta alla terapia
interferonica nell'epatite cronica da HCV.
Variabile
sco re
A) Età <45 anni
4
<45 anni
2
B) Durata di malattia
<36 mesi
5
36-120 mesi
3
>120mesi
C) Genotipo HCV
HCV-3
8
HCV-2
5
HCV-1
2
D) HCV-RNA (Keq/ml)
<3.000
6
3.000-6.000
3
>6.000
o
E) GGT normale
4
elevato
Indice prognostico = A + B + C + D + E
5
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168
TERAPIA CON INTERFERONE NEI "CASI DIFFICILI"
Evangelista Sagnelli, Francesca Maria Felaco, Lucia Aprea, Vincenzo Messina, Felice
Piccinino.
Istituto di Malattie Tropicali, II Università di Napoli
Numerose e di diverso ordine sono le situazioni cliniche che rendono "difficile" la terapia
delle epatiti croniche con a lnterferone (a-IFN). Alcune situazioni sono relative allo stadio
della malattia, all'età del paziente ed alla concomitanza di malattie associate, che potrebbero
rappresentare controindicazioni all'uso del farmaco.
Per quanto concerne le malattie associate va precisato che psicosi e malattie autoimmuni
(epatiti, tiroiditi, etc.) rappresentano controindicazione assoluta alla terapia. Altre patologic,
quale l'epilessia, turbe psichiche minori, modificazione della conduzione intracardiaca,
l'ipertiroidismo ed il diabete mellito, non necessariamente escludono la terapia con a-IFN, in
caso di documentata indicazione al trattamento, sempre si raggiunge un controllo stabile di
queste patologie con terapia appropriata.
Sono infatti stati trattati nel nostro Istituto numerosi pazienti i quali presentavano tali
situazioni e nella maggioranza dei casi è stato possibile ultimare il trattamento con variazioni di
dosaggio di a-IFN, resesi di volta in volta necessarie, controllando contemporaneamente il
compenso farmacologico della malattia associata. Per i pazienti con epilessia è indispensabile
sia il monitoraggio dei livelli ematici dei farmaci specifici per essere certi dell'efficacia
terapeutica nella prevenzione dei sintomi, sia il controllo elettreoencefalografico.
La terapia con a-IFN è stata inoltre possibile in pazienti con ipertiroidismo, monitorando
attentamente la funzione tiroidea ed adeguando la terapia specifica, e nei diabetici nei quali non
si è mai osservato una diretta interferenza dell'a-IFN sui livelli di glicemia.
Abbiamo inoltre osservato· sviluppo di ipotiroidismo co~ segni clinici di malattia, in corso
di terapia con a-IFN in una paziente. Tale terapia è stata prontamente sospesa e la funzione
tiroidea corretta con terapia sostitutiva; per la notevole severità dell'attività istologica della
169
malattia epatica, prevto parere favorevole dell'endocrinologo, la terapia con a.-lFN è stata
ripresa, ottenendo remissione completa della transaminasi. Nonostante il successo della terapia
con a.-IFN, riteniamo ancora, che l'ipertiroidismo preesistente o comparso in corso di terapia
con a.-IFN sia comunque una controindicazione a tale terapia, fino a quando non si avranno
evidenze positive più numerose.
L'età dei pazienti non è considerata in assoluto come una variabile in grado di
determinare l'ammissione al trattamento con a.-IFN, anche se la maggior parte degli studi
controllati non include pazienti al di sopra dei 65 anni o al di sotto dei 6 anni.
Nei bambini il farmaco è ben tollerato, anche se in alcuni casi può persistere febbre per
lunghi periodi e più frequentemente negli adulti può insorgere neutropenia, limitazioni per il
proseguimento della terapia.
Non abbiamo trattato numerosi pazienti con più di 65 anm, m presenza di attività
istologica ed in buone condizioni generali, ed il farmaco è stato in genere ben tollerato.
La presenza di cirrosi è un altro fattore che può far considerare un paziente come un
"caso difficile". E' noto infatti che la presenza di cirrosi rende irrealizzabile lo scopo principale
della terapia con a.-IFN e cioè la prevenzione di questo esito è che, quindi, in questi casi la
terapia si propone solo di ridurre o abolire l'eventuale attività istologica, anche se non è stato
ancora chiarito se ciò sia di reale giovamento. E' riportato in letteratura che la percentuale di
risposta alla terapia nei pazienti con cirrosi è inferiore rispetto a quella osservata in quelli senza
cirrosi e che si assiste nei pazienti definiti responders a frequente riattivazione dopo
sospensione del trattamento. Inoltre i pazienti con cirrosi spesso presentano marcata
leucopiastrinopenia, preesistente o in corso di terapia e ciò obbliga spesso ad utilizzare dosaggi
più bassi di quelli in genere praticati e quindi meno attivi. La nostra casistica comprende 135
pazienti con cirrosi anti-HCV positivi in stadio A di Child. Di questi 48 sono stati trattati con
a.-IFN alla dose di 3 MU tre volte a settimana e 69 alla dose di 1,5 MU tre volte a settimana.
Nel gruppo dei 48 con dose di 3 MU la diagnosi era istologica in 42, mentre per 39 dei
69 trattati con dose di 1,5 MU la diagnosi di cirrosi era possibile senza biopsia, più spesso per
piastrinopenia che a volte controindicava la biopsia stessa. Conseguentemente il gruppo di
pazienti trattati con dose di l, 5 MU includeva un cospicuo numero di pazienti con malattia un
pd più avanzata. Tutti i pazienti con cirrosi inclusi nel nostro studio presentavano elevati valori
170
di transaminasi (3-15 volte i valori normali, mediana 6) condizioni da noi stabilite, per
l'ammissione al trattamento. Completa remissione delle transaminasi in corso di terapia è stata
osservata in 17 (35,4%) dei 48 pazienti trattati con dose di 1,5 MU. La terapia con dose di 3
MU era ugualmente efficace nei pazienti con età < SO anni ed in quelli di età > SO anni, mentre
tra i pazienti trattati con dose di l ,5 MU la completa remissione delle transaminasi si è
osservata in l (6%) di 15 pazienti con età< 50 anni ed in 16 (29,6%) di 54 pazienti con età>
50 anni, una osservazione questa indicante che la dose ridotta può avere qualche efficacia nei
soggetti più anziani e forse osservati in una fase in cui l'attività della malattia tendeva aUa
remissione. Tra i pazienti con trattamento di 3 MU tre volte la settimana, quelli con
transaminasi iniziali> 5 volte i valori massimi normali (9/21 ""42,8%) più frequentemente di
quelli con valore più bassi (8/27 = 29,6%) hanno mostrato una completa remissione delle
transaminasi. Non si è invece osservata correlazione tra tipo di risposta alla terapia con a-IFN
e valori pre-trattamento delle transaminasi nei pazienti trattati con dose di l, 5 MU.
l dati di questo studio indicano la scarsa efficacia della somministrazione della dose di
l, 5 MU tre volte la settimana in pazienti con cirrosi . Va considerato tra le condizioni difficili
nella terapia con IFN la leucopiastrinopenia. Con neutrofili inferiori a 1000/mm3 e piastrine
inferiori a -SO.OOO/mm3 la terapia è controindicata e, se tali valori si osservano come
conseguenza della terapia, essa va sospesa. La leucopiastrinopenia è una costante nei pazienti
con cirrosi, tuttavia nella nostra casistica l'interferone solo raramente ha indotto una riduzione
tanto marcata da obbligarci a dimezzare la dose o a sospendere temporaneamente il farmaco
Oltre alle difficoltà sopra rappresentate, bisogna considerare che è spesso problematico
sospendere la terapia con a.-IFN in pazienti con cirrosi e buona risposta al trattamento poiché
la riattivazione è molto frequente e si è tentati a riprendere il trattamento ed a proseguirlo per
lunghi periodi. Sono quindi necessari studi controllati che includano anche pazienti non trattati,
per comprendere se la dose interferone 3 MU somministrata tre volte a settimana sia di utilità
per alcuni pazienti con cirrosi o se alla completa remissione delle transaminasi possa non
corrispondere un reale vantaggio in termini di soprawivenza.
171
Bibliografia:
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172
NUOVE PROSPETIIVE DI TERAPIA
Antonio Ascione, Giovan Giuseppe Di Costanzo
Fisiopatologia Epatica- Ospedale Cardarelli - Napoli
La terapia delle malattie epatiche croniche correlate al virus dell'epatite C (HCV) non è a
tutt'oggi soddisfacente. Infatti l'interferone (IFN}, unico farmaco correntemente usato nella
terapia di tali patologie, garantisce una risposta stabile in media nel 20-25% dei casi (l). Per il
sempre più diffuso uso delt'IFN, si è registrato un incremento del numero dei pazienti non alla
terapia e della spesa sanitaria, e tale problema rappresenta oggi un notevole peso umano e
sociale. Tra i motivi dell'insuccesso della terapia un ruolo fondamentale ha la incompleta
definizione delle cause e dei meccanismi di resistenza all'IFN. I fattori considerati sono
molteplici e possono essere classificati in:
a)
fattori correlati all'ospite (ad es: età e sesso del paziente, età della malattia, presenza di
cirrosi, anticorpi anti-IFN),
b) fattori correlati al virus (ad es: genotipo, carica virale),
c)
fattori correlati al farmaco (ad es: schedula terapeutica, tipo di IFN)_
Noi riteniamo che in molti casi l'insuccesso terapeutico sia determinato dalla
contemporanea presenza nello stesso paziente di più fattori Tale teoria fornisce un'interessante
chiave di lettura dei risultati emersi dagli studi pubblicati sull'argomento, potendone anche
giustificare le numerose divergenze
Il trattamento dei pazienti affetti da malattia epatica cronica da HCV e con recidiva alla
sospensione o non responder alla terapia con lFN rappresenta una delle principali sfide della
moderna epatologia.
Le possibili strategie terapeutiche finora esaminate possono essere
classificate in quattro gruppi.
l) differente schedula terapeutica con lo stesso tipo di IFN,
2) uso di un differente tipo di IFN;
3) terapia combinata con IFN più altri farmaci;
4) uso di antivirali da soli.
;
173
La prima scelta terapeutica è di solito impiegata in pazienti con recidiva più che in caso
di veri e propri non responders.
L'uso di un differente
ti~o
di IFN è l'alternativa finora più frequentemente impiegata.
migliori risultati sono stati Segna1ati con l'uso deii'IFN alfa linfoblastoide in pazienti
precedentemente trattati con altri tipi di IFN. Questo farmaco si è dimostrato in grado di
normalizzare i valori delle aminotransferasi in circa il l 0-20% dei casi, purtroppo è alto il
numero delle recidive alla sospensione del trattamento (2). l risultati preliminari di un nostro
studio ancora in corso sono incoraggianti: circa il 50% dei pazienti ha normalizzato le
aminotransferasi durante la terapia. Tuttavia è indispensabile una prolungata osservazione
prima di poter trarre conclusioni definitive.
Per quanto concerne la terapia combinata, è possibile selezionare tre tipi di farmaci da
associare all'IFN:
a) farmaci che aumentano gli effetti dell1FN;
b) fannaci con meccanismo d'azione differente dali'IFN;
c) antivirali.
Un interessante studio in vitro ha dimostrato che il blocco della ciclo- e della lipoossigenasi amplifica il segnale di trasduzione deii'IFN alfa (3). Pertanto la contemporanea
somministrazione di farmaci antiinfiammatori non steroidei dovrebbe teoricamente accentuare
gli effetti dell'IFN. In uno studio pilota abbiamo valutato l'uso del sulindac in combinazione con
I'IFN in non responder con malattia epatica cronica da HCV. Abbiamo pretèrito il sulindac
perché è un profarmaco che viene attivato nel fegato ed ha un recircolo entero-epatico, ha
un'alta biodisponibilità, una lunga emivita ed infine inibisce non solo 1a cicloossigenasi ma in
parte anche la lipoossigenasi. Senza interrompere la terapia con IFN abbiamo somministrato il
sulindac alla dose di 200mg l O e 4 ore prima dell'iniezione dell'IFN per un periodo di 3 mesi. In
tutti i pazienti abbiamo registrato un incremento della 2'-5' oligoadenilato-sintetasi, indice di
amplificazione del segnale di trasduzione deii'IFN, senza tuttavia ottenere la nonnalizzazione
dei valori delle aminotransferasi (4). Una possibile causa di resistenza all'IFN è il verificarsi di
uno stato proossidativo nelle cellule intèttate dall'HCV, che potrebbe facilitare la
perossidazione dei li pidi di membrana e danneggiare il genoma cellulare. Taie alterazione
sarebbe determinata da una riduzione dei livelli intracellulari di glutatione
ridotto ed un
174
aumento delrespressione della superossido dismutasi. La normalizzazione dei valori di
glutatione ridotto potrebbe favorire l'effetto deli'IFN. In uno studio pilota l'aggiunta a tale
citochina di N-acetii cisteina, un precursore del glutatione ridotto, alla dose di 1800 mg/die
determinò un aumento dei livelli di glutatione ridotto, una significativa inibizione della replica
virate intralinfocitaria e la normalizzazione dei livelli di aminotransferasi nel 41% dei pazienti
(5 ).
