Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
DI
DETERMINAZIONE
NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI BIVALVI
MEDIANTE REAL TIME PCR
INTRODUZIONE
L’epatite A (HAV) e i Norovirus (NoV) sono importanti agenti di infezioni umane virali a
trasmissione alimentare. Non esistono attualmente metodi di routine per la coltura di questi virus
dagli alimenti. La ricerca è pertanto basata sui metodi molecolari utilizzando la reazione a catena
della polimerasi (PCR), previa procedura di estrazione in grado di allontanare le sostanze inibenti
la RT-PCR, eventualmente presenti nella matrice, producendo RNA altamente purificato. La
determinazione può quindi essere effettuata tramite RT-PCR real-time, che verifica
l’amplificazione nel corso dei cicli di PCR misurando l’eccitazione di molecole marcate con
fluorofori. Nel saggio di real-time RT-PCR di tipo TaqMan, i fluorofori sono attaccati ad una
sonda nucleotidica sequenza-specifica, che consente, simultaneamente, la conferma del templato
target. Queste modifiche incrementano la sensibilità e la specificità del metodo di PCR ed
eliminano la necessità di passaggi successivi alla PCR per la conferma del prodotto di
amplificazione.
Il metodo descritto in questa procedura consente la determinazione qualitativa dell’RNA di
Norovirus e/o del virus dell’epatite A nel campione.
DESCRIZIONE
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Questa procedura descrive tutte le fasi (rilascio, concentrazione, estrazione e rilevazione) di un
metodo per la determinazione qualitativa dell’RNA di HAV e NoV di genogruppo I (GI) e II (GII)
nella matrice mollusco.
Questa procedura applica una “one-step TaqMan real-time RT-PCR”.
2. NORMATIVE DI RIFERIMENTO
ISO 22174 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions.
ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological
examinations.
pag. 1 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
3. TERMINI E DEFINIZIONI
3.1. Virus dell’epatite A (HAV)
Il virus dell’epatite A (HAV) è un membro della famiglia dei Picornaviridae responsabile per
l’epatite infettiva. Geneticamente l’HAV può essere suddiviso in sei genotipi sulla basa della
regione VP1/2A (i genotipi 1, 2 e 3 sono stati trovati nell’uomo, mentre i genotipi 4, 5 e 6 sono
relativi ai primati). Esiste un solo sierotipo. La trasmissione avviene per via oro-fecale con il
contatto person-to-person, attraverso il consumo di alimenti contaminati o con il contatto con acqua
o superfici destinate agli alimenti contaminate.
3.2. Norovirus (NoV)
I Norovirus (NoV) sono membri della famiglia dei Caliciviridae responsabili di epidemie
sporadiche di gastroenterite acuta. Geneticamente i NoV possono essere suddivisi in cinque
genogruppi distinti. Tre di essi GI, GII e GIV sono stati implicati in casi di gastroenterite
nell’uomo. GI e GII sono responsabili per la vasta maggioranza dei casi clinici. La trasmissione ha
luogo per via oro-fecale tramite contatto “person-to-person”, attraverso il consumo di alimenti
contaminati o tramite contatto con acqua o superfici destinate agli alimenti contaminate.
3.3. Ricerca di virus dell’Epatite A / Norovirus
Determinazione qualitativa di RNA di HAV o NoV in una massa/volume predeterminato di
alimento, effettuata in accordo con la presente procedura.
3.4. Controllo di Processo (CP)
Un virus aggiunto alla porzione di campione prima dell’estrazione, allo scopo di verificare
l’efficienza dell’estrazione (quando si aggiunge al campione da analizzare il virus per il controllo
di processo deve essere diverso dal virus target).
Il virus selezionato come CP dovrebbe essere un virus coltivabile privo di “envelop” con RNA a
singolo filamento positivo di dimensioni simili a quelle del virus target per provvedere un buon
modello genetico, morfologico e fisico-chimico. Il CP dovrebbe esibire una persistenza
nell’ambiente simile a quella dei virus target. Esempi di virus utilizzabili come controlli di
processo nella presente procedura includono, oltre all’HAV(11), il cui uso è possibile laddove
l’HAV stesso non costituisca il target dell’analisi, il virus Mengo(1) e il Calicivirus Felino(11).
3.5. RNA del controllo di processo
RNA estratto dal virus usato come controllo di processo. Viene utilizzato per la stima
dell’efficienza della procedura di estrazione.
pag. 2 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
3.6. Controllo negativo di RT-PCR
Campione di acqua per il controllo dei reagenti di RT-PCR.
3.7. Controllo esterno ad RNA (EC)
RNA di riferimento con funzione di target per il saggio di real-time RT-PCR, e.g. appropriate
diluizioni di un trascritto in vitro da plasmide contenente la sequenza del gene target o di un RNA
estratto da virus coltivato (HAV e FCV) o da campione fecale contenente virus dello stesso
genogruppo (NoV).
Il confronto dei risultati ottenuti sul controllo esterno in presenza e in assenza del campione
consente la determinazione dei livelli di inibizione della RT-PCR in ogni campione sotto test
3.8. Limite teorico di rilevazione (tLOD)
Livello che costituisce la più piccola quantità del target teoricamente rilevabile con il saggio. Esso
corrisponde ad una copia del genoma per volume di RNA testato nel saggio ma può variare in
relazione alla matrice e alla quantità di materiale di partenza.
4. PRINCIPIO
I molluschi bivalvi costituiscono una matrice complessa, in cui i virus target possono essere
presenti a basse concentrazioni. E’ pertanto necessario effettuare procedure di estrazioni e/o di
concentrazione al fine di provvedere un substrato idoneo per le successive fasi analitiche. Per
ottenere un RNA pulito e ridurre l’effetto degli inibitori della PCR l’agente caotropico guanidina
tiocianato è utilizzato per rompere il capside virale e l’RNA è assorbito su silice per subire
purificazione attraverso diversi stadi di lavaggio. L’RNA purificato è rilasciato dalla silice in un
buffer prima della real-time RT-PCR.
