Fattori di crescita Membrana citoplasmatica Recettori di fattori di crescita Proteine trasduttrici del segnale Nucleo Fattori trascrizionali Proteine del ciclo cellulare Ciclo di divisione cellulare I secondi messaggeri tirosinchinasi GAP PLC adattatori Le Proteine G Receptor associated binding proteins c-ras family Le Proteine G MONOMERICHE Ras, Rho, Rab, Arf, Ran ETEROTRIMERICHE GDP α β γ Le proteine G monomeriche (e la subunità Gα delle eterotrimeriche) “ciclano” tra le forme che legano GDP o GTP GDP inattiva GTP attiva Effettore Ras (p21ras) è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il GTP o il GDP e ha un’attività GTPasica intrinseca Il fattore di scambio del nucleotide guanidinico interagisce con ras p21ras GTP INATTIVA p21ras ras attivata interagisce con il componente successivo della catena di signalling e l’attiva GDP GDP GTP p21ras ATTIVA Pi Ras GTPasi stimolata dall’associazione con la GTPase-activating protein (GAP) p21ras GDP L’attività GTPasica intrinseca idrolizza il GTP a GDP e Pi Alcune proteine legano e aiutano le GTP: GAPs, GTPase Activating Proteins, promuovono l’idrolisi del GTP. GAP may provide an essential active site residue, and/or promote a conformation that favors catalysis. Le RGS proteins, which are negative regulators of G protein signaling, function as GAPs to stimulate GTP hydrolysis by Gα. GEFs, Guanine Nucleotide Exchange Factors, promote GDP/GTP exchange. The activated receptor (GPCR) serves as GEF for a heterotrimeric G protein. insulina GTP SOS GRB2 Ras attivo P P P P Recettore Recettore inattivo attivo Ras attivato attiva la via MAPK attraverso la chinasi Raf GTP Raf attivo e localizzato sulla membrana ATP Ras Pi Raf ADP MEK Raf inattivo e citosolico Raf ERK Attivazione di fattori di trascrizione ligandodipendenti Ras attivato attiva la via MAPK attraverso la MAPKKK Raf ras GTP ras GTP Raf attivo e localizzato sulla membrana Raf inattivo e citosolico legato alle proteine 14-3-3 Ras è un Oncogene p21ras comprende quattro proteine correlate: H-Ras (Harvey), K-Ras (Ka e Kb-, Kirsten) e N-ras (neuronal) p21ras è associato alla membrana tramite farnesilazione di un amminoacido ciascuna isoforma differisce pricipalmente nel C-terminale da modificazioni posttranscrizionali. miristico Gαs farnesilico palmitico ras Gα βγ βγ farnesilico Gα Geranil-geranilico Gα βγ a tre delle quattro isoforme è aggiunto un gruppo palmitoilico Mutazioni attivanti di p21ras lo bloccano nello stato GTP-legato βγ Ras Gli oncogeni ras sono generati nel tumore da mutazioni in seguito ad esposizione ad agenti carcinogeni La mutazione puntiforme con conseguente sostituzione della valina con una glicina causa soltanto una leggera alterazione nella struttura tridimensionale di Ras. Sono state anche riscontrate altre sostituzioni di amminoacidi in posizione 13 e 61, negli oncogeni ras nei tumori umani. Oltre alla mutazione dominante nel gene ras, anche una mutazione recessiva di perdita di funzione nel gene NF1 conduce all'attivazione costitutiva di Ras. NF1 codifica per GAP. Gene Funzione Tumori associati a mutazioni somatiche NF-1 Inibizione di ras Shwannomi Tumori associati a mutazioni ereditarie Neurofibromatosi tipo 1 Gli individui con neurofibromatosi hanno ereditato un singolo allele del mutante NF1; la mutazione somatica successiva nell'altro allele conduce a formazione dei neurofibromi, tumori benigni delle cellule che circondano i nervi. Recettore attivato tirosin chinasi Ras P-Y Y-P P-Y Y-P Sos GDP Shc Grb2 GTP NF-1 è una GAP (GTPase Activating Protein) Ras Gap Raf GTP NF1 Ras GDP GDP Forma inattiva Segnale a valle Forma attiva Ras Le mutazioni puntiformi nella famiglia dei protooncogeni ras sono state osservate nel 15% - 20% dei tumori umani. Le mutazioni attivanti di K-ras sono trovate nel 30% degli adenocarcinomi del polmone, nel 50% dei carcinomi del colon ed nel 90% dei carcinomi del pancreas. Le mutazioni di N-ras sono trovate preferenzialmente nei tumori ematologici, con un'incidenza fino al 25% nelle leucemie mieloidi acute e nelle sindromi mielodisplastiche. I membri della famiglia del gene di ras sono sporadicamente amplificati in vari carcinomi. Per