STATO DELL’ARTE DELLE BIOTECNOLOGIE IN MEDICINA DI LABORATORIO
Date: EDIZIONE 0 (5 Ottobre 2009)
EDIZIONE 1 (15 Ottobre 2009)
ORE 14,00
Registrazione dei partecipanti
ORE 14,30
La proteomica , una nuova scienza al servizio della clinica (Prof. G. Federici)
ORE 15,30
Sequenziamento in ambito virologico (Prof. CF. Perno)
ORE 16,30
Microarray: stato dell’arte (Prof. S. Bernardini)
ORE 17.30
Coffè break
ORE 18,00
Applicazione delle biotecnologie nella diagnostica anatomopatologica (Prof. L.G. Spagnoli)
ORE 19,00
Tecnologie molecolari in epoca prenatale (Prof G. Novelli)
ORE 20,00
Quiz e Conclusione dei lavori
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Prof. G. Novelli
Tecnologie molecolari in epoca prenatale
Negli ultimi anni nel campo della genetica e della biologia molecolare si è assistito ad
un’impressionante accelerazione dell’evoluzione tecnologica. Basti pensare che oggi è possibile
ottenere in un mese, ed in un singolo laboratorio, l’intera sequenza del genoma umano: meno di
dieci anni fa questo ha rappresentato un lavoro di dimensioni colossali per l’impegno finanziario e
lo sforzo organizzativo. Se da un lato i sequenziatori di ultima generazione ci hanno permesso di
conoscere la sequenza del DNA umano, dall’altro i chip genomici più recenti hanno mostrato che il
nostro genoma è ricco di duplicazioni, triplicazioni, delezioni il cui significato funzionale deve
ancora essere spiegato. La tecnologia ha permesso di ottenere una mole enorme di dati che adesso
sono pronti per essere analizzati ed interpretati. Chiaramente tutte queste evoluzioni hanno delle
chiare applicazioni in ambito sanitario e diagnostico anche in epoca prenatale. Quest’ultimo aspetto
merita un’analisi approfondita poiché non sempre, nell’ambito della diagnostica prenatale, ad una
maggiore sensibilità tecnica corrisponde una maggiore accuratezza diagnostica. Infatti i limiti delle
recenti acquisizioni in ambito tecnologico risiedono nelle difficoltà interpretative dei risultati
analitici, particolarmente evidenti in assenza del conforto del genotipo, come appunto in epoca
prenatale. I progressi tecnologici nel campo della genetica non possono avere un’applicazione
clinica immediata se prima non abbiamo dati affidabili di riproducibilità tecnica, ed inerenti i tassi
di errori analitici. I primi risultati sperimentali dimostrano che molte delle variazioni qualititative e
quantitative del nostro genoma non hanno un significato funzionale evidente e pongono enormi
problemi interpretativi. I principali aspetti tecnici, scientifici ed etici verranno discussi alla luce
dello stato dell’arte e dei suoi possibili sviluppi futuri.
Prof. CF. Perno
Abstract: Il Sequenziamento in ambito virologico
Il sequenziamento è il processo che permette di determinare la corretta sequenza nucleotidica di un
frammento di DNA, codificante per una determinata proteina d’interesse. Ogni modificazione
stabile nella sequenza nucleotidica di un genoma è definita mutazione genetica. Le mutazioni
determinano la variabilità genetica. Il metodo di sequenziamento attualmente maggiormente
utilizzato è basato sul metodo di Sanger (o a terminazione di catena). Questo tipo di
sequenziamento necessita di una DNA polimerasi termostabile, uno stampo a singola elica
(templato), un innesco specifico (primer), deossinucleotidi, e una miscela di dideossinucleotidi
(ddNTPs), marcati fluorescentemente che bloccano l’allungamento. Il sequenziamento del DNA
viene sempre più impiegato nella diagnostica medica, soprattutto in campo virologico in quanto
consente di rilevare la presenza di mutazioni associate alla resistenza farmacologica, di analizzare
regioni specie-specifiche, che consentono la caratterizzazione dei diversi ceppi virali. Dunque il
sequenziamento risulta fondamentale ai fini di una corretta diagnosi terapeutica e di un’adeguata
scelta terapeutica.