Questa procedura applica una “one-step TaqMan real-time RT-PCR”, in cui la retrotrascrizione e
l’amplificazione in PCR sono effettuate consecutivamente nella stessa provetta di reazione.
La TaqMan real-time RT-PCR utilizza una breve sonda a DNA con una marcatura fluorescente
(reporter) e con un assorbitore di fluorescenza (quencher) legati agli estremi opposti della sonda.
La chimica del saggio assicura che man mano che la quantità di prodotto amplificato aumenta, la
sonda venga idrolizzata e il segnale fluorescente del marcatore aumenti proporzionalmente. La
fluorescenza può essere misurata ad ogni stadio dell’amplificazione. Il primo punto della PCR in
cui l’amplificazione può essere rilevata è proporzionale alla quantità di templato iniziale, pertanto
l’analisi delle curve di fluorescenza consente anche la determinazione della quantità di sequenza
target nel campione.
A causa dei bassi livelli di templato virale spesso presenti negli alimenti e della diversità genetica
dei ceppi dei virus target, la selezione di reagenti adatti allo scopo di una one-step real-time RTPCR e TaqMan PCR primers and probes per i virus target è importante.
pag. 3 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
5.
REAGENTI
5.1. Generale
Per le pratiche comuni di laboratorio, vedere ISO 7218.
5.2 Proteinasi K (30U/mg)
Per le modalità di preparazione vedi Appendice B (punto B.1)
5.3 Phosphate buffered saline (PBS)
Per le modalità di preparazione vedi Appendice B (punto B.2)
5.4 Silice, buffer di lisi, di lavaggio e di eluizione per l’estrazione dell’RNA virale
Tali reagenti devono consentire l’estrazione dell’RNA da 500 µl di estratto di campione, usando
una lisi con tampone caotropico contenete guanidina tiocianato [3] e usando silice come substrato
per il legame dell’RNA. Successivamente ai trattamenti dell’RNA legato alla silice con i buffer di
lavaggio per rimuovere le impurità, l’RNA deve essere eluito in 100 µl di buffer di eluizione.
La preparazione dell’RNA deve essere di una qualità e di una concentrazione adatta allo scopo
della determinazione.
5.5 Acqua per biologia molecolare
5.6 TaqMan primers e sonde per la ricerca di HAV e Norovirus GI e GII
I primer TaqMan e le sonde devono essere pubblicate in una rivista peer-reviewed e devono essere
verificate per l’uso rispetto a un vasto range di ceppi del virus target. I primers per la ricerca di
HAV dovrebbero ricercare la regione non codificante al 5’ del genoma. I primers per la ricerca dei
Norovirus di genogruppo I e II dovrebbero ricercare la regione di giunzione fra ORF1 e ORF2 del
menoma. (Appendice C)
5.7 TaqMan primers e sonde per la ricerca del virus controllo di processo
I primer TaqMan e le sonde devono essere pubblicate in una rivista peer-reviewed e devono essere
verificate per l’uso rispetto al ceppo di virus utilizzato come controllo di processo. Devono inoltre
dimostrare assenza di cross-reattività nei confronti dei virus target.
pag. 4 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
5.8 Reagenti e Mastermix TaqMan per il virus target e per il controllo di processo
I reagenti devono consentire l’analisi di 5µl di RNA in 25µl di volume totale di reazione. Essi
devono essere one-step TaqMan RT-PCR reagenti sufficientemente sensibili per la ricerca di livelli
di RNA virale coerenti con la tipica contaminazione degli alimenti.
I reagenti dovrebbero essere aggiunti nelle quantità specificate dai produttori per consentire la
preparazione di 20µl di mastermix per reazione in un totale di 25µl di volume. La concentrazione
ottimale di primer e probe dovrebbe essere determinata seguendo le raccomandazioni del
produttore dei reagenti. (Appendice D)
5.9 Controllo di processo
Il sovranatante della coltura cellulare del virus controllo di processo dovrebbe essere diluito di un
fattore 10 in buffer idoneo, e.g. PBS. Questa diluizione è finalizzata alla rilevazione senza
inibizioni del virus controllo di processo con tecnologia TaqMan, mantenendo tuttavia una
concentrazione sufficiente per rilevare in maniera riproducibile la più bassa diluizione usata per
l’RNA del virus controllo di processo nella curva standard (10.2.1). Suddividere il sovranatante
diluito della coltura cellulare (controllo di processo) in aliquote per singolo uso e conservare a 80±5°C.
5.10 RNA controllo esterno
Distinti RNA a singolo filamento purificati per ogni virus target dovrebbero essere utilizzati come
controllo esterno. Suddividere le preparazioni di RNA (EC) diluito in aliquote per singolo uso e
conservare congelate a temperatura ≤15°C.
6. APPARECCHIATURE
Apparecchiature standard per i laboratori microbiologici (ISO 7218) e in particolare quanto segue:
6.1
Micropipette e puntali con vari range di volumi, e.g. 1000µl, 200µl, 20µl
6.2
Pipettatore automatico e pipette con vari range di volumi, e.g 25ml, 10ml, 5ml
6.3
Vortex
6.4
Microcentrifuga
6.5
Blocco riscaldante in grado di operare a 99±1.0°C
6.6
Bilancia tecnica in grado di operare con risoluzione di ±0.1 g
6.7
Incubatore con agitazione in gradi di operare a 37±1.0°C e 320±20 rpm, o equivalente (i.e.
agitatore posto all’interno di incubatore)
6.8
Bagnomaria in grado di operare a 60±1.0°C
pag. 5 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
6.9
Centrifuga da banco e rotore in grado di operare a 4,000 x g con capacità di ospitare tubi da
15ml
6.10
Bisturi sterili
6.11
Guanti
6.12
Forbici
6.13
Pinze
6.14
Piastre Petri sterili
6.15
Tubi Falcon sterili
6.16
Eppendorf sterili
6.17
Apparecchio e materiali necessari per l’estrazione dell’RNA utilizzando silice e reagenti
associati
6.18
Strumento di PCR real-time in grado di supportare una chimica di reazione TaqMan.