ricevere il segnale di attivazione dai recettori dei fattori di crescita, il ras deve essere ancorato sotto la membrana cellulare in prossimità del dominio intracellulare dei recettori. Tale ancoraggio è reso possibile dall’attacco di un gruppo FARNESILICO che forma dei ponti tra il ras e la membrana. Inibitori dell’enzima farnesiltransferasi possono inattivare il ras. Numerosi inibitori FT sono sati sintetizzati: FTIs sono ben tollerati e la loro tossicità è generalmente reversibile. Tipifarnib (R115777-Zarnestra) e Lonafarnib (SCH-66336-Sarasar) BMS-214662 per via intravenosa. somministrati per via orale, mentre Questi composti hanno effetti antitumorali in vivo in animali. Come singoli chemoterapici hanno effetto nelle leucemie mieloidi. In tumori solidi l’attività appare modesta, ma FTI probabilmente sono utili in combinazione con altri agenti citotossici. ISIS2503 è un oligonucleotide antisense del mRNA di K-ras. I risultati preliminari non hanno dimostrato risposta obiettiva o alcune stabilizzazioni di malattia nel cancro polmonare Drugs that inhibit mutant KRAS expression or function Clinics in Chest Medicine , march 2002 Vol 23 n°1:83 Drugs that block specific downstream signals active KRAS Inactive KRAS Inactiv e KRAS GAP GAP MAPK/ERK In vitro è stato dimostrato che l’inibizione di Raf-1 kinase con ISIS 5132 induce apoptosi in cellule tumorali; in vivo, l’attività antitumorale è confermata in dosi nel range da 10 a 20 mg/kg Inibitori di MEK Il binding dell’ adrenalina al suo recettore attiva una G proteina β γ α La subunità α della G proteina media l’attivazione dell’ adenilato ciclasi che porta alla produzione di AMP ciclico (AMPc) La subunità catalitica della PKA fosforila CREB* e attiva la trascrizione ATP GTP 2Pi Protein chinasi A (PKA) inattiva La subunità libera della PKA migra nel nucleo Nucleo ATP ADP P La subunità regolatrice della PKA lega l’AMPc… …e si dissocia dalla subunità catalitica P Ciclo di attivazione/inibizione delle proteine G accoppiate a recettori a 7 domini 1. L’ormone lega GPCR, causa un cambio conformazionale al recettore che è transmesso alla G-protein. Ga rilascia GDP e lega GTP (GDP-GTP exchange). Ciclo di attivazione/inibizione delle proteine G accoppiate a recettori a 7 domini 2. La sostituzione di GTP con GDP causa un altro cambio conformazionale in Gα. Gα-GTP si dissocia dal complesso inibitorio βγ e può legare e attivare l’Adenilato Ciclasi. 3. L’Adenilato Ciclasi, catalizza da sintesi di cAMP. 4. La Protein Kinase A (cAMP Dependent Protein Kinase) catalizza il trasferimento di un fosfato da ATP su residui di serina o treonina di diverse proteine. Ciclo di attivazione/inibizione delle proteine G accoppiate a recettori a 7 domini 5. Gα idrolizza GTP in GDP + Pi (GTPasi): Quindi si riassocia il complesso di Ga al complesso βγ Adenilato Ciclasi non è più attivato. 6. Le Fosfodiesterasi catalizzano l’idrolisi di cAMP in AMP. L’oncogene gsp, che codifica le subunità delle proteine G, è generato dalle mutazioni puntiformi. Queste mutazioni provocano l'attività costitutiva, portando a stimolo non regolato dell’adenilato ciclasi. L’ oncogene gsp è coinvolto nei tumori tiroidei e pituitari, in cui l’AMP ciclico stimola la proliferazione delle cellule. Mutazioni simili convertono i geni che codificano per altre subunità della proteina G in oncogeni in altri tipi di tumori, compresi i tumori delle surrenali e dell’ovario. Nonreceptor tyrosine kinases (32 total in 10 families) Src family CSK family FAK family JAK family C-terminal Src kinases Quale è la funzione cellulare di c-Src? 1. Codificata da un proto-oncogene. - attività deregolata promuove la proliferazione aberrante 2. Espressa ubiquitariamente. - più alta in piastrine, neuroni e osteoclasti - molti funzioni non necessariamente correlate con la proliferazione 3. Topi src -/- sono sani, nascono e sopravvivono per anni. - non hanno difetti nelle funzioni neuronali e delle piastrine - compensato da altre chinasi della famiglia di Src Espressione delle chinasi della famiglia di Src Src Fyn Yes Ubiquitario Ubiquitario Ubiquitario Lyn Hck Fgr Blk Lck Brain, B-cells, myeloid cells Myeloid cells Myeloid