Prof. Luigi Giusto Spagnoli
Applicazione delle biotecnologie nella diagnostica anatomopatologica
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L’Anatomia Patologica costituisce la base scientific della medicina moderna. Questa disciplina
nacque nel 18° secolo grazie all’opera di un grande scienziato italiano: Giovan Battista Morgagni il
quale , per primo intuì che gli organi sono la sede delle malattie umane. Nella sua opera magistrale
il “ De sedibus et causis morbo rum per anatomen indagatis” Morgagni, attraverso lo studio delle
autopsie che egli effettuava sui suoi stessi pazienti, dimostrò l’esistenza di una stretta correlazione
tra i sintomi delle malattie e le alterazioni strutturali degli organi.
E’ sorprendente come Morgagni, usando gli unici due strumenti allora disponibili, la vista ed il
bisturi, produsse un rivoluzionario avanzamento della scienza medica sostituendo la teoria dei
“quattro umori” di Ippocrate con il principio basato sul legame tra causa ed effetto.
Tale metodo d'indagine, detto metodo anatomo-clinico, è tuttora il cardine dell'anatomia patologica.
Nel secolo scorso lo sviluppo del microscopio e della tecnica istologica fornì all'anatomo-patologo
un nuovo, prezioso strumento di lavoro.
Non solo egli poteva esaminare gli organi malati ad occhio nudo come nei secoli precedenti, ma
anche scegliere dei campioni di tessuto, prepararne sezioni tanto sottili da permettere il passaggio
della luce, colorare queste sezioni, ed osservarne la minuta struttura. La tecnica microscopica
aumentò le possibilità diagnostiche dell'anatomo-patologo e gli permise di riconoscere e
differenziare malattie non identificabili macroscopicamente. Il tedesco Rudolf Virchow sviluppò
l'istologia patologica e applicò le sue scoperte alla pratica clinica. L'anatomia patologica in questo
modo non serviva più solo per verificare nel cadavere la storia naturale della malattia, ma poteva
anche fornire la diagnosi durante la vita del paziente, stabilire la prognosi ed indicare la terapia.
Oggi l'esame istologico è diventato una delle indagini di laboratorio più importanti. Esso viene
eseguito sia sui pezzi asportati durante le operazioni chirurgiche, sia su frammenti di tessuto
selettivamente prelevati (biopsie). L'anatomo-patologo è spesso in grado di riconoscere la malattia
del paziente sulla scorta di tale materiale. Oltre all'esame macroscopico e all'esame istologico, vi
sono altre metodiche utili per la diagnosi, quali l'esame citologico, l'esame istologico urgente per
congelazione, l'esame ultrastrutturale, le tecniche di biologia molecolare, di immunopatologia e di
analisi d'immagine.
Anatomia microscopica e sviluppi successivi
L'invenzione, nel XVII secolo, del microscopio composto portò allo sviluppo dell'anatomia
microscopica, che viene suddivisa in istologia (studio dei tessuti) e citologia (studio delle cellule).
Sempre nel XVII secolo l'anatomico italiano Marcello Malpighi compì le prime osservazioni della
struttura microscopica di piante e animali. I più importanti anatomici dell'epoca di Malpighi
erano, tuttavia, riluttanti ad accettare l'anatomia microscopica, che oggi costituisce, invece, la base
dell'anatomia moderna. Oggi le indagini microscopiche si pongono anche l'obiettivo di
identificare il rapporto esistente tra la struttura osservata a occhio nudo e quella fornita dal
microscopio. Nel corso del XX secolo l'anatomia microscopica conobbe un ulteriore, importante
sviluppo grazie all'introduzione di microscopi, dotati di una risoluzione e di un ingrandimento
molto superiori agli strumenti convenzionali e, pertanto, in grado di rivelare dettagli prima poco
chiari o invisibili. Rispetto al microscopio ottico convenzionale, il microscopio a luce ultravioletta
permette, ad esempio, di ottenere un contrasto maggiore, in quanto le lunghezze d'onda di questi
raggi sono minori di quelle della luce visibile (il potere di risoluzione di un microscopio è
inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda della luce impiegata). Questo tipo di
microscopio viene anche utilizzato per sottolineare particolari dettagli, grazie all'assorbimento
selettivo, da parte dei tessuti, di determinate lunghezze d'onda presenti nell'ultravioletto.