Anche per quel che riguarda i farmaci con meccanismo d'azione differente dall'IFN da
combinare ad esso le esperienze sono ancora preliminari Un fattore che, secondo noi, ha un
ruolo importante quale causa di resistenza alla terapia con IFN è rappresentato dalla fibrosi e
dalla destrutturazione epatica. Nella nostra esperienza livelli sierici del frammento Pl della
laminina (correlati con l'alterazione della struttura epatica e con un attivo turnover delle
membrane basali) maggiori o uguali a 2 U/ml sono predittivi di una maggiore resistenza alia
terapia con IFN (6). L'alterazione della matrice extracellulare può teoricamente ostacolare la
diffusione intraepatica del farmaco determinandone una riduzione dell'efficacia ed essere causa
della maggiore resistenza alla terapia che si osserva in caso di cirrosi epatica. Pertanto stiamo
attualmente sperimentando l'uso combinato deii'IFN e della colchicina onde sfruttare l'effetto
antiinfiammatorio ed antifibrotico di tale farmaco. In quest'ottica, l'introduzione in futuro
nell'impiego clinico di nuovi farmaci antifibrotici dotati di maggiore potenza e selettività
d'azione fornirà una nuova possibilità per verificare quest'approccio terapeutico alternativo. La
presenza atristologia di danno dei dotti biliari è stato da alcuni correlato ad una maggiore
probabilità di non risposta alla terapia con IFN. L'impiego della combinazione acido
ursodesossicolico ed IFN sembra ridurre il numero di pazienti con recidiva alla sospensione del
trattamento, ma tale dato è da considerarsi ancora preliminare (7).
Tra i farmaci antivirali la ribavirina è il farmaco più sperimentato da solo o in
combinazione nella terapia delle malattie epatiche croniche da HCV. E' un analogo
nucleotidico dotato di ampio spettro d'azione contro virus sia a RNA che a DNA (8) con
meccanismo non ancora completamente definito (9). In pazienti con epatite cronica da HCV si
è dimostrata in grado di ridurre significativamente i livelli di aininotransferasi e dell'RNA del
virus C nel siero dopo 3-6 mesi di trattamento (10-11). Tuttavia un problema è la ripresa quasi
costante deWattività citolitica e della replica virale alla sospensione del farmaco. I dati
i
175
preliminari di uno studio multicentrico europeo (Benelux) mostrano una buona efficacia della
terapia combinata con IFN e ribavirina in pazienti con epatite cronica da HCV non responder a
terapia con IFN. Viceversa la terapia con ribavirina da sola è risultata inefficace ( 12). L'uso
combinato della ribavirina e de!l'IFN alfa sembra avere un effetto sinergistico aumentando non
solo il numero delle risposte in corso di terapia ma soprattutto riducendo la frequenza di
recidive alla sospensione. Un effetto sinergistico dei due farmaci era stato precedentemente
segnalato in vitro ( 13). Ulteriori studi controllati con differenti schedule terapeutiche (in
particolare l'uso combinato con alfa IFN per un periodo più prolungato) sono indispensabili per
definire la reale utilità della ribavirina in questa patologia. Le prospettive future per una terapia
più efficace dell'infezione da HCV sono probabilmente rappresentate dalla scoperta di nuovi
farmaci antivirali diretti, dotati di una maggiore capacità di inibizione della replica di questo
virus, e dal perfezionamento della terapia genetica che, attraverso l'uso di oligonucleotidi
antisenso e di ribozimi antivirali, può diventare un presidio molto importante nella terapia delle
patologie epatiche da HCV.
In conclusione, la terapia dei pazienti con malattia epatica cronica da HCV si basa tuttora
in prima istanza sull'uso dell'IFN alfa. In pazienti non responder può essere utile una terapia
con IFN linfoblastoide . nel caso di trattamento precedente con altro tipo di IFN, o c_on IFN
combinato con ribavirina. La migliore comprensione dei fattori di resistenza aii'IFN consentirà
probabilmente in futuro di scegliere la terapia più efficace da adottare nel singolo paziente. Tra
i tàrmaci da combinare all'IFN per aumentarne la resa terapeutica, oltre gli antivirali diretti, i
più promettenti sono a nostro avviso gli antifibrotici e gli antiossidanti. Il futuro della terapia
dell'infezione da HCV è probabilmente rappresentato dalla scoperta di nuovi e più potenti
tàrmaci antivirali e dal perfezionamento della terapia genetica.
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177
INFEZIONE DA HCV: IMPLICAZIONI NELLA PRATICA TRASFUSIONALE
Giuseppe de Stasio
Servizio di Immunoematologia e Trasfusione, Ospedale "Di Venere", Bari
I risultati della sorveglianza dell'epatite acuta in Italia dimostrano che l'incidenza
dei casi di epatite NANB notificati è di 2-3 per 100.000 per anno, e che il 18 o/o dei casi
presenta una storia di trasfusioni di sangue (Mele 1990). Dal 1987 si è osservato in Italia
un leggero declino nell'incidenza dell'epatite NANB associata a trasfusione, declino che è
diventato più consistente nel 1990 e nel 1991, dopo l'introduzione dello screening antiHCV nelle strutture trasfusionali del Paese. Nel 1990 si è avuto un calo del 31 o/o rispetto
all989, e nell991 del67% rispetto ali990 (Mele 1993).
Per attribuire, però, con certezza un caso di epatite ad una pregressa trasfusione
bisogna
studiare
la
coppia
donatore/ricevente
per
escludere
''un'epatite
da
ospedalizzazione". Pazienti chirurgici che non avevano ricevuto trasfusioni di sangue
allogenico presentavano epatite nel2-3,3% dei casi (Stevens 1984, Aoki 1993).
La trasfusione di sangue anti-HCV positivo determina l'insorgenza dell'infezione da
HCV nella maggior parte dei riceventi (fino all'88%) (Esteban 1990, 1991, Van der Poel
1989,1991, Alter 1989, Barrera 1991). Le unità anti-HCV positive al test EIA di I
generazione e confermate con il RIBA 2 hanno fatto registrare un 93 % di
sieroconversioni, mentre quelle EIA reattive ma RIBA 2 negative solo l'Il % ( Aoki
1993).
Non tutti i soggetti anti-HCV positivi sono necessariamente infettanti (Alter 1989),
inoltre, l'epatite post-trasfusionale C può manifestarsi anche con la trasfusione di sangue
anti-HCV negativo (Esteban 1990). Quest'ultima evenienza potrebbe suggerire l'esistenza
di un altro agente eziologico (non-A, non-B, non-C) (Mosley 1990), ma spesso nei
riceventi di sangue anti-HCV negativo si registra una sieroconversione anti-HCV
178
(Barrera 1991 ). Il che testimonia che i test diagnostici attualmente in uso non hanno
ancora una sensibilità soddisfacente per lo screening dei donatori
Circa il 10 % dei pazienti infettati con HCV e con normale stato immunologico si
mostra persistentemente negativo all'anti-HCV, anche dopo follow-up prolungati (Alter
1993 ). Soggetti con disordini da immunodeficit possono non sieroconvertire affatto o
avere finestre di sieroconversione molto più lunghe di quelle che si osservano nei
soggetti con normale funzione immunologica
Una certa quota di donatori positivi al test ELISA anti-HCV non è implicata in casi
di epatite nel ricevente. Per discriminare i positivi infettanti da quelli non infettanti, era
stato suggerito di tener conto del rapporto di densità ottica del campione rispetto al
valore di cut-offELISA (V an del Poel 1990b) Un rapporto ELISA inferiore a 2,5 non si
accompagnava a nessun caso di epatite nel ricevente (V an der Poel 1990b ). In altri studi,
però, si sono avuti casi di epatite anche con rapporti di 1,5 (Barrera 1991)_
Il test di conferma RlBA aumenta la specificità dello screening. con una minima
perdita in sensibilità (Van der Poel 1990b, Ebeling 1990b). 31137 riceventi di sangue
RlBA positivo manifestavano epatite, contro 3/21 che avevano ricevuto sangue antiHCV positivo, RlBA negativo o indeterminato {Barrera 1991 ).
L'alta specificità della conferma con il RlBA ha fatto affermare a Van der Poel
(1991) che i donatori ELISA-positivi non specifici. cioè negativi alla conferma al RIBA
di Il generazione, possono essere riammessi alle donazioni_
La Associazione Americana delle Banche del Sangue ( AABB) e la Food and Dru~
Admini.o;tration (FDA) hanno proposto un algoritmo per la riammissione alla donazione
dei donatori con un test ELISA anti-HCV positivo (AABB Algorithm 1993, Holland
1993, FDA 1993) (Tab 2)
Secondo questo schema, il donatore ripetutamente reattivo al test di screening con
l'ELISA, deve essere rinviato definitivamente. L'unità raccolta va eliminata. A
discrezione della struttura trasfusionale, il donatore implicato-. può essere ulteriormente
valutato per un possibile rientro tra i donatori attivi_ Dopo sei mesi dalla prima
donazione, si ripete il test ELISA anti-HCV_ Se ripetutamente reattivo, il donatore è
'
179
escluso dalle donazioni in via definitiva. Se non è reattivo,
SI
esegue un test
supplementare. Con un risultato indeterminato o positivo del test supplementare, si rinvia
il donatore definitivamente: In presenza di un test supplementare negativo, il donatore
può essere riammesso alle donazioni.
Le raccomandazioni della FDA hanno ribadito la necessità di escludere dalle
donazioni i soggetti che nell'anno precedente la donazione abbiano avuto contatti stretti
con pazienti affetti da epatite virale o che abbiano ricevuto trasfusioni.
E' possibile che la conservazione a freddo nduca l'infettività dell'HCV. E' stato
segnalato da Van der Poel (1991 ), infatti, che un concentrato eritrocitario conservato per
28 giorni non causava infezione da HCV nel ricevente. Anche le emazie congelate
sembrano ridurre il rischio di trasmissione dell'HCV (Norol 1993).
Secondo ( 1992), il rischio residuo di trasmissione dell'H CV per unità di sangue
trasfuso (negativo ai test di II generazione) oscillerebbe tra 1/2000 (0,05 %) a 1!6000
(0,017 %).
Uno studio prospettico di Seef (1992) sulle conseguenze a distanza dell'infezione
da HCV non risolta ci offre qualche rassicurazione. Durante un jol/ow-11p medio di 18
anni, la mortalità in toto, dovuta ad ogni causa, dei riceventi di trasfusioni che avevano
contratto un'epatite acuta non-A, non-B era simile a quella di un gruppo di controllo di
soggetti trasfusi che non avevano contratto infezione. La mortalità, però, per malattia
epatica era più alta rispetto al gruppo di controllo. Questo studio confenna quanto già
noto, che l'intèzione da HCV cronica non presenta a breve termine una prognosi grave,
anche se la storia naturale dell'infezione da HCV non
e ancora completamente chiarita.
I test ELISA anti-HCV in commercio di III generazione presentano una magg10re
sensibilità e specificità rispetto a quelli di Il generazione, soprattutto per la migliore
reattività NS3 e non per l'aggiunta della NSS (Vernelen 1994). Per la sensibilità del test.
la scelta e la presentazione degli epitopi codificati da NS3 sembrano più importanti della
presenza dei peptidi NSS (Maisonneuve 1994). Anche se sono descritte rare conversioni
che iniziano con reattività isolate anti-NSS, in genere i donatori di sangue con questo
protìlo sierologico non sono viremici.
180
Gli studi di sequenziamento dei vari isolati virali mettono in evidenza un certa
eterogeneità virale dell'HCV, cui potrebbero corrispondere sierotipi non identificabili con
i test attualmente disponibili. Questa evenienza sembra fortunatamente poco probabile,
data l'alta omologia (97%) riscontrata a livello della regione del core virate.