cells, B-cells B-cells T-cells, NK cells, brain 4. src/fyn/yes tripli knockout l’embrione muore a metà-gestazione. - cellule hanno difetti nella motilità ma non nella proliferazione - difetti nella motilità revertiti dalla re-espressione di c-Src 5. c-Src and v-Src si localizzano prevalentemente nelle adesioni focali. - consistente con il suo ruolo nella motilità cellulare Src contiene tre dominii presenti anche in altre proteine Lega sequenze ricche in polyproline Dominio fosforilante myristate palmitate Lega proteine fosforilate in Tyr Site whose phosphorylation by Csk DECREASES Kinase activity La fosforilazione della tirosina terminale crea una interazione intramolecolare inibitoria Src è di norma inattivo a causa della inibizione intramolecolare La struttura tridimensionale di Src Xu et al. Nature. 1997 385:595-602 L'attività chinasi di questa proteina è inattivata normalmente da fosforilazione del residuo della tirosina in posizione 527, che è posta a sei residui dal C-terminale. La tirosina in posizione 527 è spesso mancante o alterata nelle oncoproteine Src, a causa della delezione di 18 amminoacidi del suo C-terminale, di conseguenza la chinasi è costituzionalmente attiva; cioè non richiede l'attivazione da una fosfatasi. La fosforilazione delle proteine target da parte delle oncoproteine aberranti Src contribuisce alla proliferazione anormale di molti tipi cellulari. Activation/VEGF ! One of the signaling pathways that c-Src is involved in is the VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) Involment of c-Src in the VEGF pathway SABiosciences, ProteinLounge.com Le placche di adesione, per mezzo delle quali le cellule interagiscono con ECM da una parte e con le actine citoscheletriche dall’altra, sono siti di intensa fosforilazione in tirosina. Green = actin Red = pTyrosine Yellow = costain (focal adhesions) Adesioni Focali Lamina basale! Adesioni Focali: Regioni specializzate della membrana plasmatica formate ai siti dove le cellule aderenti legano il substrato ECM Filamenti Actina ! Adesioni Focali! ECM - Siti di clasterizzazione delle integrine, recettori per le glicoproteine adesive dell’ECM - Siti di ancoraggio dei filamenti di actina >> invasione e motilità cellulare costituiti da due subunità α e β (esistono 16 α e 8 β per un totale di 22 distinte integrine) mediano l’adesione tra la cellula e le proteine dell’ECM, quali fibronectina, laminina, collagene e, in alcuni casi, anche con “contro-recettori” di altre cellule quali “intracellular cell-adhesion molecule-1” (ICAM-1) e “vascular cell-adhesion molecule-1” (VCAM-1) Fisiologia Cellulare e Molecolare AA 2009-2010 - Parte 3° ECM Struttura delle Integrine ligandi: Legame con molecole della ECM es. fibronettina, collageno, vitronectina, α β ligandi solubili es. fibrinogeno membrana plasmatica citoplasma Legame al citoscheletro e molecole di segnalamento proteine che legano l’actina es. vinculina, a-actinina, talina, Proteine che legano i filamenti intermedi es. plakoglobina Molte molecole di segnalamento es. tirosine chinasi L’ottimale segnalamento dell’integrina richiede sia occupazione dell’integrina sia la clasterizzazione dell’integrina CITOPLASMA Tensin FAK RGD Occupazione Actin stress fibres Talin a-actinin Vinculin Tensin FAK RGD RGD RGD RGD Clasterezzazione Occupazione e clasterizzazione a-actinin actin Tensin Pax Small GTPases FAK -Rho,Rac,cdc42 G src SS Cation-bindingM2+ D site G SP R G CITOPLASMA Tensin Pax FAK G src SS M2+ D G SP R G ECM glycoprotein eg fibronectin A seconda della taglia e della localizzazione le strutture possono essere contatti focali, adesioni focali, o adesioni fibrillari. I segnali trasdotti attraverso i complessi focali e le adesioni focali sono implicati in una serie di processi cellulari Le Integrine interagiscono con l’actina, con proteine della trasduzione e a recettori 1TM modulazione di canali del Ca2+ Clusterizzazione delle integrine riorganizzazione citoscheletrica Ca2+ Tirosin chinasi FAK (focal adhesion kinase) Serin treonin chinasi Src Rho Proteine G monomeriche Modulazione delle adesioni e delle giunzioni ciclina D - cki caspasi - p53 proliferazione sopravvivenza