6.19
Consumabili associati alla real-time RT-PCR, e.g. piastre ottiche e tappi/film, adatti per
l’uso nell’apparecchio di PCR adottato.
7. CAMPIONAMENTO E CAMPIONE
Il campionamento non è parte di questa procedura.
I molluschi bivalvi dovrebbero essere vivi o, se congelati, dovrebbero essere non danneggiati. Prima
di effettuare l’apertura dei molluschi, rimuovere fango eventualmente presente sulle valve.
8. PROCEDURA
8.1.
Requisiti generali del laboratorio
L’estrazione dei campioni e la PCR dovrebbero essere effettuate in aree di lavoro separate come
richiesto dalla ISO 22174.
8.2.
Estrazione del virus
Selezionare un minimo di 10 individui per le specie più grandi (30 per vongole e specie più piccole)
ed aprire le valve con un bisturi sterile o uno strumento equivalente. Proteggere la mano che tiene i
molluschi con un guanto da lavoro di sicurezza.
Dissezionare il tessuto digestivo (epatopancres) utilizzando pinzette e forbicine (o strumenti
equivalenti) e trasferire il tessuto in una piastra Petri pulita. Prelevare una quantità non inferiore a
2.0 ± 0.2 g
Sminuzzare finemente il tessuto utilizzando un bisturi pulito (o uno strumento equivalente)
pag. 6 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Trasferire una quantità pari a 2.0 ± 0.2 g di epatopancreas sminuzzato in una provetta da centrifuga
(quando si vuole verificare l’efficienza della procedura di estrazione aggiungere 10 ± 0.1 µl di
controllo di processo diluito, alla concentrazione scelta secondo quanto riportato al paragrafo 10)
Aggiungere 2.0±0.2 ml di soluzione di proteinasi K (0.1 mg/ml); mescolare bene.
Incubare la provetta a 37.0 ± 1.0 °C con agitazione (approx 320 rpm) per 60 ± 5 min.
Effettuare una seconda incubazione ponendo la provetta in bagnomaria a 60.0 ± 2.0 °C per 15 ± 1
min
Centrifugare a 3000 g per 5 min ± 30 sec e trasferire il sovranatante in una nuova provetta
Misurare e registrare il volume ottenuto e portare il campione al volume finale di 3.0 ± 0.3 ml
mediante aggiunta di PBS sterile (pH 7.3). Utilizzare la sospensione per l’estrazione dell’acido
nucleico.
I campioni così estratti possono essere conservati a –20°C (o, preferibilmente, –80°C) fino al
momento dell’uso.
8.3 Estrazione dell’RNA
Per l’estrazione degli acidi nucleici possono essere utilizzati differenti kit di estrazione commerciali
(es. “MiniMag - Nuclisens Magnetic Extraction kit” (bioMerieux); NucleoSpin® RNA II –
Macherey-Nagel ecc ) A prescindere dalle prescrizioni del kit riguardo alle quantità di campione da
analizzare è consigliabile utilizzare i volumi di campione e di eluizione sotto descritti:
1. Prelevare 500 ± 10 µl di campione (o tutto il campione se inferiore a 500 µl) e procedere
all’estrazione secondo le modalità definite dalla casa produttrice del kit di estrazione
2. Al termine della procedura fluire l’RNA estratto in 100 ± 1 µl di buffer di eluizione
3. Aggiungere 100 unità di inibitore delle RNAsi e mescolare pipettando
L’RNA estratto dovrebbe essere conservato a 5±3°C per <24 h o ≤15°C per periodi più lunghi.
8.4.
8.4.1.
Real-time RT-PCR
Requisiti generali
I requisiti minimi per l’amplificazione e la rilevazione di sequenze di acidi nucleici mediante realtime PCR sono definite nella ISO 22174.
pag. 7 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
8.4.2.
Allestimento della Real-time RT-PCR
Preparare la mix di retrotrascrizione e PCR (one-step) utilizzando i materiali presenti nel kit RNA
Ultrasense one-step qRT-PCR (Invitrogen – 11732927)
Preparare una mix per la determinazione di ciascun target (NoV GI, NoV GII, HAV) in quantità
sufficiente e allestire la piastra come segue:
1. i campioni da sottoporre ad analisi (5±0.1µl di RNA di campione/pozzetto)
2. un controllo negativo (5±0.1µl di acqua per biologia molecolare/pozzetto)
3. una controllo positivo (5±0.1µl di acqua e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA, i.e.
appropriata diluizione di RNA estratto da campione fecale in cui sia stata riscontrata
presenza di NoV del genogruppo in esame o RNA estratto da sospensione virale di HAV)
4. un controllo di inibizione (5±0.1µl di campione e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA, i.e.
appropriata diluizione di RNA estratto da campione fecale in cui sia stata riscontrata
presenza di NoV del genogruppo in esame o RNA estratto da sospensione virale di HAV)
Aggiungere 20±0.5µl della relativa TaqMan mastermix ad ogni campione (la mastermix può anche
essere aggiunta ai relativi pozzetti prima dell’aggiunta del templato).
5. un controllo di processo, scelto tra quelli indicati al punto 3.4 da saggiare parallelamente
tramite aggiunta di mix specifica. Questo controllo verrà aggiunto nel caso si voglia
verificare l’efficienza dell’estrazione ad ogni analisi.