L'HCV RNA è ri1evabile nel siero del paziente già dopo l settimana dalla
trasfusione e, comunque, 4-5 settimane prima della elevazione delle transaminasi (Farci
1991). La viremia persiste per meno di 4 mesi nei casi di epatite acuta che evolvono
verso la guarigione, mentre persiste per 10-14 anni nei pazienti con epatite cronica (Farci
1991). Durante la fase acuta dell'infezione primaria da HCV, v'è un periodo di diversi
mesi di sieronegatività, durante i quali I'HCV RNA è Punico marcatore diagnostico di
infezione. Il comportamento degli anticorpi contro i diversi peptidi HCV non si presta ad
un giudizio prognostico circa Jlevoluzione della malattia. Solo la ricerca dell'HCV-RNA
ha un valore prognostico. La clearance deli'HCV-RNA correla con la risoluzione della
malattia, mentre la persistenza predice una progressione verso una forma cronica di
epatite (Farci 1991). L'HCV RNA è un marcatore specifico e sensibile di malattia epatica
nei soggetti anti-HCV positivi, indipendentemente dai valori di ALT (Aiberti 1992).
L'anti-CIOO tende a scomparire (3-9) anni, mentre l'anti-C22 e l'anti-C33 scompaiono
meno frequentemente (20-40 % dei casi). In questi casi rimane da chiarire se si è di
fronte ad una infezione persistente o a guarigione. Nel 10-50% dei casi I'HCV RNA è
presente nel siero, il che deporrebbe per una cronicizzazione.
In uno studio sperimentale su scimpanzè con inoculazioni sequenziali l'anti-C l 00 e
l'anti-NSS ricomparivano nell'animale infettato una seconda volta in concomitanza della
ricomparsa della viremia, suggerendo quindi che questi anticorpi potrebbero essere
espressione di replicazione virale (Farci 1992). Gli stessi anticorpi scomparivano con la
perdita della viremia, mentre persistevano in animali con infezione cronica_
Episodi multipli distinti di epatite acuta NANB sono stati osservati ne1
tossicodipendenti (Mosley 1977), emofilici (Hruby 1978), o!l'odializzati (Galbraith 1979)
e talassemici (Lai 1994)
(
181
In uno studio condotto su tre pazienti talassemici, nel secondo episodio, che
compariva rispettivamente 48, 17 e 21 mesi dopo la risoluzione dell'infezione primaria, si
assisteva ad una ricompar9a della viremia. Questa in due casi era imputabile a reinfezione
con un ceppo HCV diverso (differenze nelle regioni E1-E2/NSI). in un altro a
riattivazione di un'infezione primaria o a reinfezione con un ceppo nuovo ma
strettamente correlato (Lai 1994). Queste osservazioni cliniche confermano quelle fatte
nello scimpanzè dalla Farci ( 1992), secondo le quali l'infezione da HCV non induce
immunità protettiva.
Dal punto di vista pratico, nello screening dei donatori di sangue è importante
seguire lo schema decisionale seguente:
Schema decisionale
Tabella l.
Elisa anti-HCV positivo
l
Controllo in doppio
l
Assenza di anti-HCV
+
+
+
Test di conferma di II generazione
l
Pos
- Distruzione dell'V.
- Notifica al donat.
- Esclusione definitiva
- Consulenza gastroenterologica
\
Ind
- Distruz. U.
- Monitoraggio del
donatore
Neg
- Distruzione cellule
- Possibile recupero plasma
x: emoderivati inattivati
- Nessuna notifica
====--===================--======================================
182
Se allo screening si ha un risultato positivo o border line (Rapporto DO
Camp.!Cut-off> 0,5), è consigliabile controllare in doppio la reattività del campione, per
poi procedere ad un test di conferma prima della notifica al donatore.
L'importanza dell'anamnesi del donatore come momento fondamentale per migliorare la
sicurezza della trasfusione è stata ribadita dal D.M. del 15/1/91 all'artJ. Nello stesso
articolo si richiama anche l'attenzione sull'obbligo di predisporre un questionario per
l'autoesclusione dei donatori con comportamenti a rischio di malattie trasmissibili con il
sangue_
Soprattutto nei pazienti chirurgici, l'incidenza di epatite può essere ulteriormente
ridotta diminuendo il volume del sangue trasfuso e facendo ricorso alle tecniche di
risparmio del
sangue omologo (autotrasfusione mediante predeposito,
recupero
perioperatorio, emodiluizione, misure farmacologiche per ridurre le perdite emorragiche.
fattori di crescita emopoietici).
E' stata studiata la profilassi dell'epatite post-trasfusionale NANB con la
somministrazione di immunoglobuline ai riceventi di trasfusioni di sangue, ma i risultati
sono stati insoddisfacenti e contraddittori. Alcuni studi hanno segnalato la possibilità che
certi lotti di preparazioni di immunoglobuline possano ridurre la percentuale di casi itteri
ci di epatite post-trasfusionale NANB (Seef 1981 ).
A partire dal 1985 la infettività virate dei plasmaderivati è stata attenuata mediante
trattamento al calore in ambiente secco, sotto forma di vapore, in fase liquida, ecc.
I concentrati commerciali di fattori della coagulazione vengono preparati da pool
di plasma proveniente da molte migliaia di donatori, fino a 20.000. Il pool comporta
come conseguenza una grossa contaminazione virate, anche laddove la prevalenza di un
certo virus nella popolazione di donatori è estreffiamente bassa.
In un anno, pazienti con forma grave di emofilia possono essere esposti ad l
milione di donatori (Aledort 1993). Per questo motivo, i dati di sieroprevalenza
dimostrano che la maggior parte degli emofilici presenta segn.i di epatite (Brettler 1990,
Schullman 1990). Fino al 70-90% degli emofilici ha ALT elevate e circa il 20% presenta
183
epatite cronica attiva e/o cirrosi documentate da biopsia (Spero 1978, Cedarbaum 1982,
Hay 1985).
Per preparare plasmf!.derivati sJcun, nel ciclo di produzione sono previste
procedure di inattivazione virate.
Sono stati sperimentati diversi metodi di inattivazione virale, tutti miranti a non
alterare l'attività biologica delle proteine plasmatiche.
La sterilizzazione dei plasmaderivati !abili mediante il riscaldamento del
prodotto finale liofilizzato nel contenitore finale (dry heating) ha il vantaggio della
semplicità, per cui potè essere introdotto in tutti i protocolli di produzione (Colombo
1985)
Tabella 2.
Algoritmo per una possibile namm1ssione alla donazione di donatori
falsamente positivi all'anti-HCV EIA
Reattivo aJI'EIA
l
T est di conferma
eseguito
l
l
Ind. o Reattivo
( ripetutamente)
\
Test di conferma non
eseguito
l
Neg
6 o più mesi di
intervallo. Altro prelievo
l
l
l
Rinvio definitivo
Ritestare con altro EIA del commercio
l
l
Non reattivo
Reattivo
l
l
Rinvio definitivo
T est di contèrma (es. RISA)
l
l
Indet. o reattivo
Non reattivo
l
Donazione
Rinvio definitivo
l
EIA
l
Reattivo
l
l
Non reattivo
l
Rinvio definitivo Donatore idoneo
AABB 1993
=====================~========================================
184
Sono state scelte temperature diverse e tempi diversi, fra 60°C per 30 h e 68°C per 72 h.
In Inghilterra si è fatto uso anche di 80°C per 72 h (Study Group of the UK Hemophilia
Centre 1988). Purtroppo, le prove di valutazione della tecnica di inattivazione virale
nello scimpanzè e gli studi clinici hanno dimostrato che il calore secco ha un'efficacia
limitata, con l'eccezione forse del procedimento inglese ad 80°C. La liofilizzazione
stabilizza non solo il fattore VIII, ma anche i virus contaminanti.
Il trattamento al calore in soluzione acquosa a 60°C per 10 h (pasteurizzazione) è
stato utilizzato con successo sin dalla fine degli anni '40 per preparare l'albumina umana,
che è notoriamente un prodotto sicuro. L'albumina prima della pasteurizzazione viene
stabilizzata con sodio caprilato o con N-acetiltriptofanato. Purtroppo, i fattori della
coagulazione nelle stesse condizioni perdono la loro attività biologica. Bisogna impiegare
come
stabilizzanti
altre sostanze,
a basso
peso
molecolare,
soprattutto alte
concentrazioni di saccarosio e di aminoacidi. Il fattore VIII così prodotto, a partire dal
1981, è risultato privo del rischio di infezione di epatite e AIDS.
Questo metodo è stato successivamente applicato al fibrinogeno, alla antitrombina
III, al C 1 inattivatore e ai fattori del complesso protrombinico.
Il trattamento con un solvente organico, il tri(n-butìl)fosfato (TNBP) in
combinazione con il sodio colato, è molto efficace nell'inattivare i virus contaminanti del
sangue (HBV, NANBV, HIV) (Horowitz 1985, Guerois 1991) che sono muniti di
capsula lipidica, ma non è efficace nei confronti di virus senza capsula lipidica quali
l'HA V e il parvovirus B 19 (Mariani 1993)
n metodo solvente/detergente, che è tra quelli attualmente in uso per l'inattivazione
virale dei plasmaderivati, viene anche sperimentato per l'inattivazione dei virus nel plasma
fresco congelato. Non è possibile utilizzarlo per gli eritrociti, perchè le emaz1e
contengono lipidi essenziali che sarebbero distrutti ne1 processo di inattivazione.
Le immunoglobuline preparate con il metodo di frazionamento del plasma m
etanolo freddo (Cohn 1946, Oncley 1949) sono generalme_nte considerate sicure per
quanto riguarda la trasmissione dei virus epatitici.
185
Sette preparazioni di immunoglobuline endovena ottenute da un pool di plasma
composto di unità anti-c l 00 negative non trasmettevano l'epatite a tre scimpanzè,
nonostante il plasma non'. frazionato trasmettesse I'HCV quando veniva trasfuso a due
scimpanzè (Biswas 1994). Non sono chiari i motivi di questa apparente sicurezza delle
immunoglobuline.
Una ricerca eseguita con la RT-PCR (reverse transcription and nested polymerase
chain reaction) in campioni di immunoglobuline ha rivelato che il procedimento di
frazionamento di Cohn-Oncley porta ad una riduzione dell'HCV RNA corrispondente ad
un fattore di 4, 7 x 10e4 rispetto al plasma di partenza (Yei 1992).
Uno studio condotto con la tecnica RT-PCR su molte preparazioni commerciali di
immunoglobuline ha messo in evidenza che alcuni lotti presentavano l'HCV RNA, m
concentrazioni ampiamente variabili (Yu 1994).
La presenza deli'HCV RNA neiJe preparazioni di immunoglobuline dipende dalla
carica virate presente nel plasma di partenza ma anche dal processo di lavorazione
adottato. Attualmente, durante il processo di produzione delle immunoglobuline
intramuscolari non sono previsti passaggi di inattivazione virate, mentre per quelle
endovena c'è un trattamento aggiuntivo, quale il frazionamento con polietilenglicole, la
cromatografia a scambio ionico o il trattamento a pH 4, ognuno dei quali agisce
rimuovendo e/o inattivando i virus.
In uno studio di coorte eseguito su pazienti trattati nel 1993 con diversi preparati
commerciali per valutare l'associazione fra infezione da HCV e immunoglobuline
intramuscolari, su 513 persone esaminate non è stata rilevata nessuna sieroconversione
fino a sei mesi dopo la somministrazione delle immunoglobuline (CDC 1994).
Nello studio di Yu (1994), I'HCV RNA è stato individuato nella maggior parte
delle preparazioni intramuscolari controllate e in alcune di quelle endovena e presenta
molte caratteristiche proprie del virus integro. Ciononostante, secondo Yu (1994) le
immunoglobuline rimangono un prodotto sicuro per quanto riguarda la trasmissione di
epatite (Yu 1994). Questa sicurezza può essere dovuta a molti fattori: la presenza di
anticorpi protettivi nelle Ig (Finlayson 1990), l'inattivazione del virus durante il processo
186
di lavorazione, la rimozione dei virus durante la lavorazione. Il frazionamento di CohnOncley porta all'allontanamento di una parte deli'HCV RNA dalle immunoglobuline, ma
l'etanolo ha un effetto scarso o nullo sulla concentrazione di HCV RNA in quanto non
distrugge la capsula dell'HCV Nonostante sia stata riportata la mancanza di immunità
protettiva contro la reinfezione da HCV (Prince 1992, Farci 1992), la possibilità di
anticorpi neutralizzanti allo stato attuale non può essere esclusa (Yu 1994) Uno studio
preliminare, in un modello sperimentale nello scimpanzè, ha dimostrato che Ig
sperimentali con un alto titolo di anti-HCV (ma senza HCV RNA) prolungano il periodo
di incubazione, anche se non prevengono l'infeziOne da HCV (Krawczynski 1993 ).