Complesso Adesione Focale COMPONENTI STRUTTURALI Talina è la struttura base delle adesioni focali, lega actina, vinculina, e FAK. a-actinina è una proteina di collegamento che può legare anche la vinculina. Vinculina lega actina e tensina. Segnalamento attraverso Integrina α β FAK Grb-2 PI3-K MAPK Proliferation Survival Akt Struttura di FAK (Focal Adhesion Kinase) tirosina chinasi non-recettore (come la famiglia Src –nuotante nel citosol Nck Crk Cas Sos Integrin ? Csk talin paxillin Crk FAT Region Amino Terminal Domain Kinase Domain Y925 Y397 Src Grb-7 Carboxy-terminal Domain Grb-2 PI3-K Sos FAT Region = Focal Adhesion Targeting Region Integrine, FAK, e MAPK Intracellulare Matrice Extracellulare fibronectina β integrina! α fibronectina 1! P src Paxillina fak MEMBRANA 2! 3! P! 4! Src Intracellulare 5! Organizazione del citoscheletro (rac, rho, ras) Segnalamento via ECM 1 Aggregazione integrine 2 Autofosforilazione di fak 3 Associazione fak/src 4 5! Nucleo 5 src fosforila fak risposte mitogenetiche 5 AND... FAK Dopo il legame al complesso attivato dell'integrina, FAK autofosforila la sua tirosina c-Src è una tirosin chinasi non recettore citosolica solitamente inattiva per la configurazione auto-impacchettata Questo fosfotirosina permette che FAK leghi i dominii SH2 di Src o Fyn fosforilandoli FAK legandosi attiva c-Src aprendola C-Src fosforila FAK di nuovo! c-Src chinasi FAK chinase solo legame SH2 domain of Grb2 Attivazione di JNK/NF-kB Sopravvivenza Cellulare (proteina adattatrice recrua RasGEF SOS alla membrana) attivano Ras-MAPK p85 subunità di PI-3K attivazione PKB/AKT Sopravvivenza e Propagazione .... e la adesione tra cellule e con la ECM • giunzioni strette • placche di adesione • citoscheletro Src substrates Src coordina la motilità cellulare e la adesione 3-dimensional structure of Src Active site Scientists have determined the precise 3-dimensional structure of Src Active site SU6656 Another Src inhibitor is in Phase I/II trials for metastatic pancreatic cancer Active site AZD0530 Attivazione di JNK/NF-kB JNK è un modulatore delle funzioni delle cellule epiteliali che è implicato in risposte opposte. Quando è attivato dalle integrine porta alla progressione del ciclo cellulare attraverso l’espressione di geni AP1. Le integrine attivano anche il fattore di trascrizione NF-kB, che promuove la sopravvivenza e l’angiogenesi. L'overespressione di integrine è un forte sostegno per le cellule del tumore Integrina α5β3 fortemente espressa sul fronte invasivo del melanoma maligno e dei vasi sanguigni angiogenici. Espresso a debolmente in nevi e vasi sanguigni quiescenti Integrina α6β4 fortemente espressa NON espressa durante la progressione dei carcinomi tiroidei nelle cellule tiroidee benigne Integrina α5β1 Ha un azione soppressiva del tumore. La sua espressione è persa in molti tumori Integrine e Cancro • Il profilo delle integrine cambia nella progressione di molti tumori solidi • Spesso, specifiche integrine sono perse • Transfezione per ripristinare l’espressione dell’integrina decrementa la tumorigenicità Espressione di αvβ6 in epitelio orale normale e carcinoma delle cellule squamose x33 epitelio normale x33 carcinoma Squamoso FAK Knockout mice • Embrioni letali – Embrioni hanno severi difetti morfogenici – Il numero delle adesioni focali è INCREMENTATO • Non difettano nella formazione delle adesioni focali, come fibroblasti FAK-/- fanno eccezionalmente larghe adesioni focali • Il difetto sembra essere nella dissoluzione dell’adesione focale, critica per la migrazione cellulare FAK e Cancro • In molti tumori solidi, l’espressione di FAK è aumentata • FAK può essere un marker di tumori invasivi e metastatici • Aumentate sopravvivenza e migrazione, funzioni dell’aumentata espressione di FAK fa di esso un attraente target per lo sviluppo di piccole molecole inibitorie come agenti antineoplastici FAK e SOPRAVVIVENZA • L’ingranaggio di FAK dall’integrina stimola un pathway della sopravvivenza • Il distacco delle cellule epiteliali dalla ECM provoca un tipo di apoptosi. ANOIKIS • La trasduzione del segnale procede attaverso altri enzimi di segnalamento che promuovono la