Vedi Appendice D per i dettagli della mix di PCR adottata in questa procedura.
8.4.3. Amplificazione
Chiudere tutti i pozzetti con tappi ottici o film adesivo.
Sottoporre la piastra ad un ciclo di reazione comprendente uno stadio iniziale per la trascrizione
inversa e almeno 45 cicli di PCR. La durata e le temperature di ogni step (retrotrascrizione,
disattivazione della RT, denaturazione, annealing, estensione) dipenderà dai reagenti usati; essi
dovrebbero essere basati sulle raccomandazioni del produttore ma possono essere ulteriormente
ottimizzati.
Vedi Appendice D per i dettagli della amplificazione adottata in questa procedura.
pag. 8 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
8.4.4. Analisi dei dati di fluorescenza
I requisiti minimi per l’analisi dei dati di amplificazione sono definiti nella ISO 22174. Le curve di
amplificazione dovrebbero essere analizzate utilizzando l’approccio raccomandato dal produttore
dell’apparecchio di real-time PCR. Il valore soglia (“threshold”) dovrebbe essere settato in maniera
tale da attraversare l’area dove le curve di amplificazione (in rappresentazione logaritmica) sono
parallele (fase esponenziale).
Tutte le curve di amplificazione dovrebbero essere verificate per identificare falsi positivi (reazioni
con valori di Ct non associati con amplificazione) causati da segnali di background alti o irregolari.
Questo dovrebbe essere annotato e i risultati di ogni reazione condizionata in questo modo
dovrebbero essere considerati negativi. In aggiunta tutte la curve di fluorescenza dovrebbero essere
controllate per verificare che i valori di Ct generati dall’analisi del software corrispondano alla fase
esponenziale dell’amplificazione (e che essa non sia distorta da rumore di fondo alto o irregolare).
Laddove i valori di Ct siano distorti, i valori corretti vanno registrati in aggiunta al valore generato
dal software.
9. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
9.1.
Generale
Ogni controllo (controllo esterno ad RNA, RNA del controllo di processo) possiede un proprio
valore di Ct atteso valido o un range di valori accettabili, stabiliti in base ai saggi valutativi (§ 10).
Se i risultati osservati per i controlli differiscono da quelli attesi, i campioni potrebbero richiedere
una ripetizione del test.
I controlli negativi (acqua per biologia molecolare) dovrebbero sempre essere negativi. Se risultati
positivi occorrono in questi controlli, ogni campione che presenta risultati positivi dovrebbe essere
ritestato.
I campioni in esame sono considerati positivi qualora presentino un Ct ≤ 44.0; i risultati sono
considerati accettabili se il controllo positivo presenta un Ct ≤ 44.0 e i controlli negativi di
estrazione e di RT-PCR presentano valori di Ct > 44.0.
9.2. Espressione dei Risultati
I risultati positivi di ogni virus target dovrebbero essere espressi come “presenza di genoma virale in
5 µl di estratto di epatopancreas di mollusco”.
Se il virus target non è rilevato i risultati dovrebbero essere espressi come “non rilevato genoma
virale in 5 µl di estratto di epatopancreas di mollusco”.
Se non è stato ottenuto un risultato valido, i risultati dovrebbero essere espressi come “nessun
risultato”.
pag. 9 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
10. SAGGI PER LA VALUTAZIONE DEL METODO
Vengono riportati i saggi da eseguire prima dell’applicazione del metodo su campioni da
analizzare. Essi consentono:
a) la valutazione dell’efficienza dell’amplificazione e della procedura di estrazione, da
utilizzare come parametri di assicurazione della qualità e non per il calcolo dei risultati
analitici.
b) la scelta della concentrazione dell’RNA EC da utilizzare nell’applicazione del metodo.
Questa deve fornire un valore di Ct rappresentativo rispetto a quelli ottenuti dai campioni
naturalmente contaminati
c) la scelta della concentrazione del CP da utilizzare durante l’applicazione del metodo
d) il calcolo dei valori di Ct con le relative deviazioni standard (DS) di riferimento per i
controlli adottati (RNA-EC, CP) da considerare nella interpretazione dei risultati ad ogni
applicazione del metodo.
I saggi per la valutazione delle efficienze di cui al punto a) dovrebbero essere ripetuti ad intervalli
regolari tra determinazioni omogenee (stessa matrice, stesso parametro da ricercare)
10.1 Analisi del virus target
Preparare diluizioni 10-1, 10-2 and 10-3 in acqua per biologia molecolare del controllo esterno ad
RNA.
Per ogni campione preparare:
- 1 pozzetto nella piastra ottica con 5±0.1µl di RNA di campione
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di estratto di campione e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA non
diluito
Per la curva standard del controllo esterno ad RNA preparare:
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA
non diluito
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA
diluito 10-1
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare e 1±0.05µl di controllo esterno ad RNA
diluito 10-2
pag. 10 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Per i controlli negativi preparare:
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare
Aggiungere 20±0.5µl della relativa TaqMan mastermix ad ogni campione (la mastermix può anche
essere aggiunta nei relativi pozzetti prima dell’aggiunta del templato).
10.2 Analisi del controllo di processo
Immediatamente prima di processare un gruppo di campioni, unire insieme un numero di aliquote di
controllo di processo sufficiente per la verifica di ogni campione (10µl per campione più 25µl di
eccesso).
Diluire un’aliquota di 20±0.5µl di controllo di processo in rapporto 1:10 utilizzando acqua per
biologia molecolare e conservare a 5±3ºC per un massimo di 24 ore o in aliquote per singolo uso a
una temperatura ≤15ºC per periodi più lunghi.
Riscaldare a 99±2ºC per 5 min ± 30 sec utilizzando un blocco scaldante o apparecchiatura
equivalente in modo da rilasciare l’RNA.