Risultati simili sono stati osservati nello scimpanzé Immunizzato con proteine
ricombinanti deli'HCV {E l e E2) che evocano una protezione verso inoculi a basse dosi
di HCV e non su quelli a dosi elevate {Choo 1994 )Nonostante quanto riferito. 112 casi di sieroconversione HCV da immunoglobuline
endovena sono stati riportati al CDC di Atlanta nel 1994. Tutti i casi erano associati a
preparazioni ottenute con lo stesso processo produttivo. Non sono chiare le ragioni di
questi episodi di trasmissione, poiché le immunoglobuline incriminate erano state
sottoposte a trattamento con solvente-detergente, ma è probabile che si sia trattato di un
errore nel ciclo produttivo
In conclusione, è possibile affermare che le immunoglobuline endovena del
commercio sono ragionevolmente sicure. sempre che nel processo di produzione sm
prevista una specifica fase di inattivazione e/o rimozione virale (Suomela 1993). ln
mancanza, la trasmissione di alcuni agenti virali deve essere considerata un rischio
piccolo ma reale (Casteels-Van Daele 1990)
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191
LA SORVEGLIANZA DELLE EPATITI POST-TRASFUSIONALI IN ITALIA E
ALL'ESTERO.
Emilio Mannella, Michelina Miceli, Angela Di Lorenzo, Assunta Gallo.
Centro Nazionale Trasfusione Sangue- C.R.I.
Via B. Ramazzini 15, 00151 ROMA.
l rischi collegati alla terapia trasfusionale sono dovuti alla complessità e al numero
di persone coinvolte nel sistema trasfusionale e, più specificatamente, a errori umani e ai
limiti delle tecniche diagnostiche e dei metodi di screening. I momenti del rischio
trasfusionale sono correlati con la selezione del donatore, con la caratterizzazione
biologica dell'unità di sangue e con l'interazione unità di emocomponente/ospite.
Dal punto di vista infettivologico e in particolare per la prevenzione delle epatiti
post-trasfusionali (EPT), sono questi i momenti importanti da sottoporre a sorveglianza.
Certamente le misure messe in atto per tale prevenzione si sono dimostrate molto efficaci
nel ridurre enormemente le epatiti post-trasfusional~ tuttavia esiste ancora un rischio
residuo per cui, senza tema di smentita, si può affermare che il sangue non è mai stato
sicuro come oggi per le attenzioni poste da più parti, ma che, comunque, il grado di
sicurezza non é assoluto.
Questa situazione ha fatto in modo che venissero opportunamente sviluppati i
sistemi di sorveglianza delle varie fasi nei diversi paesi con nonnative spesso differenti.
Per meglio valutare la situazione abbiamo voluto paragonare la sorveglianza delle epatiti
post-trasfusionali in Italia e in alcuni paesi.
Allo scopo è stata avviata una inchiesta con l'ausilio della Croce Rossa
Internazionale, più precisamente con l'intervento del Dipartimento del programma del
sangue della stessa Croce Rossa Internazionale. Alle Organizzazioni Trasfusionali
centrali dei vari Paesi sono state poste domande relative criteri di selezione del donatore,
192
allo screening pre-trasfusionale, alla normativa di scelta e utilizzazione dei k.it, al tipo di
sorveglianza attuata, ai programmi di /ook-back.
Per ciò che concerne la selezione del donatore in massima parte sono stati attivati
programmi educazionali e di autoesclusione delle donazioni per soggetti con fattori di
rischio per infezione da virus epatitici, nel più ampio quadro della prevenzione delle
infezioni associate alla trasfusione.
Sono permanentemente esclusi in tutti gli stati i donatori HBSAg +, anti-HCV +,
quelli tossicodipendenti e, nella maggior parte dei Paesi interpellati, i soggetti con storia
di epatite o ittero implicati in più di un caso di epatite post-trasfusionale, in linea con
quanto previsto dal Consiglio d 'Europa.
Sono invece causa di inidoneità temporanea, ma con differenze temporanee tra i
vari Paesi, i soggetti con comportamenti a rischio d'infezione da virus epatitici. Più in
particolare in italia i soggetti che hanno subito trasfusioni sono sospesi per cinque anni
mentre in Francia, Gennania, Inghilterra, Usa, Canada, Giappone sono sospesi per
dodici mesi ; i soggetti che hanno subito interventi chirurgici , tatuaggi , agopuntura o
foratura deli' orecchio, in condizioni non igieniche, sono sospesi nei vari paesi , per un
periodo da sei a dodici mesi . Mentre in Italia tali soggetti , se hanno utilizzato per questa
procedura materiale monouso, sono considerati idonei alla donazione (1, 2). I soggetti
con epatite a genesi poco chiara vengono permanentemente esclusi, mentre in Gennania
vengono considerati non idonei per cinque anni e in Inghilterra per dodici mesi. Notevole
discrepanza e dubbi interpretativi esistono invece sul comportamento da tenere con i
soggetti sottoposti a trattamenti dentari, tuttavia la maggior parte dei paesi esclude dalla
donazione coloro che hanno subito intervento chirurgico dentario per tre mesi, mentre
l'estrazione dentale viene considerato, motivo di esclusione per tre giorni in Gennania e
ventiquattro ore in Inghilterra, laddove in Italia si viene considerati idonei in questa
ultima situazione .
Concordemente in tutti gli stati lo staff sanitario è considerato idoneo se non è
stato soggetto ad incidenti (tagli e/o punture occidentali) compreso quello operante nei
laboratori e nei reparti di malattie infettive.
193
In ogni caso anche la legislazione vigente in Italia (legge 107/90 e decreti di attuazione) è
sensibilmente più restrittiva di quelli di altri paesi, ma comunque in linea con quanto
previsto dal Consiglio d'Europa.
Altro aspetto di notevole importanza è quello relativo allo screening sierologico
delle unità di sangue e/o plasma.
Le risposte ottenute da circa 25 Paesi dimostrano concordemente che ormai in tutti
viene eseguita la ricerca sistematica deii'HBsAg e dell'anti-HCV_ Un comportamento
discrepante si ha nei confronti della ricerca dell'anti-HBc: questa viene eseguita
sistematicamente in Francia, in Grecia, in Portogallo, negli USA, in Giappone ed in
Corea, negli altri stati viene eseguito di volta in volta sui nuovi donatori e non sempre
(Italia, Lussemburgo, Svezia), non sistematicamente (Austria, Belgio, Danimarca,
Germania, Norvegia e Spagna) e, infine, non viene eseguita in Finlandia, Olanda,
Svizzera, Turchia, Inghilterra, Canada, Australia e Tailandia.
H medesimo comportamento discrepante é rilevabile anche a proposito
dell'esecuzione dell'ALT: accanto a Paesi in cui é obbligatoria l'esecuzione (Austria,
Finlandia, Francia, Germania, Italia, Lussemburgo, Portogallo, Spagna, Svizzera, USA,
Hong Kong, Giappone) vi sono paesi in cui non viene eseguita (Danimarca, Olanda.
Norvegia, Turchia, Inghilterra, Canada Australia, Corea, Tailandia) e altri in cui viene
eseguita saltuariamente e per ragioni particolari (Belgio, Grecia, Svezia).
Ancora più discrepante é il comportamento nei confronti della ricerca delle
infezioni da CMV probabilmente in dipendenza della situazione epidemiologica del
singolo paese (3).
Comunemente, ove si eccettui qualche paese (Portogallo, Corea. tra i paesi che
hanno risposto, per i quali non é obbligatoria la registrazione), nella maggior parte i Kit
per l'esecuzione dello screening sierologico vengono valutati e approvati da un
Organismo tecnico (che varia a seconda deU' organizzazione sanitaria dei diversi Paesi)
del Ministero della Sanità e la concessione alle Ditte dell'autorizzazione alla vendita
costituisce
l'atto finale e necessario. Tuttavia, per ciò che concerne i kit per la
194
rilevazione deli'HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, i criteri di approvazione sono diversi
per i vari paesi. A scopo esemplificativo si riporta la sensibilità minima dei kit per lo
screening dell'HBsAg in alcuni paesi. per il Canada, gli USA, Svizzera i kit debbono
rilevare almeno 0,3 nglml per i due sottotipi ad e ay; per il Liechtstein, Austria,
Inghilterra, Francia e Spagna la sensibilità minima richiesta é di 0,5 l nglml; per la
Germania la sensibilità minima é di O, l ng/mL In Italia, Spagna, Svezia e Danimarca
(Paesi nei quali esiste l'obbligo della registrazione) non é prevista una sensibilità minima,
come peraltro awiene in Portogallo. Comunque in ogni Paese esistono strutture spesso
trasfusionali che valutano le performance dei kit per testi sierologici.
In tutti i Paesi, anche in quelli nei quali non vi é obbligo di registrazione dei Kit,
vengono svolti programmi di valutazione esterna di qualità. La partecipazione agli
esercizi é obbligatoria in alcuni paesi (Germania, Usa, Canada etc.) e fà.coltativa in altri
(Italia, Spagna, Grecia, Portogallo, etc). A ciò si aggiunge che in alcuni Paesi é
obbligatorio eseguire una continua valutazione interna di qualità, come in Francia e in
Italia (anche se questo dato tecnico non viene sottolineato espressamente). Il Consiglio
d'Europa prevede, ad esempio che per ogni seduta di screening per l'antigene di
superficie del virus dell'epatite B venga saggiato un siero contenente 1 ng/ml di HBsAg.
L'analisi comparativa delle linee-guida relative all'algoritmo di screening delle infezioni
da virus epatitici sulle unità di sangue e/o plasma e di conferma dei risultati, pur con
alcune diversità per i vari Paesi, ha dimostrato nel complesso uguali filosofie di fondo. In
particolare gli algoritmi in vigore in Francia, Inghilterra (4) e negli USA e quelli proposti
in Italia dal Gruppo di Studio per l'epatite post-trasfusionale (EPT) rispettivamente per
HBsAg e per anti-HCV sono fra quelli più completi e restrittivi. Tali protocolli operativi
comprendono, oltre che gli algoritmi di screening e di conferma, anche il primo jollow-
up del donatore positivo e l'awio eventuale di quest'ultimo alle unità di diagnosi e cura.
Un ulteriore punto delicato é costituito dal comportamento da tenere nei confronti dei
donatori che presentano test ELISA di screening
ripetibil~ente
positivi per HBsAg o
per anti-HCV e test di neutralizzazione (per HBsAg) e supplementari (HCV) negativi.
Per ciò che concerne l'HBsAg numerosi algoritmi, tutti diver~i fra loro, vengono attuati
l
!95
o sono stati proposti, ma tutti sono particolarmente restrittivi e per la maggior parte
'
prevedono fol/ow-up del donatore (alcuni, come quello inglese, particolarmente
complessi da seguire per il' donatore) durante il quale é prevista anche la ricerca del
DNA virale mediante PCR.
Per ciò che concerne, invece, le positività per I'HCV,
l'algoritmo di screening prevede che nella maggior parte dei casi l'unità di sangue vada
eliminata e non sono previsti criteri di riammissione alla donazione. L'Associazione
Americana delle Banche del Sangue, proprio per la mancanza di veri e propri test di
conferma e per i risultati positivi con test di II generazione, ha elaborato un criterio di
rientro che prevede la riammissione alla donazione qualora un donatore risulti negativo al
test di III generazione con negatività contemporanea dei test supplementari approvati
(5).
Discrepanti e per lo più sottovalutati appaiono in queste linee guida i problemi
relativi ad altri virus epatitici, quasi assenti infatti appaiono quelli connessi con il CMV e
con i pazjenti immunocompromessi.
Un ultimo momento importante della prevenzione dell'EPT é costituito dal tipo di
sorveglianza effettuato nei vari Paesi. Per la massima parte dei vari stati la sorveglianza
é passiva e soltanto la Svizzera dal prossimo anno dovrebbe introdurre la sorveglianza
attiva delle EPT. La denuncia dei casi di EPT alle autorità sanitarie e ai serv1z1
trasfusionali stessi é obbligatoria nella maggior parte delle Nazioni, compresa l'Italia
dove però ai Servizi Trasfusionali non pervengono i dati di ritorno delle complicanze
infettive della terapia trasfusionale.