sopravvivenza: FAK-PI3Kinasi-Akt-Bad-antiapoptosi • Questa funzione può essere la principale di FAK Fattori di crescita Membrana citoplasmatica Recettori di fattori di crescita Proteine trasduttrici del segnale Nucleo Fattori trascrizionali Proteine del ciclo cellulare Ciclo di divisione cellulare Fattori di Trascrizione Fattori di Trascrizione Legano specifiche sequenze (enhancer) del DNA Sono up-regulatori della trascrizione Rendono la regione del promotore accessibile alla RNA polimerasi II Molti fattori di trascrizione sono i bersagli finali di specifiche vie di trasduzione La croma(na ha un ruolo fondamentale nella regolazione della espressione genica e la capacità degli istoni di legare il DNA è regolata da enzimi intranucleari che possono apportare modificazioni post-­‐traduzionali sopra=u=o ai residui di lisina e arginina pos( nel dominio N-­‐terminale delle proteine istoniche MODIFICAZIONI POST-­‐TRADUZIONALI DEGLI ISTONI ace$lazione, fosforilazione, me$lazione, ubiqui$nazione Zhang Y , Reinberg D Genes Dev. 2001;15:2343-2360 Me$lazione degli istoni Nei vertebrati la metilazione interessa solamente la Citosina sul dinucleotide CpG: l’enzima citosina metiltransferasi aggiunge un gruppo metile al C5 della citosina: il risultato è la 5-metilcitosina. • Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma ma abbondanti nelle regioni promotrici dei geni • In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati, ad eccezione delle isole CpG dei promotori • Dnmt1 ha particolare affinità per le sequenze emi-metilate: tende quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato-> mantenimento del pattern di metilazione Generalmente la metilazione degli istoni si associa a repressione della espressione genica, tuttavia ci sono esempi in cui la metilazione si associa a attivazione della espressione genica (metilazione lella lisina 4 dell’istone 3, il coattivatore CARM1 è una metiltransferasi) PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’ DELLA CROMATINA ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE ASSOCIATA CON ACETILAZIONE L’ace(lazione dei residui di lisina al terminale NH degli istoni rimuove le cariche posi(ve riducendo quindi l’affinità degli istoni per il DNA: per questo l’ace(lazione degli istoni facilita i processi trascrizionali, al contrario, la deace(lazione reprime la trascrizione Ace(lazione e deace(lazione del residuo lisinico ACETIL TRANSFERASI ISTONICHE: histone acetyltransferases (HATs) DEACETILASI ISTONICHE: histone deacetylases (denoted by HDs or HDACs) Acetilazione degli Istoni • Diminuiscono la condensazione Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato Repressori: deacetilazione degli Istoni • • Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA – Acetilazione/ Deacetilazione • • Suberoyl anilide bishydroxamide SAHA Corepressori CoR, BcoR e CtBP. Uno dei meccanismi che favorisce la carcinogenesi è la repressione dei geni onco-soppressori. • • p21 p300/CBP TAF II 250 Classe I: HDAC1, 2, 3 e 8. Classe II: HDAC 4, 5, 6, 7, 9 e 10. ! Fattori di Trascrizione ! ! I fattori di trascrizione appartengono a ciascuna delle diverse classi basate su specifici tipi di domini di legame Molti contengono un α-elica, che si inserisce nel solco maggiore del DNA ! Legame fra αα e DNA via mediante: ! Forze di Van der Waals (hydrophobic) ! legami Ionici ! Legami idrogeno ! Motivi comuni ai fattori di trascrizione ! Zinc finger: Zn coordinato a due cisteine e due istidine ! Leucine zipper Cerniere di leucina ! Helix-loop-helix Elica –giro-elica 2 eliche separate da un loop 1. Attivazione trascrizionale (Fos) 2. Fosforilazione (Fos, Jun, CREB, STAT) 3. Defosforilazione (Jun, CREB) 4. Scambio di Partner (Myc, Jun) 5. Rilascio da inibitori (NFkB, SMADs) 6. Legame del ligando (‘recettori’ nucleari) i fattori di trascrizione AP-1 (activator protein 1) sono substrati della trasduzione Famiglia FOS C-fos Fra 1 Fra 2 Fos B Famiglia JUN C-jun Jun B Jun D PI3K P PDK PKA P PKC MAPK (ERK/JNK) fos-jun leucine-zipper domains P P jun-jun AP-1 p90rsk PLCβ/γ GF PLCβ/γ SIERO VOCs Ca2+ STAT Smad MAPK PKC TCF/Elk1 SIE -350 SRF SRE cAMP CaMK IV Fos/jun AP1-RE -300 AC PKA