L'invenzione del microscopio elettronico, che rispetto al microscopio ottico raggiunge un potere
di risoluzione e livelli d'ingrandimento enormemente superiori, ha consentito di esplorare strutture
subcellulari prima intoccabili dall'indagine anatomica. Altri microscopi moderni, come il
microscopio a contrasto di fase e il microscopio interferenziale, hanno permesso di osservare
materiali viventi privi di colorazione artificiale, i quali sarebbero risultati invisibili al microscopio
convenzionale.
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L’odierna disponibilità di numerosi strumenti mutuati dalle biotecnologie, quali la Microscopia
Elettronica,l’Immunoistochimica, la citometria a flusso, la FISH, l’ibridizatione “in situ”, la micro
dissezione laser, il Southern/Nortern blot, la Micro-array analysis, la PCR/RT PCR ed il Western
blot , che applicati secondo il metodo morgagnano, anno ampliato notevolmente il raggio d’azione
dell’ anatomo patologo.
Ancora oggi l’Anatomia patologica contribuisce in modo rilevante :
-all’ avanzamento della scienza medica
-alla educazione medica: Sir Samuel Wilks al Guys Hospital di Londra
affermò che “ la principale risorsa per gli studenti di medicina era lo studio delle autopsie”.
-al “Controllo di Qualità”.
Prof. G. Federici
La proteomica , una nuova scienza al servizio della clinica
Il termine Proteomica, riferito alle proteine prodotte da un genoma, è stato coniato per la prima
volta nel 1995, e la scienza del proteoma è divenuta in una decade una entità complessa e dinamica.
A differenza della staticità delle informazioni ottenibili dall’analisi genomica, comunque necessarie
e da approfondire ulteriormente, il proteoma è controllato da uno sbalorditivo numero di fattori:
complessità in termini di sintesi delle proteine, processi di degradazione o di modificazione che
possono agire sulla localizzazione della proteina, interazioni proteina-proteina, legame a molecole
di basso peso molecolare o a farmaci, ecc.
In questo sviluppo della “system biology” è stato dato originariamente un notevole impulso
all’analisi dell’espressione dell’RNA messaggero ( mRNA ) usando tecnologie di microarray per
studiare i cambiamenti dell’espressione genica. Sebbene la sensibilità e la grande copertura di geni
ottenibile con alcune tecniche di biochips (Affimetrix) è chiaramente un vantaggio, è però risultato
evidente, da vari studi, che il cambiamento di espressione di mRNA è solo una delle vie attraverso
le quali il proteoma può essere alterato. E’ stato dimostrato che sia i livelli assoluti di trascriptoma
che quelli di proteoma in caso di perturbazione del sistema con una stimolo non sono
necessariamente congruenti. Infatti il proteoma, a differenza della stabilità del genoma di una
cellula, possiede una intrinseca complessità e si trova in un costante stato di flusso dipendente
dall’omeostasi cellulare.
Sulla base di quanto sopra sommariamente espresso risulta evidente che l’applicazione delle
tecnologie proteomiche è vitale per lo studio dei sistemi complessi, identificando le interazioni
proteina-proteina o le modificazioni post-traduzionali che avvengono dopo l’espressione di alcune
proteine. Un ulteriore importante aspetto di questa area chiave per “system Bioloy” è legato alla
identificazione di biomarcatori. In questo contesto campioni biologici sono screnati per evidenziare
il contenuto proteico che correli con la malattia o con la prognosi.
L’enorme sviluppo della proteomica fin qui raggiunto è stato possibile grazie alla
concomitante crescita in sensibilità e range dinamico delle tecniche di spettrometria di massa.
Esistono oggi varie tipologie di spettrometri di massa utilizzabili nello studio del sistema complesso
proteoma ( ESI-MS-MS, MALDI-TOF, sistemi Ibridi MS-TOF, FTICR-MS) che, accoppiate con
metodi di separazione on-line, consentono di identificare e quantificare le singole proteine da
miscele complesse quali siero, plasma, estratti cellulari. Saranno analizzate applicazioni di massa
imaging per individuare il proteoma presente su preparati istologici sia freschi che fissati in
formalina. E’ appena il caso di ricordare come negli archivi delle Anatomie Patologiche esistano
milioni di preparati con diagnosi accertate.
Un ulteriore aspetto reso possibile dallo sviluppo delle tecnologie di spettrometria di massa e
da quelle di NMR ad alta risoluzione è stato lo sviluppo della nuova scienza di Metabonomica che
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può favorire lo screening rapido di vari fattori sia per lo studio di efficacia di farmaci che per
l’analisi di effetti tossici. La combinazione delle due metodiche, complementare a quelle sopra
descritte, può fornire un profilo chimico o biochimico per uno specifico liquido corporeo.