I programmi di look-hack infine sono avviati in tutti gli Stati e si limitano,
probabilmente per gli stessi nostri problemi,
alla ricerca dei riceventi delle unità di
sangue provenienti da donatori divenuti positivi per HBsAg o anti-HCV
L'analisi delle linee guida e delle normative dei venticinque Paesi che hanno
risposto e che partecipano al programma sangue della Società della Croce Rossa
Internazionale permettono di affermare che il sistema di sorveglianza delJe EPT attuato
in Italia nelle linee generali, delineato dalla legge 107/90 e integrato e meglio specificato
nelle proposte del gruppo di studio Epatite della SIMTI, è sicuramente efficace e in linea
196
con i sistemi di sorveglianza più avanzati. Le puntuali indicazioni circa la selezione del
donatore, i programmi
educazionali alla donazione del sangue, i questionari di
esclusione e/o autoesclusione dalle donazioni , gli algoritmi di screening e di conferma
dei risultati, i criteri di protezione del donatore, i criteri
restrittivi di ammissione e
riammissione alla donazione e l'attivazione effettiva dei programmi di /ook-back, sono
efficaci nel prevenire le epatiti post-trasfusionali.
Tuttavia alcuni momenti di tale sorveglianza sono da perfezionare e in particolare:
• si ritiene necessario che, al pari di quanto si verifica negli altri Paesi, gli organismi
preposti al controllo e all'approvazione dei kit
conunerciali per le rilevazioni
deli'HBsAg e degli anticorpi anti-HCV facciano pervenire le notizie relative agli
stessi kit in modo tempestivo e puntuale.
• è auspicabile poter disporre delle notizie tecniche sulle caratteristiche di performance
dei vari kit con le indicazioni di merito e le caratteristiche di utilizzabilità.
• per ciò che concerne la rilevazione dell'antigene di superficie dell'epatite B è
necessario che venga introdotto il concetto di sensibilità minima del kit come avviene
negli altri Paesi. In base a questo concetto i kit che non rilevano una quantità minima
di HBsAg non possono essere utilizzati nei servizi trasfusionali.
• è importante ricordare che è obbligatorio effettuare il controllo di qualità interno
(legge 107/90).
• attivare ed estendere i programmi di /ook-back
L•attuazione di questi momenti, unitamente alla già buona normativa esistente in
Italia e al perfezionamento di linee guida da parte del gruppo di studio delle Epatiti,
sicuramente porterà ad un ulteriore miglioramento della sicurezza della terapia
trasfusionale.
•
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Week.~:
2.
198
STUDIO SUI RICEVENTI UNITA' DI EMOCOMPONENTI DA DONATORI
SUCCESSIVAMENTE SIEROCONVERTITI HCV
Osvaldo Giachino
Centro Trasfusionale AVIS "A Colombo" via Ventimiglia l, 10126 Torino
lntroduziont>
In seguito all'introduzione dello screening sulle unità di sangue, l'incidenza
dell'epatite C post-trasfusionale si è ridotta drammaticamente_ Allo scopo di misurare
l'entità di questa riduzione, valutare l'efficacia delle strategie di prevenzione, e tentare di
quantificare il rischio residuo di trasmissione, abbiamo effettuato una sorveglianza
prospettiva di una popolazione di soggetti con B-talassemia trasfusione-dipendente HCV
negativi, per un periodo di 4 anni Inoltre abbiamo identificato i donatori HCV negativi a
una precedente donazione. in seguito risultati positivi. per evidenziare, tramite il /ookhack dell'ultima donazione negativa, una possibile sieroconversione del paziente
ricevente
Metodi di screening
Determinazione ALT (valore soglia 54 U/1 )
Aprile 1990-aprile 1991: Test anti-HCV E.Ll.S.A. l generazione (NS4). (ELISA l)
Maggio 1991- giugno 1994. Test anti-HCV II generazione (+NSJ + c22). (ELISA 2)
Luglio 1994 inizio test anti-HCV Ili generazione. (+NSS). (ELISA 3)
Studio prospettivo
Pazienti: 38 soggetti con B-talassemia, ELISA 2 negativi al momento dell'inizio dello
screening ELISA l (aprile 1990), (come evidenziato in . seguito su sieri storici
conservati). Tali pazienti erano parte di un più ampio gruppo (147 soggetti) studiati con
determinazione dell'ALT a ogni ciclo trasfusionale (in media 25gg.). Veniva fatta
•
199
diagnosi di epatite quando si osservava
un aumento AL T> 2.5 volte la media dei valori
.
.
registrati nell'anno precedente, confermato ad almeno l settimana di distanza.
Trasfusioni: Nel periodo di osservazione sono state trasfuse 786 unità ELISA l negative
(aprile 1990-aprile 1991) e 2819 unità ELISA 2 negative (maggio 1991-luglio 1994).
Risultati: Nel periodo di sorveglianza, 7 pazienti su 38 hanno mostrato un aumento del
valore ALT compatibile con la diagnosi di epatite, dei quali 5 nel periodo di screening
ELISA l; 4 pazienti hanno mostrato una sieroconversione HCV, e in tutti i casi è stato
evidenziato un donatore ELISA l negativo, ELISA 2 positivo.
In 3 pazienti non si è
osservata sieroconversione. La Tab. I mostra i dati clinici rilevanti dei casi riportati Il
rischio di sieroconversione HCV relativo alla trasfusione di unità sottoposte a screening
ELISA l era di 0.5/100 unità. Non si sono osservati casi di sieroconversione in seguito a
trasfusione di unità sottoposte a screening ELISA 2.
Studio /ook-back
Sono stati individuati 2 gruppi di donatori in rapporto alle diverse metodiche di
screening successivamente adottate.
Gruppo l) Donatori ELISA 2 positivi, con almeno una donazione ELISA l negativa
nell'anno precedente.
Gruppo 2) Donatori ELISA 2 positivi (oppure ELISA 3) con donazione precedente
ELISA 2 negativa.
Gruppo l:
Sono state individuate 234 donazioni provenienti da 185 donatori. Di queste l 08
erano state inviate a S.I. T. extraregione e non sono state incluse nello
studio~
37 erano
state eliminate prima dell'assegnazione per cause varie ( 4 per ALT oltre il limite
accettabile). Le 89 unità rimanenti risultavano, in base alle nostre registrazioni, assegnate
e trasfuse a pazienti in reparti direttamente serviti dal nostro servizio. La consultazione
delle cartelle cliniche dei pazienti ha permesso di rilevare che l S unità non erano state
realmente trasfuse e che 20 pazienti erano deceduti nel corso del ricovero associato con
200
la trasfusione indagata. 21 pazienti politrasfusi risultavano già HCV positivi prima della
trasfusione in oggetto. Dei 33 pazienti rimasti, 8 risultarono irreperibili; 8 erano deceduti
nel periodo fra la trasfusione e lo studio; 4 non acconsentirono a sottoporsi al
prelievo~
13 soggetti furono sottoposti al controllo post-trasfusionale. Dei 13 riceventi, 6 (46%)
sono risultati HCV positivi e 7 HCV negativi. La tabella II mostra il pattem sierologico
dei donatori implicati.
Gruppo 2:
I soggetti in questo gruppo rappresentano le reali sieroconversioni nella
popolazione dei donatori. Nel periodo di 3 anni posteriore all'introduzione del test
ELISA 2, sono stati identificati 7 donatori con evidenza di infezione recente. 4 avevano
eseguito una donazione nel corso dell'anno precedente al riscontro di positività anti HCV
(Tab. III)
Non è stato osservato nessun caso di sieroconversione
HCV nei riceventi la
donazione HCV negativa. (l paziente sottoposto a dialisi cronica risultava già
sieropositivo
precedentemente
alla
trasfusione
m
oggetto).
L'incidenza
della
sieroconversione sul totale delle donazioni (circa 240.000) risultava di 0,0029 %.
Considerando un periodo di 5 anni (1988-1994) nella stessa popolazione di donatori
abbiamo osservato 12 sieroconversioni HIV (7 nell'anno precedente, 5 entro i 2 anni
precedenti la donazione HIV positiva). Anche in questo caso non si sono verificate
trasmissioni del virus mediante trasfusione. L'incidenza sul totale delle donazioni è stata
dello 0,003%.
Discussione
I risultati ottenuti confennano che la prevenzione dell'epatite da HCV correlata con
la trasfusione è risultata molto efficace a partire dall'introduzione del test di II
generazione, come dimostra l'assenza di trasmissione del virus nella popolazione di
politrasfusi considerata.
•
201
•
Per quanto riguarda lo studio look-back per i donatori del gruppo l, la presenza di
una reattività c33 al RIBA II si è dimostrata correlare con l'efficacia di trasmissione del
virus. Il numero di infezioOi post-trasfusionali potenzialmente rilevanti dal punto di vista
clinico, è risultato minore di quanto teoricamente atteso a causa dell'elevato numero di
unità non assegnate o non trasfuse per vari motivi. Il 38% dei pazienti trasfusi (28 su 74)
era deceduto entro 2 anni dall'episodio trasfusionale (%molto vicina a quella riportata in
un recente studio in USA) (l). Entrambi i fattori (% di unità non trasfuse e % di pazienti
precocemente deceduti per la malattia di base) sono importanti per valutare
correttamente il rapporto fra la prevalenza di un dato agente infettante nei donatori e il
reale impatto epidemiologico sui riceventi.
La bassissima incidenza di donatori con evidenza di sieroconversione recente
(anche se probabilmente vi è una sotto stima legata al possibile mancato ritorno del
donatore) minimizza la possibilità (confermata da sporadiche osservazioni) (2), di
trasmissione da donatori in fase di sieroconversione. Nella nostra popolazione l'incidenza
del fenomeno si è rivelata paragonabile a quella riscontrata per l'infezione da HIV 1,
nonostante la differente prevalenza dello stato di sieropositività per i 2 virus nei donatori
ali accesso (0,5% per HCV; 0,025%) per HIV l, osservazione personaJe). Ciò porterebbe
a ritenere che il rischio residuo di trasmissione delle 2 infezioni per via trasfusionaJe sia
pressoché sovrapponibile, considerando altresì che la determinazione del valore ALT
potrebbe in qualche misura ridurre il periodo di sieronegatività HCV associato con la
potenzialità infettiva. (window phase). Recenti osservazioni indicano che la window
phase in pazienti immunedepressi può prolungarsi fino a 38 mesi (3). Non sappiamo se
tale fenomeno possa verificarsi anche nei donatori Dal complesso delle osservazioni
disponibili, tuttavia, si può concludere che il rischio di epatite C associata con la
trasfusione può essere considerato molto prossimo allo zero.
202
Tab I: Dati clinici rilevanti dei pazienti con diagnosi di epatite .
••
ALT MAX
!!11EROCONV.
DONATORE
HCV POS
INTERVALW
TRASFUSIONE
AUMENTO AI.T
l
863
2
311
3
901
4
1620
5
635
6
136
7
195
Si
Si
Si
Si
NO
NO
NO
Si
Si
Si
Si
NO
NO
NO
64
gg.
35 gg
45 ••.
30
gg
Tab II: Pattem sierologico anti HCV dei donatori corrispondenti a1 13 pazienti
con controllo post-trasfusionale.
!romn
ESSO
:ONV.
""NAT.
108781
M
119361
F
196737
F
138792
F
121881
204140
lr.
lr.
51633
M
191539
IF
18994
M
199689
M
159370
M
156901
M
66147
M
LISA
SIERO
SI
SI
SI
SI
SI
SI
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
RATIO
>5
4
1u8A
ATfERN
c22+++ c33++
22++c33+
jALT
PREGRESSO
21-23-39
36-40-55
4
c22+++ c33++
34-48
4
c22+++
38-30
4
c22+++
17-22-14
4
c33++
46-53-68
4
c22++
15-13
4
c22+
16-24-37
4
c22+++
31-33-27
>5
c22+
25-29-30
3
c22++
28-27-26
l
c22+
33-28-20
l
c22+
24-26-23
(
203
Tab. III: Caratteristiche dei donatori con sieroconversione HCV.
L"'DICE
SESSO
ETA.'