CREB Ca/CRE C-fos TATA -60 Geni della risposta tardiva Time course dell’espressione dei geni della risposta precoce e di quelli tardivi in cellule in G0 dopo l’aggiunta di mitogeni SRE, serum response element SRF, proteina fattore responsivo al siero TCF, fattore del complesso ternario AP1-RE, sito di legame della proteina attivatrice Ca/CRE, l’elemento responsivo al calcio e al cAMP Geni della risposta precoce Attivazione Transcrizionale e post-translazionale di AP-1. Attivazione di AP-1 è stimolata da un complesso network di vie segnalamento che partono da segnali esterni e MAPKs: ERK, p38, JNK. Le MAPKs attivano vari fattori di trascrizione: TCF, (Fattore del complesso terziario), MEF2C, enhancer fattore 2C dei miociti (ATF2) fattore 2 attivante la trascrizione e JUN. FOS e JUN AP1 La Fosforilazione Post-translatzionae regola l’attività di AP-1, che include la sua transattivazione, la capacità di legame al DNA e la stabilità dei componenti di AP-1. CKII, casein kinase II; GSK-3, glycogeno sinthase kinase-3; RSK2, ribosomal S6 kinase 2; SRE, serum-response element. The four MEF2 transcription factors (MEF2A to MEF2D) regulate calcium-dependent gene expression in muscle cells have a role in the differentiation of cardiac and skeletal muscle. The expression of muscle-specific genes is accomplished through MEF2-responsive elements (MEF2 sites). Post-translational modifications of jun JUN è phosphorylated on Ser63 and Ser73 da JNK, increasing its stability and transactivation potential. Phosphorylations of Thr91 and Thr93 are required for DNA binding and activation of its transcriptional activity. JUN ubiquitylation required phosphorylation at Thr239 by glycogen synthase kinase 3 (GSK3), after phosphorylation on Ser243. The effect of GSK3 can be antagonized by the dephosphorylation of stability Ser243 by calcineurin. ubiquitina ligase the leucine zipper domain ERK and PI3K–Akt signalling cascades results in JUN stabilization. JUN can be sumoylated on Lys257 and Lys229, which leads to a reduced transcriptional activity. ERK induces the acetylation of the lysine residues in the JUN DNA binding region, thereby increasing JUN transcriptional activity. Oncogenic activation - what alterations? b ZIP b ZIP TAD v-Jun a common principle that underlies oncogenic mutations - to escape regulation by kinases or other modifying enzymes, leading to constitutive activity. The protein encoded by the avian sarcoma virus 17 oncogene v-Jun shows increased transforming activity compared with c-Jun, its normal cellular counterpart. v-Jun differs from c-Jun in three important ways that might explain its transforming potential: (1) deletion of the delta domain - Jnk docking?, (2) single amino-acid substitutions that change a phosphorylation sites and (3) site that is recognized by the redox factor Ref1 Oncogenic activation Contrariamente a c-Jun, sia JunB che JunD mancano di attività trasformante. Anzi, le proteine JunB e JunD hanno effetti anti-oncogénici; infatti le cellule della linea mieloide caratterizzati dalla mancanza di junB, a conseguenza del silenziamento epigenetico, hanno un'apoptosi ridotta, che correla con l'aumento d'espressione di due geni anti-apoptotici, BCL-2 e BCL-XL. 1- L’attività di AP-1 è stimolata dal trattamento con il promotore tumorale TPA e da fattori di crescita. c-FOS può cambiare il pattern di metilazione del DNA regolando il gene DNA 5-methylcytosine transferase, portando alla downregolazione di geni oncosoppressori. c-JUN–c-FOS contribuisce al tumore primario cooperando con i prodotti di altri oncogeni, come RAS. 2- JUNB and JUND essendo downregulati non consentono la formazione di dimeri oncogenici. I complessi c-JUN/AP-1 impediscono l’apoptosi mediata da p53. 