Raffreddare i tubi rapidamente, centrifugare a ≥ 3000 x g per 1min, quindi trasferire il sovranatante
(“RNA del controllo di processo”) in un nuovo tubo.
Preparare in acqua per biologia molecolare diluizioni 10-1, 10-2 e 10-3 dell’RNA del controllo di
processo.
Per ogni campione, a cui è stato aggiunto il CP prima del trattamento con proteinasi K, preparare:
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di RNA di campione
Per la curva standard dell’RNA del controllo di processo preparare:
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di RNA del controllo di processo diluito 10-1
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di RNA del controllo di processo diluito 10-2
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di RNA del controllo di processo diluito 10-3
Per i controlli negativi preparare:
- 1 pozzetto con 5±0.1µl di acqua per biologia molecolare
Aggiungere 20±0.5µl della relativa TaqMan mastermix ad ogni campione (la mastermix può anche
essere aggiunta ai relativi pozzetti prima dell’aggiunta del templato).
pag. 11 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
10.3 Valutazione delle efficienze di reazione
10.3.1 Curve standard
Controllare i valori di Ct di tutte le serie di diluizioni delle curve standard (RNA del controllo di
processo, RNA del controllo esterno) per tutti i punti che non cadono in prossimità della linea del
“best fit”. Questi valori non dovrebbero essere incorporati nel calcolo della curva standard.
Utilizzare i rimanenti valori per creare la curva standard. Curve con valori di r2 <0.98 non
dovrebbero essere usate per i calcoli.
10.3.2 Calcolo dell’efficienza di amplificazione
Verificare il valore di Ct per il campione nei pozzetti con RNA del controllo esterno. Usare questo
valore per stimare l’efficienza di amplificazione facendo riferimento alla curva standard del
controllo esterno ad RNA.
Si considera accettabile un’efficienza di amplificazione >50%.
10.3.3 Calcolo dell’efficienza di estrazione
Verificare il valore di Ct per il controllo di processo dai pozzetti con RNA dei campioni. Usare
questi valori per stimare il recupero del controllo di processo facendo riferimento alla curva
standard dell’RNA del controllo di processo.
Per i molluschi bivalvi calcolare l’efficienza di estrazione dividendo il recupero per 0.5 e
moltiplicando per il volume totale di omogenato alla fine dell’estrazione (3 ml).
Si considera accettabile un’efficienza di estrazione >1%.
10.4 Limite teorico di rilevazione
La quantità minima teorica di target rilevabile nel campione con questa procedura è 10 copie di
genoma.
Per i campioni di molluschi il limite teorico di rilevazione (tLOD) si ottiene dividendo tali valori
per 0.5 e moltiplicando per il volume totale di omogenato misurato alla fine dell’estrazione (3 ml).
pag. 12 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Appendice A
BIBLIOGRAFIA
[1]
Costafreda MI, Bosch A, Pintó RM. 2006. Development, evaluation, and standardization of a
real-time TaqMan reverse transcription-PCR assay for quantification of hepatitis A virus in clinical
and shellfish samples. Appl Environ Microbiol. 72(6):3846-55.
[2]
Lowther JA, Henshilwood K, Lees DN. 2008. Determination of norovirus contamination in
oysters from two commercial harvesting areas over an extended period, using semiquantitative realtime reverse transcription PCR. J Food Prot. 71(7):1427-33.
[3]
Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J.
1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28(3):495-503.
[4]
da Silva AK, Le Saux JC, Parnaudeau S, Pommepuy M, Elimelech M, Le Guyader FS. 2007.
Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using Real-Time Reverse
Transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II. Appl Environ Microbiol.
73(24):7891-7.
[5]
Svraka S, Duizer E, Vennema H, de Bruin E, van der Veer B, Dorresteijn B, Koopmans M.
2007. Etiological role of viruses in outbreaks of acute gastroenteritis in The Netherlands from 1994
through 2005. J Clin Microbiol. 45(5):1389-94.
[6]
Loisy F, Atmar RL, Guillon P, Le Cann P, Pommepuy M, Le Guyader FS. 2005. Real-time RTPCR for norovirus screening in shellfish. J Virol Methods. 123(1):1-7.
[7]
Kageyama T, Kojima S, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S, Hoshino FB, Takeda N,
Katayama K. 2003. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on
real-time quantitative reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol. 41(4):1548-57.
[8]
Le Guyader FS, Parnaudeau S, Schaeffer J, Bosch A, Loisy F, Pommepuy M, Atmar RL.
2009. Detection and quantification of norovirus in shellfish. Appl Environ Microbiol. 75: 618-24.
[9]
Pintó, R.M., M.I. Costafreda, E. Ribes, and A. Bosch. 2009. From quantitative risk-assessment to
risk management in shellfish-borne outbreaks of hepatitis A. manuscript submitted to Appl Environ
Microbiol).
[10]
Martin LR, Duke GM, Osorio JE, Hall DJ, Palmenberg AC. 1996. Mutational analysis of the
mengovirus poly(C) tract and surrounding heteropolymeric sequences. J Virol. 70(3):2027-31.
[11]
Di Pasquale S., Paniconi M. De Medici D., Suffredini E. and Croci L. 2009. Duplex Real Time
PCR for the detection of Hepatitis A virus in shellfish using Feline Calicivirus as a process control.
J Virol. Meth. (in press)
pag. 13 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Appendice B
B.1 Soluzione di proteinasi K
B.1.1 Composizione
Proteinasi K (30U/mg)
Acqua per biologia molecolare
20±0.1mg
200±2ml
B.1.2 Preparazione
Dissolvere la Proteinasi K in acqua. Mescolare accuratamente.
Conservare in volumi adatti al consumo a -20±5ºC per un massimo di 6 mesi. Una volta scongelata
conservare a 4±2ºC e usare entro una settimana.