ALT
mnlf#
177959
209275
205540
152672
89295
188157
201624
M
23
21
21
27
65
24
37
284
1340
760
142
6
7
15
6
IO
Il
13
129
24
35
M
M
M
F
M
M
# mesi intercorsi da donazione precedente.
Bibliografia:
l. Vamvakas EC, Taswell HF, (1994). Long term survival after blood
transfusion.
Transfusion 34: 471-477.
2. Reesink HW, Vrielink H, van der Poel CL, Zaaijer HL, Cuypers HTM, Lelie PN,
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Transfusion 34S: 385. (abstract)
J. Cornu C, Brusse1mans C, Geubel A, Ferrant A. Cornu G, (1994). Anti-HCV
seroconversion in multitransfused an d immunocompromised patients. Vox Sang 6 7:
286-290.
204
VALUTAZIONE DI UN TEST ANTI-HCV DI TERZA GENERAZIONE
APPLICATO A DUE POPOLAZIONI SELEZIONATE: EPATITI ACUTE NANB
(INDAGINE
RETROSPETTIVA)
E
DONATORI
DI
SANGUE
INDETERMINATI ALLA SECONDA GENERAZIONE.
Marisa De Palma
Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale- Azienda Ospedaliera di Modena
Rispetto al test di seconda generazione HCV Ortho, la metodica HCV 3.0 è
caratterizzata da una strutturazione degli antigeni utilizzati diversa sia qualitativamente
sia quantitativamente. Le modifiche più significative riguardano: l. l'aggiunta della
proteina ricombinante NSS, polimerasi virate codificata dalla regione genomica NSS, la
cui presenza sembrerebbe evidenziare più precocemente una sieroconversione da HCV,
anche se tale risposta non è statisticamente prevalente rispetto a quella verso gli antigeni
codificati dalle regioni Core e NS3; 2. dall'eliminazione dal pool antigenico della frazione
libera C l 00-3, presente nella terza generazione solo come parte integrante della C 200,
3 da modifiche qualitative (conformazionali) oltre che qqantìtative della C 33c.
La metodica rimane caratterizzata dall'uso esclusivo di antigeni ricombinanti. Per
tale motivo ci è sembrato interessante valutaria in parallelo ad un kit (EIAGEN DETECT
HCV-AB IFCI CLONESYSTEM) caratterizzato dall'uso esclusivo di antigeni sintetici (
C 22. NS3. NS4)
Come test di specificità anticorpale o di confenna sono stati utilizzati sia il RlBA
III Ortho, che l'immunoblot INNOLIA Innogenetics e il Western Blot Wellcome nei casi
di discordanze significative dei test di screening.
Casistica selezionata
Sono stati studiati 134 campioni, accuratamente selezionati fra 800 sieri,
prelevati a pazienti ricoverati presso il Reparto di Malattie Infettive del Policlinico
205
Universitario di Modena, con diagnosi di epatite NANB acuta (n=l18) e cronica
(n=l6). I campioni erano stati raccolti e conservati nelJiarco di circa IO anni, in epoca
precedente la messa a punto delle tecniche per la ricerca degli anticorpi anti-HCV.
Di tutti i pazienti era disponibile una precisa documentazione clinica e di laboratorio
relativa al periodo di ricovero e diagnosi di epatite NANB con esclusione oltre che dei
virus A e B di ogni altra possibile eziologia. Per tutte le epatiti croniche la diagnosi era
sopportata dall'esame istologico.
I 118 pazienti con epatite acuta (81 maschi; 37 femmine) avevano una età media di
34 anni (range 12-74); nei 16 pazienti con epatite cronica (11 maschi; 5 femmine) l'età
media risultava di 43 anni (range 21-68).
Tutti i casi sono stati classificati in rapporto ai fattori di rischio dedotti dalla
indagine anamnestica.
NANBACUTA
NANB CRONICA
- Tossicodipendenti
n.38
n.4
- Trasfusi ed Emofilici
n.l4
n. l
- Contatti sessuali
n.J
- Contatti sanitari
n.21
n.J
- Nessun fattore di rischio
n.42
n.S
l
I risultati complessivi sia per le epatiti acute che croniche sono riportati in Tabella l
Ci sembra interessante sottolineare per le epatiti acute la durata dell'intervallo
medio di tempo intercorso tra la prima rilevazione dell'incremento delle ALT e il primo
campione di siero testate per anti-HCV: per i soggetti positivi il tempo medio era di
10.88 giorni; nei pazienti anti-HCV negativi l'intervallo era dimezzato( 5,45 giorni).
Le discordanze (n=I3 epatiti acute; n= l epatiti croniche) sono riportate in tabella 2
Alla luce dei test di conferma (Riba III per gli 8 casi Ortho 3 positivi, Innolia e WB per i
6 casi Ortho 3 negativi, vedi tabelle 3 e 4):
- 2 pazienti positivi unicamente al test Ortho 2 non sono stati confermati da alcun test
supplementare
206
- 2 sono stati confermati positivi ( Riba III C 100- 3 l C 33c)
- 6 sono stati confermati positivi a una banda ( Riba III indeterminati per C 33c)
- 4 hanno dato risultati variabili per epitopi singoli o multipli della regione Core (lnnolia
eWB).
Complessivamente, mentre la incidenza dei risultati negativi (36 %) nelle epatiti
acute può essere giustificata dalla fase temporale del prelievo, per i 16 pazienti con
diagnosi di epatite cronica la bassa percentuale di negatività (13%) e la ridotta
discordanza fra i 3 test confermano la maggiore significativita' del test in questa fase di
malattia.
E' da sottolineare però come, pur non essendo stato possibile per ragioni pratiche
cercare i pattem di positività su tutti i sieri concordanti positivi (53%), tra i 14 casi
variamente discordanti ai test di screening, gli 8 casi messi in evidenza dall'Ortho 3 siano
stati tutti confermati dal Riba III (2 positivi e 6 indeteminati per C 33c isolata). La
reattività isolata verso peptidi della regione Core di 4 sieri ( 2 positivi solo IFCI, 2
positivi per IFCI e Ortho 2 ) riveste ancora un incerto significato biologico. Quanto agli
unici 2 campioni risultati positivi solo per Ortho 2, non essendo stati confermati da
nessuno degli immunoblotting testati, potrebbero essere considerati come falsi positivi
del test Elisa Ortho 2.
L'altra categoria esaminata è costituita da 83 donatori sospesi dalle donazioni
nell'arco di 2-3 anni, Ortho 2 positivi, Riba
n indeterminati secondo la seguente
distribuzione
- 29 HCV Ortho 2 pos, Riba indeterminati per C 100-3
GRUPPO A
7 HCV Ortho 2 pos, Riba indeterminati per C 33c
GRUPPOB
47 HCV Ortho 2 pos, Riba indeterminati per C 22-3
GRUPPO C
I risultati dei due successivi test di screening sono illu.strati in Tabella 5: da essi
emerge una buona correlazione tra Ortho 3 e Ifci per gli indeterminati C 100-3 e C 22-3
207
( rispettivamente 93 e 95.7%) mentre è assai ridotta (43%) per gli indeterminati a1la C
33c, pur con la limitazione di un numero esiguo di campioni (n=?).
Le discordanze Ortho3. O l Ifci riguardano complessivamente 8 donatori, tutti
risultati Ortho pos l lfci neg , che sottoposti ai test supplementari hanno dati i seguenti
risultati
GRUPPO A (Riba li ind per C l 00-3) · 2 Ortho l pos l lfci neg
l. Riba 3.0
~
CJ00-3+ l c22 -3 ++!Il lnnolia neg Ili WB NS4 ++++
1. Riba 3 .O= SOD ++(non evidenziata al Riba III)
GRUPPO B (Riba n ind per C 33c) • 4 Ortho 3 pos l lfci neg
l. Riba 3.0 ~ CI00-3 +l C 33c +++Ili lnnolia ~E2/NSI +l NS3 ++Ili WB
l. Riba 3.0
~
2. Riba 3.0
~C
CI00-3 +l C 33c ++++Ili lnnolia
33c +++Ili lnnolia
~
~
NSJ +++Ili WB
~
~
NS3 ++
NS3 +++
NS3 ++
GRUPPO C ( Riba n ind per C22-n 2 Ortho 3 pos l lfci neg
l. Riba 3.0
l. Riba
~
3.0~
CIOO -3 ++(?)Ili WB neg
C 22-3 +Ili lnnolia ~Cl++ C2++
Nessuno dei sieri sottoposti ai test di conferma ha presentato un anti NSS isolato.
Il test di screening Ortho 3 rileva un maggior numero di campioni positivi, riferibili in
percentuale modesta a proteine del core e/o della regione NS4, in larga percentuale alla
C 33c, confermando il presupposto che. trattandosi di una proteina conformazionale, ha
reattività ottimale se ottenuta con metodiche ricombinanti piuttosto che per sintesi.
Un ulteriore aspetto dei dati ottenuti in questo gruppo di donatori è l'alta
percentuale di positivi alla seconda generazione Elisa, non confermati dalla terza
(complessivamente 42% . 27 l 29 tra i Riba ind per C 100-3, 3 l 7 tra i Riba ind per C
33c, 5 l 41 tra i Riba ind per la C 22-3)
208
Poiché sono già state segnalate (I ,2,3) evidenze di reattività per C 100-3 e 5. l. l
limitate a singoli epitopi del peptide e non specifiche per infezione da HCV, così come
per la proteina C 22-3, abbiamo inviato al Laboratorio di Ricerca e Sviluppo Ortho
(Raritan, New Jersey) una campionatura dei sieri più critici, al fine di verificare se:
l-
venivano confermate dallo studio degli epitopi le reattività CI00-3 e C22-3
evidenziate al Riba II
2- venivano confermate le reattività Riba II e/o Riba III per C33c su campioni negativi
all'Elisa Ortho 3 O
I campioni inviati erano
9/27 donatori Ortho 2 positivi, Riba II Indeterminati per CI00-3- Ortho 3.0 negativi
115 donatori Ortho 2 positivi, Riba II Indeterminati per C22-3 - Ortho 3.0 negativi
3/3 donatori Ortho 2 positivi, Riba II Indeterminati per C33c- Ortho 3.0 negativi
4 pazienti dell'Istituto Malattie Infettive negativi ali'Ortho 3. O, tutti positivi allo screening
IFCI due dei quali positivi per Ortho 2 , con reattività confermata al WB per Core e/o
ali'Innolia per epitopi singoli o multipli del Core.
I risultati, riportati in tabella 6 sembrano confermare la sostanziale magg1ore
specificità del Test Ortho 3 .O vs Ortho 2 nel gruppo dei donatori indeterminati per c l 00
e per il solo donatore indeterminato alla c 22.
Quanto ai risultati dei pazienti viene prospettata l'ipotesi ( da verificare su ulteriori
campionatura degli stessi propositi) di infezione non A non B non C in quanto mostrano
una reattività multipla ai peptidi del Core ma con profilo di reattività diverso da quello
che contraddistingue i pazienti affetti da epatite C.
Quanto ai donatori Indeterminati per C 33c, poiché non esistono a tutt'oggi dati
significativi sulle risposte a singoli epitopi del peptide il giudizio sui loro profili
sierologici rimane ancora in attesa di chiarimenti da altre future metodiche, ma induce a
cauta riflessione su test di screening negativi con specificità
an~i-
C 33c al Riba III
209
RISULTATI: Ortho 2 l Ortho 3 l IFCI
Tabella l.
NANB ACUTE
NANB CRONICHE
oosc
"
.
.......
- P0853'11o
Tabella 2.
"
DISTRIBUZIONE TEST ELISA POS NEl
14 PAZIENTI DISCORDANTI
ORTHO 2/ ORTHO 3
6
ORTHO 3
IFCI
2
2
ORTHO 2
2
NANB ACUTE E CRONICHE
TEST DI CONFERMA AlBA 111
Tabella 3.
(8 pz. discordanti positivi Ortho 3)
ORTHO 2/0RTHO 3 n•6
ORTHO 3 n•2
t
2 IND c33
t
4 IND c33
2 POS ctOO/c33
210
Tabella 4.
TEST DI CONFERMA
IFCI POS
l
±
[ ( t
t
t
l
l
[
OATHO 2/IFCI l + T ±
l + l
OATHO 2/IFCI L+~T~
L-= J
OATHO 2 L - ~T ____·_!
l
OATHO 2 L . T ~---L=-1
±
IFCI POS [
Cl
C2
INNOLIA
CORE
WB
Tabella 5.
