Uso della biodiversità vegetale per la produzione di nuovi

Napoli, 29 Aprile 2010
Uso della biodiversità vegetale
per la produzione di nuovi farmaci
Teodoro Cardi
CNR-IGV, Istituto di Genetica Vegetale, Consiglio Nazionale
delle Ricerche, Portici
Napoli, 29 Aprile 2010
Molecole naturali
Metaboliti Secondari delle Piante
Interagiscono con target
molecolari di organismi che
competono con le piante
(patogeni, microrganismi, altre
piante, animali)
ca 100 000 differenti
metaboliti secondari
già descritti
Napoli, 29 Aprile 2010
10% di quelli
presenti in natura
Risorse Genetiche Vegetali
Come fonte di sostanze nutriceutiche per la prevenzione e la cura di malattie
Sostanze
Malattie
Carotenoidi
(>700)
cancro prostata/
stomaco,
cardiovascolari,
degenerazione
maculare
Glucosinolati
(>100)
Fitoestrogeni
(>200)
Sostanze
fenoliche
(>4000)
Napoli, 29 Aprile 2010
cancro
cardiovascolari
osteoporosi.
cancro del seno,
prostata, colon
cardiovascolari
cancro
Esempi di composti bioattivi
licopene (pomodoro)
luteina (spinaci)
glucorafanina
(broccoli)
genisteina, daidzeina
broccoli
(soia, altri legumi)
resveratrolo
(uva, vino)
Risorse Genetiche Vegetali
Utilizzo farmaceutico di alcune piante
SPECIE
Cynara scolimus
Matricaria chamomilla
Artemisia vulgaris
Artemisia annua
Taraxacum officinalis
Aster spp.
Asparagus officinalis
Allium sativum
Allium cepa
Melissa officinalis
Salvia officinalis
Lavandula angustifolia
Capsicum annuum
Rosa canina
Fragaria vesca
Verbena officinalis
Napoli, 29 Aprile 2010
PROPRIETA’
Ipocolesterolemizzante
Antinfiammatoria
Sedativa
Antimalarica
Tonica
Anticancerogena
Diuretica
Ipotensiva-antisettica
Ipoglicemizzante
Coleretica
Antisettica
Antispasmodica
Vitaminizzante
Antinfiammatoria
Diuretica
Antireumatica
Prodotti farmaceutici naturali
• Identificazione di
nuovi prodotti
Estrazione e produzione
di biomolecole da piante
• Aumento e/o modificazione
della sintesi di molecole
bioattive già prodotte in pianta
! Raccolta piante
spontanee /
coltivazione
! Sintesi chimica (non
sempre possibile o
economicamente
vantaggiosa)
! Colture di cellule
e/o tessuti
Napoli, 29 Aprile 2010
Prodotti farmaceutici naturali
I metaboliti secondari sono sintetizzati a bassissime concentrazioni
(< 1% del peso secco) ! Alti costi di estrazione e purificazione
Vincristina e Vinblastina
(C. roseus)
Tassolo (T. brevifolia)
Un albero di Taxus di 200 anni alto 13 metri
produce solo mezzo grammo di Paclitaxel
Per il trattamento di un paziente è necessario
tagliare e processare 6 alberi di 100 anni!
500 kg di materiale vegetale per ottenere
1 g di vincristina (~13 000 ! / g)
Napoli, 29 Aprile 2010
Necessità di aumentare
la sintesi per ridurre i costi
e l’impatto ambientale
Produzione di biomolecole
di origine vegetale su larga scala
Es. Silphion (Apiaceae)
Estinta ca 250 BC
Raccolta
in natura
Perdita
biodiversità
! World Health Organization Guidelines,
Geneva 2003
Good agricultural and collections
practices (GACP) for medicinal plants
! Convention on International Trade in
Endagered Species of Wild Fauna and
Flora (CITES)
Napoli, 29 Aprile 2010
Disponibilità scarsa
e in Paesi “deboli”
Domesticazione delle specie d’interesse medicinale
Erosione Genetica
Coltivazione spesso non
possibile per mancanza di
genotipi adattati e di
tecniche agronomiche
Nuove aree per la ricerca
Specie
selvatiche
Inizio della
domesticazione
Varietà
moderne
Riso coltivato
Riso selvatico
Pomodoro coltivato
Pomodoro selvatico
Napoli, 29 Aprile 2010
Tanksley & McCouch, 1997
Utilizzazione della biodiversità per la produzione
di farmaci nelle piante
In vivo
• Identificazione di nuove specie per la produzione di farmaci
• Caratterizzazione dei profili metabolici per le molecole
d’interesse in differenti tessuti e stadi di sviluppo
• Selezione di popolazioni / genotipi migliorati
• Sviluppo delle pratiche agronomiche per le specie introdotte
In vitro
• Sviluppo di protocolli per la coltura in vitro