3- I complessi c-FOS/AP-1 inducono espressione di geni: angiogenesis e invasività. Nei tessuti adiacenti AP-1 stimola la secrezione di fattori paracrini, cge influenzano la crescita del tumore i fattori di trascrizione responsivi al cAMP: CREB/CREB CREB/CREM CREB/fos CRE Several genes + Alternative splicing generates several variants Distinct gene products, such as: CREB CREBP1 CREM ATF1-4 Alternative splicing in CREM generates isoforms acting both as activators and repressors Signalling through cAMP and PKA to CREB AC α β γ cAMP PKA Cytoplasm Dissociation C C C The cyclic AMP response element-binding protein (CREB) regulate a wide range of biological functions, such as growth factordependent cell proliferation and survival, glucose homeostasis, spermatogenesis, circadian rhythms and memory. Nuclear translocation C Phosphorylation P CBP P CREB Nucleus P Target gene activation The crucial event in the activation of CREB is the phosphorylation of Ser133 in kinase-inducible domain (KID) and Ser133 promotes CREB to recruit transcriptional co-activators that induce transcription of a variety of intermediate early response genes. protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC), casein kinases, calmodulin kinases (CaMKs), glycogen synthase kinase-3, p34cdc2, p70s6k] can either increase or decrease the activity of CREB. Dephosphorylation of Ser133 is important for the inactivation of CREB. Both protein phosphatase 1 (PP-1) and PP-2A may be involved in the dephosphorylation of CREB i diversi segnalamenti intracellulari che mettono capo a CREB MAPK-activated protein kinase 2 Ser/Thr protein kinase regulated through direct phosphorylation by p38 MAP kinase cyclins, Bcl-2 family members, Egr-1 (Early growth response protein 1) In mammals, four RSK genes (RSK1-RSK4) and two MSK genes (MSK1 and MSK2) have been identified. RSK and MSK are ubiquitously expressed and many cell types express several members of each family. CREB is overexpressed and constitutively phosphorylated in a number of forms of human cancer, including acute myeloid leukemia (AML) and non–small cell lung cancer, and appears to play a direct role in disease pathogenesis and prognosis. Turning off the response- the ICER strategy AC α β γ cAMP PKA C C Dissociation Cytoplasm C Nuclear translocation C ICER Phosphorylation P Competition Inactive heterodimers CBP Repressor TURN OFF P P CREB Nucleus Target gene activation The inducible cyclic AMP early repressor (ICER) is a group of proteins produced from the CREM/ICER, which contains only a DNA binding domain, functions as a repressor of transcription of several CRE A pro-apoptotic role of ICER in neurons could be of special importance, especially because CREB appears to have antiapoptotic activity in cultured neurons deprived of trophic support ETS (Ets1, Ets2, PntP2); YAN; ELG; PEA3 (Erm, ER81); ERF; TCF (Elk1, Sap1a, Sap1b, Sap2) Proteine TCF (Elk e Sap-) si legano ad un dimero SRF:SRF (serum-response-factor) e controllano RRE (Ras-Responsive-Elements) TCF = Ternary Complex Factor 85 In molte cellule la transizione proliferazione differenziazione vede la down-regolazione di Myc MXD1 MXD2 MaX-Interactor 1 MXD3 MXD4 eccessivi livelli di Myc portano alla formazione di tumori Le proteine MXD1-4 (dette in passato MAD) sono repressori trascrizionali correlati a Myc, e antagonizzano l’attività oncogenica di Myc reclutano il corepressore Sin3 e il complesso contenente HDAC Le proteine Leucine zipper Max, Mnt, Miz1 e Mlx interagiscono con MXD e Myc MXD1 Myc-Associated factor X MaX-Dimerization protein 1 c-Myc è un gene della risposta precoce regolato da fattori della comunicazione Transactivation Myc MB1 MB2 Myc mRNA Max Max DNA Binding BR HLH LZ BR HLH LZ Max, Mnt, Miz1 e Mlx interagiscono con MXD e Myc La dimerizzazione regola MYC 1 ora MYC richiede Max per legare il DNA GF Mentre Myc è GF-inducibile, Max è costitutivo myc indotto dai fattori di crescita viene neutralizzato da Miz1 Myc repressione Max Max i fattori di crescita inducono l’espressione di myc portando all’attivazione di geni bersaglio repressione Max MXD1 Sin 3 repressione Max Miz1 repressione Myc Max attivazione Max MXD2 Sin 3 Le funzioni attivanti e inibenti di Myc promuovono la proliferazione, l’apoptosi e la tumorigenesi e sopprimono la differenziazione MYC-MAX si lega alla sequenza E-box e recluta HATs tipo GcN5, TiP60 e transformation/ transcription domain-associated protein (TRRAP), con successiva acetilazione vicino il transcriptional start site (Tss). Però, MAX può dimerizzare con membri della famiglia Mxd tipo MAX