CONFRONTO ORTHO 2/ ORTHO 3/ IFCI
sugli 83 donatori AlBA Il INDETERMINATO
47
7 4
o
~
~·
'
c100
D
OATHO 2
D
IFCI
4240
~
29
-'
c33
r--:-]
[[]:
c22
ORTHO 3
,
211
Tabella 6.
Risulati del Laboratorio Re D Ortho (Raritan-USA)
(Campioni di donatori evidenziati con reticolo)
c 100
Ellea 2.0
Sample
1
2
3
'
'
'
1
'•
a/c ratlo
Eli18 3.0
a/c ratlo
2.117
2.9154
3.783
o.oeo
3.381
0.047
0.083
0.063
0.028
0.1584
0.017
3.771
2.12'2
3.770
3.885
3.245
0.939
0.021
RIBA
HCV 2.0
Negative
Ne atlve
HCV 3.0
c 100 ,.
Negallve
100 2•
Neg~!.i_~
Negalive
Negalive
N!q!tlve
N11q~t_i~e
Negative
100 2+
rw~oative
100 2•
Negative
lngte (pept
c 100 1•
Neg~t!~
Negative
c
c
c
Sampla
e/c ratlo
a/c rauo
10
,,.,.
1.418
HCY 2.0
Negative
11
0.728
1.887
2.874
1.294
0.878
0.308
0.198
0.347
1.718
c 22 1+
c
c
22 3•
22 2•
Negati~
c
----
22
RIBA
13
Negative
Negalive
Negative
Negativa
Eltaa 3.0
0.081
1.038
0.085
!C- tOo-=-31
-~·g·g~ ~-N•Q~!iva
Nega;;~ Neg!live
c
0.488
0.855
0.548
data
AlBA.
Ell1a 2.0
,,
Peptide
ti
Peptide
data
AlBA
HCV 3.0
C-22-3)
- -
Negative
Slngle
C 22P 2+
Incompleta
C 22P 4• t-~ulliple
c 22P2. 1--~ulliple
-~egallve
~-~:~•!iple
33
c 33 2•
c 33 2•
e ali
·c 33 3•
c 33
N
3•
""
""
""
Bibliografia:
I.
Bush MP et al., (1993). A pattem of S.I. l and C 100-3 only on hepatitis C virus
recombinant immunoblot assay does not reflect HCV infection in blood donors.
Transfusion 33: 84-8
2.
Zaaijer Hl et al., (1994). Should the C 100 Antigen be removed from HCV antibody
assays? Vox Sang.66: 150
3.
McOmish F et al., (1994}. Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes
in blood donors: an intemational collaborative smvey. J Microbiol 32: 884-92
212
ESPERIENZA MULTICENTRICA CON TEST DI 3' GENERAZIONE NELLO
SCREENING HCV DEI DONATORI DI SANGUE.
Enrico Passarelli-Pula**, Maurizio Lanteri***, Sante Barbante*, Cesare Fausto
Bertorello*, Paolo Cagetti*, Giuseppe Cambié*, Patrizia Collinassi*, Walter Cozzolino*,
Marisa De Palma*, Osvaldo Giachino*, Paolo Gottardi*, Ermanna Iiritano*, Giovanni
Landucci*, Michela Macri*, Mara Mazzucco*, Carlo Omodei-Zorini*, Gaetano
Polignano*, Paolo Rizzone-Favicchio*, Mario Rossi*, Liliana Santarossa*, Piera
Vallauri*, Leopolda Zarnpieri*.
*Referenti Regionali del Gruppo di Studio EPT della Società ItaHana di Medicina
Trasfusionale e di Immunoematologia
•• Servizio Immunotrasfusionale Provinciale Ospedale di Macerata
***Centro Trasfusionale Ospedale di Verbania
Introduzione
Il Gruppo di Studi sull'epatite post-trasfusionale costituitosi in seno alla Società
Italiana di Medicina Trasfusionale e di Immunoematologia fin dal 1987 ha, a tutt'oggi,
raccolto dati epidemiologici annuali sulla prevalenza di HBsAg, HbsAb, HBcAb,
HCV Ab e relativi tests supplementari; ha raccolto informazioni sulla organizzazione
operativa dei Servizi Trasfusionali Italiani nella attuazione delle diagnostiche relative allo
studio dei marker delle epatiti B e C, di quelle da CMV e sulla determinazione delle
ALT; ha elaborato linee di guida per lo screening HBV e HCV nei donatori, producendo
infine dati sul
jollow~up
dei donatori HCV Ab pos sulla base dei risultati di test
supplementari e dati sul rischio residuo di epatite post-trasfusionale da HCV dopo
l'utilizzazione dello screening specifico.
Dopo Jlinunissione nel mercato della 3a generazione. del test di screening HCV,
dotato, secondo le infonnazioni delle produzioni, di una dimostrata, aumentata sensibilità
per la evidenziazione delle fasi precoci della sieroconversione HCV Ab. i Servizi
''
•
213
Trasfusionali Italiani hanno adottato questo nuovo test nello screening dei propn
donatori.
Abbiamo raccolto i risUltati di queste prime espenenze, parametrandoli ai risultati
ottenuti in precedenza con 11utilizzo della 2a generazione dei tests di screening HCV
Metodi
Di tutti i Servizi Trasfusionali italiani invitati a comunicare i propri dati, hanno
risposto 84 Centri (Tav. l), distribuiti in ragione del 33% al nord, 38% al centro e 29%
al sud del Paese. Tutti i Centri partecipanti hanno inviato dati completi riferiti al numero
globale di campioni esaminati e suddivisi in "Donatori Conosciuti 1' , precedentemente
negativi alla ricerca delta HCV Ab con metodi di 2a generazione e "Donatori Nuovi"; non
tutti i Centri partecipanti hanno specificato dettagliatamente per le categorie "Donatori
Conosciuti" e "Donatori Nuovi 11 la suddivisione per sesso, così che il campione di
popolazione suddiviso. per sesso è risultato essere inferiore al campione globale. Sono
stati pertanto configurati sei gruppi di popolazione: l) Donatori Conosciuti Uomini; 2)
Donatori conosciuti Donne; 3) Donatori conosciuti Totale; 4) Donatori Nuovi Uomini;
5) Donatori Nuovi
Donne~
6) Donatori Nuovi Totale.
I risultati relativi ad ognuno dei sei gruppi sono stati parametrati con i risultati delle
corrispondenti categorie esanùnate precedentemente con test di 2a generazione. Non
sono stati parametrati fra loro i risultati dei diversi gruppi di popolazione.
Sono stati testati 139.025 campioni di donatori appartenenti sia alla categoria di
"Donatori periodici Conosciuti" (116.194), che di quella di "Nuovi Donatori" (22.831 ).
Alla categoria "Donatori Conosciuti" si sono potuti ascrivere 81.033 uomini e 21. 172
donne. A1Ja categoria "Nuovi Donatori .. si sono potuti ascrivere 16.365 uomini e 5.649
donne.
Tutti
campioni sono stati esaminati con test di screening di 3a generazione
presenti nel mercato italiano. Non sono state effettuate valutazioni comparative fra
singole produzioni. Tutti i campioni, risultati ripetutamente reattivi (RR) ai test di
screening di 3a generazione, sono stati successivamente esaminati con lo Immunoblot
214
RIBA-3 che evidenzia, secondo le indicazioni del produttore, HCV Abs reattivi verso
c!OOp, c33c, c22p, e verso la proteina NS5.
Sono stati infine sottoposti all'immunoblotting, RIBA-3, 74 campioni conservati a
-80°C e appartenenti a donatori risultati "RR" con metodica di 2a generazione HCV Ab e
"indetenninati" al RIBA-2.
Risultati
I donatori ripetutamente reattivi sono stati 786 (0,56%), suddivisi in 465 "Donatori
Conosciuti Totale" (0,4% del rispettivo gruppo) e 321 (1,41% del rispettivo gruppo)
"Nuovi Donatori Totale" (Tav. 2).
Del gruppo "Donatori Conosciuti Uomini" 341 (0,42%) sono risultati RR, mentre
74 (0,35%) sono risultati RR nel gruppo "Donatori Conosciuti Donne"; nel gruppo
"Nuovi Donatori Uomini" 235 (1,44%) sono risultati RR e 82 (1,45%) sono risultati RR
nel gruppo "Nuovi Donatori Donne".
Del gruppo "Donatori Conosciuti" 341 RR (0,42%) erano uomini e 74 (0,35%) erano
donne, mentre del gruppo "Nuov) Donatpri" 235 RR (1,44%) erano uomini e 82 (1,45%)
erano donne.
Le percentuali di positività evidenziate con il test RIBA-3 sono state
rispettivamente del: 19,3% per il Gruppo l); 26,03% per il Gruppo 2); 22,57% per il
Gruppo 3); 59,47% per il gruppo 4); 60,56% per il Gruppo 5); 57,28% per il Gruppo 6),
mentre i risultati "indeterminati" evidenziati dallo stesso test sono stati rispettivamente:
28,07% per il Gruppo I); 34,25% per il Gruppo 2); 28,54% per il Gruppo 3); 22,47%
per il gruppo 4); 19,72% per il Gruppo 5); 22,15% per il Gruppo 6).
I 74 campioni "indeterminati" al RIBA-2 erano così raggruppabili: a) 50
presentavano positività (da l+ a 4+) per il solo antigene c22-3~ b) 7 per il solo antigene
ci00-3; c) 4 per il solo antigene c33c; d) 6 per il c22-3 con aggiuntiva positività dubbia
(!±)anche per il c33c; e) 2 per il c22-3 con aggiuntive positività dubbie(!±) anche per
il c33c e per il c!00-3; f) l per il c!00-3 con aggiuntiva positività dubbia (l±) anche per il
c22-3; g) l per il c22-3 con aggiuntive positività dubbie (l±) anche per il c!00-3 e per il
i
l'
215
5-1-1; h) 2 per il c22-3 con aggiuntive positività dubbie (l±) per il c33c, il c!00-3 e per il
5-1-1; i) l per il c33c con aggiuntiva positività dubbia (l±) per il c22-3.
I risultati ottenuti col'.nuovo immunoblotting di 3a generazione hanno evidenziato
37 campioni (50%) positivi e Il campioni (14,9%) negativi , mentre 26 campioni
{35, 1%) sono restati "indeterminati".
In generale le positività, laddove interessanti antigeni corrispondenti, si sono m
larga parte dei casi rese più evidenti passando da 1+,2+ a 3+,4+ ed in particolare i
pattem di reattività si sono così distribuiti:
GRUPPO
a).
16
c22p;
15
c22p/c33c;
c22p/c33c/cl00p; 2 c22p/c33c/NS5(1±};
4
c22p/c100p(l±)/c33c/NS5;
3
l c22p/c33c/cl00p(l±}; c22p/cl00p;
c22p/c33c/cl00p(I±}/NS5/hSOD(l±); 4 c22p/c33c(l±}; l c22p/cl00p(l±}; 2 Negativi
GRUPPO
b).
7 Negativi.
GRUPPO
c).
l cl00p/c33c/NS5; 2 c33c;l c22p.
GRUPPO
d).
2 c22p/c33c; l c22p/c33c/NS5/c100p(l±); l c22p/c33c/NS5;
l
c22p(l±)/c33c/c100p(l±); l Negativo.
GRUPPO
e).
l c22p/c33c; l c22p.
GRUPPO
f).
l Negativo.
GRUPPO
g).
l c22p/c33c/cl00p.
GRUPPO
h}
2 c22p/c33c/cl00p.
GRUPPO
i)
l c33c/c l 00p/NS5
Discussione
La comparazione dei dati ottenuti sui gruppi totali, sia di "Donatori Conosciuti",
che di "Nuovi Donatori", con quelli relativi a corrispondenti campioni di popolazione di
donatori testati con la 2a generazione del test evidenziano un aumento dei valori
percentuali di reattività ripetute con i test di 3a generazione e valutabili nell'ordine del
52,5% per il gruppo "Donatori Conosciuti"
e del 25,53% per il gruppo "Nuovi
Donatori" (Tav. 3). L'andamento distributivo delle prevalenze delle reattività ripetute,
216
più
per i "Donatori Conosciuti" che per i ''Nuovi Donatori" subisce una vanaz10ne
significativa a seconda delle aree geografiche interessate, (Figg. 1-2).