delle specie selezionate
• Caratterizzazione dei profili metabolici durante
gli stadi in vitro
• Isolamento dei principali geni / fattori di
trascrizione per l’ingegneria metabolica dei
“pathway” metabolici d’interesse
• Sviluppo delle procedure di trasformazione
genetica per le specie selezionate
Napoli, 29 Aprile 2010
Colture in vitro di vegetali
L’insieme delle tecniche per la coltivazione di
espianti, organi, tessuti, piante e cellule in un
opportuno mezzo ed in condizioni di sterilità
Napoli, 29 Aprile 2010
Colture in vitro: proliferazione di gemme ascellari
Napoli, 29 Aprile 2010
Micropropagazione
Micropropagare significa moltiplicare la stessa pianta
in laboratorio senza ricorrere ai semi
Coltura in vitro di Aconitum, una
pianta medicinale di alto valore
Napoli, 29 Aprile 2010
Colture in vitro: differenziamento di gemme avventizie
Napoli, 29 Aprile 2010
Colture in vitro: embriogenesi somatica
Singola cellula
Cluster di cellule
Stadio globulare
Stadio a cuore
Barcaccia & Falcinelli 2006
Stadio a torpedine
Napoli, 29 Aprile 2010
Semi artificiali
"Propaguli bipolari (embrioni somatici, microbulbilli) o unipolari (gemme) sono
miscelati con alginato di sodio e immersi in una soluzione di nitrato di calcio
Barcaccia & Falcinelli 2006
Napoli, 29 Aprile 2010
Conservazione germoplasma
Rallentamento crescita in vitro
• aggiunta nel substrato di sostanze che aumentano la pressione
osmotica (mannitolo, sorbitolo)
• riduzione temperatura
Crioconservazione (= conservazione in N2 liquido)
•periodo limitato di pre-crescita
•uso di sostanze crio-proteggenti (es. DMSO)
Napoli, 29 Aprile 2010
Colture in vitro: crescita indifferenziata
(colture di calli / cellule in sospensione)
X
Barcaccia & Falcinelli 2006
Napoli, 29 Aprile 2010
Colture in vitro
Esempi di composti naturali bioattivi d'interesse farmaceutico attualmente in commercio prodotti da colture
cellulari di specie medicinali (adattata da Kolewe et al. 2008)
Metabolita
Specie
Uso
Produttore
Coleus blumei
anti-infiammatori o
Nattermann (Germania)
Geramineae spp.
antitumorale
Mitsui Petrochemical
Industries (Giappone)
Panag ginseng
integratore alimenta r e
Nitto Denko (Giappone)
Taxus spp.
antitumorale
Phyton Biotech (USA),
Samyang Genex (Corea )
Echinacea purpurea,
Echinacea angustifol i a
anti-infiammatorio
immunostimolant e
Diversa (Germani a )
Coptis japonica,
Thalictrum minus
antibiotico, antiinfiammatori o
Mitsui Petrochemical
Industries (Giappone)
Sciconina
Lythospermum
erythrorhizon
antivirale (HIV),
antitumorale, antiinfiammatori o
Mitsui Petrochemical
Industries (Giappone)
Scopolamina
Duboisia spp.
anticolinergi c o
Sunitomo Chemical
Industries (Giappone)
Acido
rosmarinico
Geraniolo
Ginseng
Paclita x e l
Polisaccari d i
Protoberberina
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Elicitazione con metil-jasmonato
di hairy roots in Salvia sclarea
Non-trattate
700
600
500
400
300
200
Absorbance (mAU)
Uso di sostanze capaci
di attivare una risposta
di difesa nella pianta
(Elicitazione)
• MeJ
• SA
• Filtrati colturali
100
20
25
30
35
Retention time (min)
Absorbance (mAU)
1
A. Leone
DiFARMA
UNISA
Napoli, 29 Aprile 2010
700
600
2
1 2
4
5 Methyl-jasmonate
8
5
3
150 "M
36
500
7
400
300
12
8
200
100
20
25
8 4
6
4
30
Retention time (min)
7
S. sclarea plants
synthesize antitumoral
diterpenes (e.g.
aethiopinone)
5.6 µg/mL ! 273 µg/mL
35
~ 50-fold increase!!
Ibridazione di specie medicinali
Obiettivi
! Differenze quantitative per il contenuto dei metaboliti
d’interesse negli ibridi rispetto ai genotipi parentali
! Differenze qualitative per il contenuto dei metaboliti d’interesse
negli ibridi rispetto ai genotipi parentali ! Nuovi metaboliti
L’entità ed il tipo delle differenze dipendono dai genotipi
parentali e dalla loro distanza filogenetica
Napoli, 29 Aprile 2010
Ibridazione somatica
Barcaccia & Falcinelli 2006
Napoli, 29 Aprile 2010
Ibridazione somatica in Solanum spp.