B.2 Phosphate buffered saline (PBS)
B.2.1 Composizione
NaCl
8.0±0.1g
Cloruro
di
potassio
0.2±0.01g
B.8.2 Preparation
Disodio
idrogno fosfato
1.15±0.01g
Mix
the components
together, adjust the pH, if necessary,
to 7.3±0.2 at.
Potassio
diidrogeno
fosfato
0.2±0.01g
Proteinase K solution
Acqua per biologia molecoalre
1000±2ml
B.2.2 Preparazione
Dissolvere le polveri in acqua, aggiustare il pH, se necessario, a 7.3±0.2 a 25ºC. Sterilizzare in
autoclave.
pag. 14 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Appendice C
Primers e sonde TaqMan per la rilevazione di HAV, Norovirus GI e GII
HAV
HAV68 (FW):
TCA CCG CCG TTT GCC TAG
[1]
HAV240 (REV):
GGA GAG CCC TGG AAG AAA G
[1]
HAV150(-) (PROBE):
CCT GAA CCT GCA GGA ATT AA
[1]
Sonda marcata 5’ 6-carboxyfluorescein (FAM), 3’ MGB (minor groove binder)
L’allineamento di sequenze usando tutte le sequenze disponibili in GenBank per la regione target
dimostra che questo set di primer/probe è adeguato per la rilevazione di tutti i genotipi. In aggiunta
l’analisi di quasispecie dello spettro di mutanti indica che questa regione non è prona alla variabilità
e che questo saggio dovrebbe possedere robustezza a lungo termine. La specificità dei primers è
stata verificata con 10 differenti Picornavirus: poliovirus (sierotipo 1 ceppo vaccinale), human
enterovirus B (echovirus 1), human enterovirus B (echovirus 11), human enterovirus B (echovirus
30), human enterovirus B (coxsackievirus-B5), human enterovirus C (coxsackievirus-A24), human
enterovirus D (enterovirus 70), bovine enterovirus, porcine teschovirus (porcine enterovirus 1) e
encephalomyocarditis virus, ed altri virus enterici come hepatitis E virus, human and porcine
rotavirus (group A), norovirus, mamastrovirus (human astrovirus type 1) e human adenovirus F
(enteric adenovirus type 40). Nessuno dei virus testati ha dato risultati positivi né ad alte
concentrazioni (106 – 108 TCID50/ml o sospensioni fecali al 10%) o basse concentrazioni (104
TCID50/ml o diluizioni 1/10 di sospensioni fecali al 10%). Il LOD del saggio è 10 molecole
ssRNA, 1 molecola di RNA virale e 0.05 virus infettanti per reazione[1].
Norovirus GI
QNIF4 (FW):
NV1LCR (REV):
NVGG1p (PROBE):
CGC TGG ATG CGN TTC CAT
CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC
TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT
[4]
[5]
[5]
Probe labelled 5’ 6-carboxyfluorescein (FAM), 3’ 6-carboxy-tetramethylrhodamine (TAMRA)
D.3 Norovirus GII
QNIF2 (FW):
ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA
[6]
COG2R (REV):
TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
[7]
QNIFS (PROBE):
AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG
[6]
Probe labelled 5’ 6-carboxyfluorescein (FAM), 3’ 6-carboxy-tetramethylrhodamine (TAMRA)
L’area selezionata per la ricerca dei Norovirus è la regione fortemente conservata all’estremità 5'
pag. 15 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
dell’ORF2 [7]. L’allineamento di sequenze utilizzando tutte le sequenze disponibili in GenBank per
la regione target dimostra che questo set di primer/probe è adeguato per la ricerca di tutti i
Norovirus di GI e GII rispettivamente. In aggiunta l’efficacia e la sensibilità di primers e probe è
stata verificata usando 18 ceppi di riferimento di NoV: GI.1 (Norwalk virus), GI.2 (Whiterose),
GI.3 (Southampton), GI.4 (Malta), GI.5 (Musgrove), GI.6 (Mikkeli), GI.7 (Winchester), GI.10
(Boxer), GII.1 (Hawaii), GII.2 (Melksham), GII.3 (Toronto), GII.4 (Grismby), GII.6 (Seacroft),
GII.7 (Leeds), GII.10 (Erfurt), le varianti GIIb e GIIc e GIV (Alphatron).
La specificità dei primers è stata verificata verso 6 virus enterici umani: poliovirus (sierotipo 1
ceppo vaccinale), hepatitis A virus, hepatitis E virus, Aichi virus, astrovirus and rotavirus. La
specificità è sata inoltre testata su 7 batteri che possono essere rtrovati nei molluschi: Escherichia
coli, Shewenella putrefaciens, Chromobacterium violaceum, Aeromonas sobria, Vibrio
alginolyticus, Vibrio paraheamolyticus e Vibrio cholerae). Nessuno dei virus testati o dei batteri
hanno dato risultati positivi. Il LOD dei saggi è da 1 a 10 molecole virali di RNA (a seconda del
ceppo di NoV)[6,8].
pag. 16 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Appendice D
Composizione delle one-step TaqMan real-time RT-PCR mastermix utilizzando il kit
Invitrogen RNA Ultrasense One-step qRT-PCR system e parameters di amplificazione
D.1 Mastermix
Reagenti
Concentrazione
25µl)
5 x Ultrasense reaction mix
finale
(in Volume per reazione (µl)
1x
5,0
FW Primer (12,5 µM)
500 nM
1,0
REV Primer (22,5 µM)
900 nM
1,0
Probe (6,25 µM)
250 nM
1,0
Rox reference dye (50x)
a
1x
0,5
RNA Ultrasense enzyme mix
-
1,25
Acqua per biologia molecolare
-
10,25
Volume totale
-
20±0,2
a Con apparecchiature di real-time PCR della Applied Biosystems, ROX dovrebbe essere utilizzato
ad una concentrazione 1 x; per apparecchi Stratagene (i.e. MX3000), ROX può essere usato a
concentrazione 0.1 x, o può essere tralasciato dalla mastermix. Per altri produttori consultare le
istruzioni dell’apparecchio.