La comparazione dei dati ottenuti con l'immunoblotting RIBA-3 dei campioni RR
con quelli riferiti al RIBA-2 dimostra che per i "Donatori Conosciuti" si è verificata una
diminuzione dei risultati positivi ed indeterminati pari rispettivamente al 12,82% e al
10,42%, mentre si è determinato un aumento del 13,58% dei risultati negativi_ La stessa
comparazione effettuata sui risultati dei "Nuovi Donatori" ha invece messo in evidenza
un aumento moderato, pari al 4,43%. dei risultati positivi, un aumento rilevante, pari al
18,71%, dei risultati negativi ed una ancora più rilevante diminuzione, pari al 22,38%,
dei risultati indeterminati (Tavv 4-5-6)
La valutazione dei dati, evidenziati dal RIBA-3 su1 campiom precedentemente
risultati indeterminati con l'immunoblotting di 2a generazione, ha mostrato la comparsa
di una reattività anti-c33c isolata nel 27% dei campioni, o accompagnata con reattività
diretta verso altri antigeni nel 18 o/o dei campioni. Laddove già presente in forma dubbia
(1±), la reattività verso l'antigene c33c si è potenziata da 3+ a 4+ nel 100% dei casi
La comparsa di reattività verso altri antigeni è stata rispettivamente dell'ordine del
20o/o per l'anti-ciOOp e del14o/o per l'anti-NSS
Conclusioni
Dall'analisi dei dati globaJi, fomiti dai Centri partecipanti, si evidenzia che la 3a
generazione dei test ELISA HCV Ab ha dimostrato uno spiccato aumento della sensibilità
con conseguente diminuzione della specificità. Da11a parametrazione con i dati precedenti
si evidenzia che a1 rilevante aumento percentuale delle reattività ripetute, sia nella
popolazione
di
"Donatori
Conosciuti",
che
in
quella
di
"Nuovi
Donatori",
l'immunoblotting di 3a generazione fa corrispondere nei "Donatori Conosciuti" una
rilevante diminuzione dei positivi e degli indeterminati con marcato aumento dei negativi
Risultati sovrapponibili, specie per i negativi e gli indetenn_inati si hanno anche dalla
valutazione dei campioni appartenenti alla popolazione di "Nuovi Donatori".
l'
217
Questa caduta della percentuale degli indeterminati, confermata nettamente anche
dall'analisi dei risultati ottenuti col
il RIBA-2, dimostra
RIBA~3
umi migliorata,
sui 74 campioni testati precedentemente con
indubbia, precisione conclusiva dell'immunoblotting
di 3a generazione.
3,5
3
Figura 1
HCV-RR: PREVAI.ENZE (%)IN DONATORI CONOSCJlm
DISTAI BUllONE NELLE DIVERSE AREE GEOGRAfiCHE
\'
2,5
2
----·---- CJm'll'IW
1,5
Agura 2
HCV-RR: PREVALENZA.(%) NEI NUOVI DONATORI
20
18
DISTAIBU210NE NELLE DIVERSE AREE GEOGRAfiCHE
16
14
12
10
8
6
<;l
0········-
--<•>-- 91!JIIll
flA
4
2
."'
,j,
t:~lii·III·~M-·111 ~---•·"'
o+r~~~~~~~~~~=s~E!~G!:·!-~-~-~-~·=-•··:~~~~-•:-~·~
1
234567B91011n~u~~u~~20~~~~~~~~
218
Tavola 1
Tavola 2
219
HCV-RR: COMJ ARAZIONE PREVALENZE (%)ANNI 1993-1994
l
l
l
DONATORI CONOSCIUTI
NUOVI DONATORI
(I!J!JJ- 465.8!}6 / l!J!H •116.1!}4)
(1993 •161.187 / l!J!H .. 22.831)
ANNO
UOIIIII
DONNE
TOTALE
OII!NI
1993
0,21
0,23
0,19
1,08
1994
0,42
0,35
0,4
14r 1,45
'
Tavola 3
Tavola 4
DONNE
TOTALE
1,3-- -1,05-
---.-
1,41-
.,..,.
220
Tavola 5
{
}
221
VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITA' DEI SAGGI DI SCREENING ANTIHCV
NEI
SERVIZI
TRASFUSIONAU
(S.T.)
ITALIANL
RISULTATI
RELATIVI AL TRIENNIO 1992/94.
Maria Orlando*, Alessandra Barca•, Flavia Chiaretti**, Giuseppina Ruggia*, Giuseppe
Pizzocolo***
Laboratori di Biochimica Clinica• e Fisiopatologia di Organo e Sistema** - Istituto
Superiore di Sanità • Viale Regina Elena, 299 - 00161 Roma.
••• Università degli Studi di Brescia, Cattedra di Chimica Clinica - Piazza Spedali Civili
-25100 Brescia.
Nel quadro delle attività promosse in Italia per la lotta all'AIDS, nel 1988 la
Commissione Nazionale AIDS ha proposto l'organizzazione di un programma nazionale
di valutazione esterna di qualità dei saggi per la ricerca degli anticorpi diretti contro il
virus dell'immunodeficienza (HIV) eseguiti presso i Servizi Trasfusionali (S. T.) Italiani.
Più recentemente (1992), il programma è stato esteso ai saggi per la ricerca dell'antigene
di superficie del virus dell'epatite B (HBsAg) e degli anticorpi diretti contro il virus
dell'epatite C (HCV).
Scopo del progranuna è di:
- misurare la capacità dei S. T. nell'eseguire correttamente i saggi di screening effettuati
obbligatoriamente sulle unità di sangue donato;
- paragonare i risultati ottenuti con reagenti diversi ed in condizioni routinarie nei
diversi S. T.;
- fornire ai S. T. un metodo di autovalutazione delle proprie prestazioni e di controllo
dell'efficacia dei programmi adottati per garantire la qualità globale del laboratorio.
Il monitoraggio dei saggi di screening obbligatori da parte dell'Autorità Sanitaria
consente altresì di mantenere sotto controllo le prestazioni dei S. T., e quindi la qualità
del sangue trasfuso sull'intero tenitorio nazionale.
222
Materiali e metodi
L'organizzazione e l'esecuzione del programma sono state affidate all'Istituto
Superiore di Sanità (ISS); collaborano al programma la Cattedra di Chimica Clinica
deWUniversità di Brescia ed il Servizio di Immunoematologia e Trasfusione del
Policlinico di Milano che, insieme ali'ISS, fungono da Laboratori di riferimento nei quali i
campioni vengono analizzati e caratterizzati prima della spedizione.
La partecipazione al programma è volontaria e gratuita; è garantita la confidenzialità dei
risultati
Il modello operativo dello schema prevede l'invio quadrimestrale di pannelli di sieri,
a diversa reattività o negativi, opportunamente codi~cati.
Il materiale distribuito per la determinazione degli anticorpi anti-HCV è costituito
da pannelli di sieri umani liquidi ottenuti da "pool" di donatori di sangue negativi o da
singoli pazienti positivi. l campioni positivi presentano differente reattività nei confronti
dei diversi determinanti antigenici: in particolare, sono stati scelti campioni positivi per
gli anticorpi diretti contro gli antigeni C22, C33, sia isolati che combinati tra loro o con
anticorpi diretti contro altri antigeni virali (C 100, 5.1.1, NS5).
Ai campioni vengono aggiunti come conservanti mertiolato di sodio e solfato di
neomicina (0.01 glmL). l campioni vengono congelati a ·30°C e mantenuti a tale
temperatura fino alla loro distribuzione ai S.T., che avviene entro 30 giorni dalla
preparazione.
I saggi di stabilità sono eseguiti dai Laboratori di riferimento.
l S. T. devono effettuare il saggio entro 20 giorni dal ricevimento ed inviare i risultati
ottenuti, riportando li su opportuni modelli, all'ISS che li analizza. In tempi brevi (entro
15 giorni dalla chiusura del saggio) i S. T. partecipanti ricevono la decodifica dei
campioni con i risultati attesi.
Successivamente i dati vengono elaborati mediante Package BMDP, caricato
neU'elaboratore centrale Siemens 7·890 del servizio Elaborazione Dati deU'lSS, e viene
preparato un rapporto contenente:
l) l'analisi della prestazione per singolo S. T.;
)
.
223
2) la sintesi dei risultati ottenuti per ogni campione in tutti i S. T.
Risultati e conclusioni
I risultati qui riportati si riferiscono ai tre anni di effettuazione del programma (I 992194).
Partecipazione
I S. T. partecipanti sono passati da 263 nel 1992 a 275 nel 1994; anche la percentuale di
risposte inviate è aumentata raggiungendo nel 1994 il 96% circa dei S. T. partecipanti
(Fig. 1). ciò testimonia una crescita culturale riguardo al problema della sicurezza nelle
trasfusioni ed evidenzia un maggiore interesse per i programmi di controllo di qualità.
Uso dei kit
I kit utilizzati sono rimasti essenzialmente invariati negli anni J992w93; nel 1994 i
kit di seconda generazione sono stati in gran parte sostituiti da queUi di terza
generazione. La maggior parte dei S. T. utilizza lo stesso kit per il test di screening e per
l'eventuale ripetizione ma nel corso degli anni sono aumentati i S. T. che eseguono le due
analisi con kit diversi (Fig. 2).
Accuratqzp
Per quanto riguarda la capacitè di identificare correttamente i campioni la
percentuale di successo è stata elevata per i campioni negativi (circa
~lo)
senza grandi
differenze nei tre anni; per i campioni positivi. nei tre anni di esecuzione del programma,
si è passati dal 97"/o di corretta identificazione nel 1992 al 99.3% nel 1994. La maggior
parte dei campioni non identificati come positivi sono stati classificati come indetenninati
mentre è minore la percentuale di falsi negativi (Fig. 3).
La ripetitività dei saggi, misurata daJ confronto dei risultati ottenuti nello screening
e nella ripetizione indipendentemente dalla concordanza del risultato ottenuto con quello
atteso, è passata dal 77.3% nel 1992 all'81.2% nel 1994 - per questi campioni, peraltro,
risulta elevata anche l'accuratezza (Fig. 4).
224
Riproducibilità
Nel 1994 un campione (C22/C33) è stato inviato in duplicato sotto due codici
diversi per valutare la riproducibilità within assay. La percentuale di riproducibilità
ottenuta è elevata (99.2%).
Analisi degli errori
In tabella l viene riportata la distribuzione degli errori riscontrati nel corso dei tre
anni. Oltre ad errori della fase analitica propriamente detta, sono stati riscontrati errori
anche nella fase post-analitica. Si osservano, infatti, numerosi errori di trascrizione dei
dati; in molti casi non vengono rispettati le formule per il calcolo del cut-off e i criteri di
validità del saggio (limiti dei valori di D. O. per i controlli) per i quali il kit ha ricevuto
l'autorizzazione al commercio.
Tabella l.
ANTI-HCV
Distribuzione numerica degli errori
TIPO DI ERRORE
Classificazione
Coerenza
Calcolo Cut-Off
Formula Cut-Off
Validità del saggio
Metodi non EIA
Trascrizione
1992
46
54
100
90
71
13
39
1993
20
70
88
91
71
10
47
1994
28
8
182
83
32
9
134
l
)
225
S.T.
N.
400-
O Partecipanti
O Rispondenti
300
268
......... 245 91.4%)
263
. - 239
.··•••·····•
275 263
95.6%)
<
........ ·_._.·.
91%)
2001...
. . ·: . ....
1001-
1992
1993
1994
Figura l
PARTECIPAZIONE DEI S. T.
AL PROGRAMMA DI V.N.E.Q.
226
l
Altri
B:lORGANON • UID HCV EIA EJoRTHO. HCV l. Gen.
OoRTHO • HCV 3. Gcn.•
0ABBOTT • HCV l.Gen.
i':lABBOTT • HCV J.Gen.•
• In commercio dal 1994
S.T. che usano lo stesso kit per screening e ripetizione
1994 = 76.1%- 1993 = 77.1%- 1992 = 85.8%
Figura 2
ANTI-HCV
Distribuzione dei kit
(
l
227
~
100
-"'
·~
-~
75
-~
o
"
~:lo
·~
c:o
.~
Q,
..
50 c
=
u"
25
'
-
..
....
,--
)
Direttore dell'Istituto Superiore di Sanità
e Responsabile scientifico: Giuseppe Vicari
Direttore responsabile: Vi/ma Alberani
Stampato dal Servizio per le auivilà editoriali
dell'Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena, 299- 00/61 ROMA
La riproduzione parziale o totale dei Rapporti c Congressi ISTISAN
deve essere preventivamente autorizzata.
Reg. S1ampa ·Tribunale di Roma n. 131188 del / 0 marzo 1988
Roma. mano 1995
(n.
l)
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(