dimerization protein 1 (MXD1), MAX interactor 1 (MXi1), MXD3, MXD4 e MAX binding protein (MNT). Questi dimeri competono con MYC-MAX e reclutano HDACs con successiva repressione MYC–MAX possono essere reclutati dal fattore di trascrizione MiZ1 e si portano sul initiator element (inr) di vari geni reclutando la DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3α (DNMT3A) reprimendo la trascizione di geni dipendenti da MiZ1 Indipendentemente da MAX, MYC forma complessi con il transcription factor IIIB (TFIIIB) stimolando la trascrizione di geni dipendenti dalla RNA polymerase III (transfer RNA (tRNA)) e 5S ribosomal RNA (5s rRNA) reclutando TRRAP e GcN5 A, acetylation; M, methylation. p27 p27 Uno dei geni target di myc-max target è cdc25. Cdc25 è una fosfatasi che rimuove un fosfato dal complesso ciclina-cdk che promuove la transizione G2-M. il “network” regolatorio di MYC Myc è indotto da MAPK tramite fosforilazione di Ets MAPK Myc Ets E2F Myc ha una emivita di 30 min; la sua stabilità è controllata dalla fosforilazione su Ser-62 e Thr-58. La fosforilazione su Ser-62 stabilizza Myc, mentre quella su Thr-58, successiva alla fosforilazione Ser-62, promuove la degradazione GF PI3K ERK _ PKB/Akt Myc GSK-3 Ser 62 P Myc P STABILE Myc P Myc INSTABILE UBIQUITIN cis trans Myc PIN-1 P P FWB7 T58-MYC è target della ubiquitina ligasi FWB7 Thr 58 P PP2A trans-MYC è substrato di PP2A P Myc la fosforilazione operata da GSK-3 promuove il legame di prolyl isomerasi (PIN-1) che cambia la configurazione di MYC da prolina cis a prolina trans Myc ha una emivita di 30 min; il suo turnover è controllato da ERK, PKB/AktGSK-3 e da PP2A PP2A consists of a dimeric core enzyme composed of the structural A and catalytic C subunits, and a regulatory B subunit. Protein CIP2A also known as cancerous inhibitor of PP2A PKB/Akt _ GSK-3β instabile stabile ERK La fosforilazione su Ser-62 da parte di ERK stabilizza Myc, mentre quella su Thr-58, successiva alla fosforilazione Ser-62, e operata da GSK-3, promuove il legame di prolyl isomerasi (PIN-1) che cambia la configurazione di MYC da prolina cis a prolina trans ; trans-MYC è substrato di PP2A; T58-MYC è target della ubiquitina ligasi (degradazione) Nelle cellule normali l’espressione di CIP2A è bassa e la defosforilazione operata da PP2A è consentita. In alcuni tumori i livelli di CIP2A sono elevati portando al mascheramento di MYC e alla sua stabilizzazione CIP2A inhibits PP2A tumor suppressor activity in human malignancies as prevent c-Myc proteolytic degradation. In accordance with the oncogenic role of CIP2A, overexpression promotes Ras-elicited cell growth and transforms immortalized human cells Myc richiede Max per legare il DNA Myc–Max legati a Miz1 reprimono la trascrizione Myc–Max attivano la trascrizione Le funzioni attivanti e inibenti di Myc promuovono la proliferazione, l’apoptosi e la tumorigenesi e sopprimono la differenziazione Mad–Max sono repressori trascrizionali; quando sovraespressi hanno attività anti-proliferativa e anti-apoptotica, influenzano negativamente la differenziazione e hanno capacità oncosoppressoria Oltre a Max, Mad dimerizza con Mlx. Come i dimeri Mad–Max, Mad–Mlx reprimono la trascrizione c-myc L’attivazione di myc avviene attraverso molti meccanismi: amplificazione genica – double-minutes e espansione di regioni di cromosomi – translocazioni che pone myc sotto il controllo di altri promotori. Amplificazioni of c-myc -Breast carcinoma -neuroblastoma (gene N-myc) - cancro polmone a piccole cell. (gene L-myc) TRASLOCAZIONI del gene c-myc si verificano nel linfoma di Burkitt, un tumore delle cellule B. La traslocazione dal cromosoma 8q24 al cromosoma 14q32 porta cmyc vicino al gene che codifica per la catena pesante delle immunoglobuline. In questi casi la traslocazione porta ad una continua stimolazione del gene c-myc da parte degli enhancers posti vicino ai geni per le immunoglobuline. Nel 10-15% delle leucemie linfoblastiche acute delle cellule T (T-ALL), la trascrizione di c-myc è sotto il controllo degli elementi regolatori all'interno del locus della catena alfa del recettore delle cellule T. Vβ Vα γ ε ζ ζ ε δ Cβ Cα fyn Zap 70 lck