D.2 Parametri di amplificazione
Temperatura e
tempo
Step
Numero di cicli
Acquisizione
Retrotrascrizione
55 °C per 1 h
1
no
Preriscaldamento
95 °C per 5 min
1
no
Amplificazione
Denaturazione
95 °C per 15 s
Annealingextension
60 °C per 1 min
65 °C per 1 min
no
45
no
si (singola)
pag. 17 di 17
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
DETERMINAZIONE
DI NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI BIVALVI
MEDIANTE REAL TIME PCR
CORREZIONI E INTEGRAZIONI AL TESTO
§ 6.9: in luogo di “Centrifuga da banco e rotore in grado di operare a 4,000 x g” inserire
“Centrifuga da banco e rotore in grado di operare a 3.000 x g”
§ 8.4.1 punto 4: in luogo di “un controllo di inibizione” inserire “un controllo di inibizione per
ciascun campione”
§ 9.1 ultimo paragrafo: in luogo di “i controlli negativi di estrazione e di RT-PCR” inserire “i
controlli negativi di RT-PCR”
§ 10 punto “d”: in luogo di “riferimento per i controlli adottati (RNA-EC, CP)” inserire
“riferimento per i controlli adottati (RNA-EC)”
§ 10.1 primo paragrafo: in luogo di “Preparare diluizioni 10-1, 10-2 and 10-3 in acqua” inserire
“Preparare diluizioni 10-1 e 10-2 in acqua”
§ 10.3.2 ultimo paragrafo: in luogo di “Si considera accettabile un’efficienza di amplificazione
>50%.” inserire “Si considera accettabile un’efficienza di amplificazione ≥50%. Determinazioni
con efficienza di amplificazione inferiore sono considerate accettabili qualora la ricerca del
parametro target abbia dato esito positivo.”
§ 10.3.3 ultimo paragrafo: in luogo di “Si considera accettabile un’efficienza di estrazione >1%.”
inserire “Si considera accettabile un’efficienza di estrazione ≥1%. Determinazioni con efficienza di
estrazione inferiore sono considerate accettabili qualora la ricerca del parametro target abbia dato
esito positivo.”
pag. 1 di 4
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
INTEGRAZIONI ALLA PROCEDURA
1. Formule per il calcolo dell’efficienza di amplificazione (§ 10.3.2)
L’efficienza di amplificazione della reazione di PCR è calcolata mediante la curva standard della
reazione.
La formula di calcolo è:
E = (10 -1/slope) –1
dove lo ‘slope’ è il coefficiente angolare della curva standard.
L’efficienza di amplificazione per il target nelle reazioni effettuata sul campione in analisi è
calcolata mediante confronto del Ct ottenuto dal campione addizionato di controllo esterno con il Ct
del solo controllo esterno (alla medesima diluizione).
La formula di calcolo è:
E = 2 -∆Ct
dove ∆Ct = Ct campione – Ct standard
2. Formule per il calcolo dell’efficienza di estrazione (§ 10.3.3)
L’efficienza dell’estrazione è calcolata mediante confronto del Ct ottenuto dal campione con il Ct
del controllo di processo.
La formula di calcolo è:
R = 2 -∆Ct * 0.6
dove ∆Ct = Ct campione – Ct standard alla diluizione 10-1
Il fattore 0.6 tiene conto della frazione di campione sottoposta ad estrazione degli acidi nucleici (§
8.3)
nota: in alternativa, qualora i risultati ottenuti non consentissero il calcolo sopra descritto è possibile
stimare il recupero come segue: R = 2 -∆Ct * 0.06 dove ∆Ct = Ct campione – Ct standard alla
diluizione 10-2
pag. 2 di 4
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
3. Esempio caricamento campioni e controlli
3.1 Piastra contente campioni, controlli di amplificazione e controlli di estrazione per ciascun
campione, curve standard per la valutazione delle efficienze di ciascuna amplificazione
Tale modalità di caricamento della piastra consente il calcolo dell’efficienza di amplificazione (i.e.
presenza di inibenti) e dell’efficienza di estrazione (i.e. recupero) per ciascun campione e la verifica
dell’efficienza delle reazioni predisposte (amplificazione del target e del controllo di processo).
3.2 Piastra contente campioni, controlli di amplificazione e controlli di estrazione per ciascun
campione
pag. 3 di 4
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Tale modalità di caricamento della piastra consente il calcolo dell’efficienza di amplificazione (i.e.
presenza di inibenti) e dell’efficienza di estrazione (i.e. recupero) per ciascun campione. La verifica
dell’efficienza delle reazioni (amplificazione del target e del controllo di processo) verrà effettuata
periodicamente.
3.3 Piastra contente campioni e controlli di amplificazione per ciascun campione
Tale modalità di caricamento della piastra consente il calcolo dell’efficienza di amplificazione (i.e.
presenza di inibenti) per ciascun campione. La verifica dell’efficienza del processo di estrazione e
dell’efficienza delle reazioni (amplificazione del target e del controllo di processo) verrà effettuata
periodicamente.