" S. brevidens
" S. tuberosum
Rispetto ai genotipi parentali, negli
S. tuberosum
ibridi somatici sono state trovate
differenze quantitative e qualitative
per il contenuto dei metaboliti
Biochimica combinatoriale
(Oksman-Caldentey & Inzè 2004)
Napoli, 29 Aprile 2010
Laurila et al. 1996
S. brevidens
Approcci molecolari
Genomica
Trascrittomica
Sviluppo di marcatori
per la caratterizzazione
genetico-molecolare
Proteomica
Metabolomica
Isolamento e studio della
funzione dei geni chiave
Trasformazione genetica per
approcci d’ingegneria metabolica
1 2 3 2 23 2 3 2 3 3 3 2 3 3 2 2 3 2 3 2 2
da altre piante
Geni
1 Salvia officinalis; 2 Hypericum; 3 A. belladonna
dalla stessa pianta
aumentare #
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diminuire $
espressione di un gene
I marcatori molecolari
I marcatori molecolari sono degli strumenti che ci
permettono d’identificare una pianta indipendentemente
dalla sua età e aspetto
Un impronta
digitale consente
di identificare una
persona dal suo
dito
Napoli, 29 Aprile 2010
I marcatori molecolari
delle piante hanno in
agricoltura lo stesso
valore delle impronte
digitali negli studi
forensi!
I marcatori molecolari a
DNA consentono di
identificare una pianta
dall’analisi del suo DNA
Trasformazione di piante medicinali: ingegneria metabolica
…………………………….………
Napoli, 29 Aprile 2010
Kutchan 1995 (mod.)
In una pianta transgenica l’espressione di un
gene può essere aumentata o diminuita
Sovra-espressione
Trasformazione senso
• gene già presente nel genoma
della pianta da trasformare
• gene assente nel genoma
della pianta da trasformare
(es. gene batterico, gene di
una specie diversa)
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Inibizione
• Trasformazione
anti-senso
• “RNA interference”
• gene già presente nel genoma
della pianta da trasformare
Produzione di piante “Antisenso”
GENE
GENE
5’
mRNA
5’
Formazione di un duplex
3’
mRNA antisenso
Traduzione
bloccata
CaMV35S
Ter nos
L’RNA antisenso si appaia con quello endogeno e gli impedisce di
essere tradotto dai ribosomi
Napoli, 29 Aprile 2010
Punti di controllo di flussi metabolici nelle piante:
possibili strategie di ingegneria metabolica
Controllo del flusso metabolico in un pianta
PRECURSORE
A
Modificazione del flusso metabolico
&
Geni regolatori
(fattori di trascrizione)
Enzima
limitante'
Inibizione feedback
B
#
Pathway
competitivo
F
D
%
E
PRODOTTO
FINALE
$
Compartimentalizzazione
mt
ER
V
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C
ch
'
Sovra-espressione di un gene/i che
regola una reazione limitante
(costitutiva, inducibile o tessutospecifica)
%
Silenziamento di pathway
competitivi (antisenso, RNAi)
#
Eliminazione di inibizioni da
feedback
$
Miglioramento
compartimentalizzazione/trasporto
&
Regolazione coordinata di geni
biosintetici mediante
sovraespressione di geni regolatori
n
A. Leone
DiFARMA
UNISA
Fattori di trascrizione
Controllo della sintesi di alcaloidi
indolterpenoidi in C. roseus
da parte di ORCA3 (
)
Napoli, 29 Aprile 2010
Gantet & Memelink 2002; Canter et al. 2005
Hairy roots
Agrobacterium rhizogenes
Napoli, 29 Aprile 2010
Guillon et al. 2006a, 2006b
Hairy roots
Napoli, 29 Aprile 2010
Georgiev et al. 2007
Conclusioni e prospettive
! Le piante possono essere utilizzate per la produzione industriale di
molecole naturali bioattive (metaboliti secondari), con ampie
prospettive di mercato
! Il livello di produzione è però di fondamentale importanza per un
uso industriale. L’insufficiente disponibilità di molecole naturali ha
anche delle implicazioni ecologiche e sulla biodiversità
! Possibili aree di ricerca includono lo sviluppo di tecniche agronomiche
per la coltivazione delle specie d’interesse e la selezione di genotipi
adattati
! Gli studi di genomica e le biotecnologie cellulari e molecolari possono
giocare un ruolo importante per un uso delle piante più conveniente,
ma anche più rispettoso per la tutela della biodiversità
Napoli, 29 Aprile 2010