Pof. S. Bernardini
Microarray: stato dell’arte
La tecnica del microarray si è sviluppata negli ultimi anni come un metodo efficace per l'analisi
simultanea di migliaia di geni e delle loro interazioni reciproche nell’ambito degli studi di
genomica funzionale. I principi di questa tecnica originano dai metodi di ibridazione comunemente
utilizzati in biologia molecolare, dall'utilizzo di molecole fluorescenti, derivanti dalle applicazioni
della microscopia a fluorescenza e dai miglioramenti tecnologici per la preparazione di collezioni
di acidi nucleici su un supporto solido.
Un microarray consiste di una collezione di sequenze di acidi nucleici immobilizzate su un supporto
solido (spots). Gli acidi nucleici possono essere essenzialmente cDNA o oligonucleotidi ed esistono
numerosi metodi per la loro deposizione sul supporto. In generale, in base alla dimensione degli
spots si possono distinguere due diversi tipi di arrays: macroarrays e microarrays. I macroarray sono
caratterizzati da spots delle dimensioni superiori ai 300 micron in genere depositati su membrane da
filtro. I microarray invece sono caratterizzati da spots con un diametro inferiore ai 200 micron,
depositati su un supporto di vetro; i microarrays sono perciò caratterizzati dal contenere decine di
migliaia di spots in un'area totale di pochi centimetri quadrati. Esistono arrays per lo studio
dell’espressione genica ed arrays per studi di genotipizzazione.
Un tipico esperimento di microarray per lo studio differenziale dell’espressione genica può essere
sintetizzato nei seguenti passaggi :
-costruzione di un supporto solido, in genere un vetrino da microscopio, su cui vengono depositate
le sonde (a cDNA o oligonucleotidi).
-creazione del "target" da analizzare, cioè di un pool di cDNA marcato con fluoroforo. Questo
passaggio prevede innanzitutto l'estrazione e la preparazione del mRNA dalle due situazioni
sperimentali che si vogliono comparare (ad esempio cellule di un tessuto patologico verso cellule di
un tessuto normale, oppure cellule derivate da un tessuto trattato con farmaci verso un controllo non
trattato e così via). Le due popolazioni di mRNA vengono retrotrascritte separatamente con
l'incorporazione di nucleotidi marcati con fluorofori diversi, producendo due popolazioni di cDNA
differentemente marcate;
-ibridazione del vetrino. Le due popolazioni di cDNA marcati vengono combinati e poi ibridati
simultaneamente sul vetrino dove formano dei duplex con le sonde complementari. La correttezza
dell’ibridazione è influenzata da alcuni parametri quali la stringenza di ibridazione (ad esempio la
temperatura), la concentrazione del campione, la lunghezza dei targets, gli effetti sterici delle
molecole fluorescenti, la chimica di superficie ed i tempi di ibridazione stessa;
-l'analisi del segnale fluorescente di ibridazione può essere effettuata con l'uso di lettori che
generalmente si basano su laser con fluorescenza confocale o sistemi digitali (scanner). I dati di un
singolo esperimento di ibridazione vengono indicati come rapporto normalizzato tra l'intensità delle
due fluorescenze (es: Cy3/Cy5): significative deviazioni dall’unità indicano un aumento (>1) o una
riduzione (<1) dei livelli di espressione del gene in esame rispetto al sistema di riferimento. Quindi
se un particolare mRNA predomina in uno dei due campioni, il colore del fluoroforo corrispondente
prevarrà sull'altro, indicando che quel dato gene è più espresso in un sistema piuttosto che nell'altro
con cui viene comparato. Attraverso complessi sistemi bioinformatici sarà poi possibile analizzare
l'enorme quantità di dati ottenuti cercando anche di creare un modello interpretativo.
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L'analisi genomica mediante microarray è una tecnologia molto promettente e utile nella genetica e
medicina molecolare, che permette l'analisi di mutazioni e di polimorfismi più rapida rispetto alle
tecniche tradizionali tra cui SSCP, DGGE e sequenziamento diretto. Grazie alla tecnologia del
microarray, si possono infatti comparare sequenze di DNA genomico con sequenze di riferimento e
identificare così polimorfismi nell'intero genoma attraverso un singolo esperimento di ibridazione.
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