pag. 4 di 4
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Direttore: dott.ssa Luciana Croci
DICHIARAZIONE DI VALIDAZIONE
OGGETTO: Metodo per la ricerca di epatite A e Norovirus in alimenti mediante
Real- time PCR
CAMPO DI APPLICAZIONE: molluschi lamellibranchi
Il metodo in oggetto è stato sottoposto a validazione presso il Laboratorio
Nazionale di Riferimento (LNR) per le contaminazioni virali dei molluschi
bivalvi e dichiarato idoneo all’uso in data 26.06.2009
REQUISITI :
A. Determinazione HAV
Sensibilità (inclusività della PCR): 100%
Specificità (esclusività della PCR): 100%
Efficienza PCR: >95%
tLOD: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas
B. Determinazione NoV GI
Sensibilità (inclusività della PCR): 100%
Specificità (esclusività della PCR): 100%
Efficienza PCR: >95%
tLOD: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas
C. Determinazione NoV GII
Sensibilità (inclusività della PCR): 100%
Specificità (esclusività della PCR): 100%
Efficienza PCR: >95%
tLOD: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas
Pag. 1 di 2
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Direttore: dott.ssa Luciana Croci
D. Determinazione controllo di processo (Mengovirus)
Sensibilità (inclusività della PCR): 100%
Specificità (esclusività della PCR): 100%
Efficienza PCR: >95%
tLOD: 10 copie genomiche/5 µl di estratto di epatopancreas
Recupero ≥ 1%
Roma 21.03.2011
Il Responsabile del LNR per le
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Dr.ssa Luciana Croci
Pag. 2 di 2
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Direttore: dott.ssa Luciana Croci
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Corrispondenze fra protocollo “DETERMINAZIONE DI NOROVIRUS ED HAV IN
MOLLUSCHI
BIVALVI
MEDIANTE
REAL
TIME
PCR
e
successive
integrazioni/correzioni” formulato dal LNR per il controllo delle contaminazioni virali dei
molluschi bivalvi su mandato del Ministero della Salute (novembre 2009) e la POMIAC
01.002
protocollo “DETERMINAZIONE DI
NOROVIRUS ED HAV IN MOLLUSCHI
BIVALVI MEDIANTE REAL TIME PCR”
(novembre 2009)
POMIAC 01.002
Introduzione
§ 1. Scopo e campo di applicazione
§ 2. Normative di riferimento
§ 3. Termini e definizioni
Introduzione
§ 1. Scopo e campo di applicazione
§ 2. Normative di riferimento
§ 3. Termini e definizioni
§ 4. Principio
§ 5. Reagenti
specifiche operative in evidenza:
- “controllo di processo” (cfr. § 4.4.1)
- “controllo esterno ad RNA” (cfr. § 4.4.2)
§ 4. Principio
§ 5. Reagenti
§ 5.1
§ 5.2
§ 5.3
§ 5.4
§ 5.5
§ 5.6
§ 5.7
§ 5.8
§ 5.9
§ 5.10
§ 6. Apparecchiature
§ 7. Campionamento e campione
specifiche operative in evidenza:
- indicazione delle modalità di estrazione
dell’RNA (riferimento ad Appendice C)
§ 5.1
§ 5.2.1 e § 5.3.1
§ 5.3.2
§ 5.2.2
§ 5.2.6
§ 5.2.4
§ 5.2.5
§ 5.2.3 e § 5.3.4
§ 5.3.3
§ 5.3.5
§ 6. Apparecchiature
§ 7. Campionamento
pag. 1 di 3
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Direttore: dott.ssa Luciana Croci
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
§ 8. Procedura
§ 8. Procedura
§ 8.4.3
§ 8.4.4
§ 9. Interpretazione dei risultati
specifiche operative in evidenza:
- utilizzo del controllo di processo in
ciascun campione (cfr. § 8.2.1)
- utilizzo della curva standard del controllo
esterno a RNA (cfr. § 8.4.2.1)
§ 8.1
§ 8.2.2
§ 8.3
§ 8.4
§ 8.4.1
§ 8.4.2.1 Analisi del virus target (inclusa
curva standard del controllo esterno a RNA)
e § 8.4.2.2 Analisi del controllo di processo
§ 8.4.2.3
§ 8.4.2.4
§ 9. Interpretazione dei risultati
§ 8.1
§ 8.2
§ 8.3
§ 8.4
§ 8.4.1
§ 8.4.2
§ 9.1
§ 9.2
§ 10 Saggi per la valutazione del metodo
§ 10.1
§ 10.2
§ 10.3.1
§ 10.3.2
§ 10.3.3
§ 10.3.4
Appendice A
specifiche operative in evidenza:
- utilizzo dell’efficienza di amplificazione
(cfr. § 9.2) e dell’efficienza di estrazione
(cfr. § 9.3) come parametri di
assicurazione della qualità del dato
analitico
§ 9.1
§ 10
Gli elementi descritti sono integrati nella
procedura ed eseguiti contestualmente al
processo analitico
§ 8.4.2.1
§ 8.2.1 e § 8.4.2.2
§ 9.2
§ 9.3
§ 9.4
§ 9.5
Appendice A
pag. 2 di 3
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto Adempimenti Comunitari e Sanità Pubblica
Direttore: dott.ssa Luciana Croci
Laboratorio Nazionale di Riferimento per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Appendice B
Appendice C
Appendice D
Appendice B
Appendice C
specifiche operative in evidenza:
- include istruzioni sulle modalità di
estrazione dell’RNA
Appendice D
specifiche operative in evidenza:
- include istruzioni per la determinazione
del controllo di processo
Appendice E
Appendice F ed G [omissis]
specifiche operative in evidenza:
- include istruzioni per la produzione dei
controlli esterni ad RNA
nota: I controlli esterni ad RNA sono forniti
agli Istituti richiedenti dall’LNR per le
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
Appendice H
specifiche operative in evidenza:
- include istruzioni per l’interpretazione dei
dati di fluorescenza sullo strumento di
PCR real-time in dotazione all’LNR per
le contaminazioni virali dei molluschi
bivalvi
Appendice J
specifiche operative in evidenza:
- include istruzioni per la costruzione delle
curve
standard,
per
il
calcolo
dell’efficienza di amplificazione e per il
calcolo dell’efficienza di estrazione
pag. 3 di 3
