ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA PIANTE MEDIANTE RNeasy

ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA PIANTE MEDIANTE RNeasy Plant MiniKit (Qiagen)
1. Determinare la quantità di materiale vegetale da estrarre. Non usare più di 100 mg di tessuto.
2. Trasferire il tessuto nel mortaio e macinarlo con il pestello fino a ridurlo in polvere. Trasferire la polvere
in una provetta da 2 ml (raffreddare provetta e spatola prima di aggiungere la polvere).
3. Aggiungere 450 µl di Buffer RLT, quindi mescolare vigorosamente mediante il vortex. Incubare quindi
per 3 minuti a 65°C.
4. Trasferire il lisato nelle colonnine QIAshredder (viola) e contrifugare per 2 minuti alla massima velocità.
Trasferire il surnatante del flow-through in una nuova provetta da centrifuga.
5. Aggiungere 0.5 volumi di etanolo assoluto freddo e miscelare con la pipetta.
6. Trasferire tutto il campione (generalmente circa 650 µl) nelle colonnine RNeasy spin column (rosa) e
centrifugare per 15 sec alla massima velocità. Scartare il flow-through.
7. Aggiungere 350 µl di Buffer RW1 alla colonnina RNeasy spin column. Centrifugare per 15 sec alla
massima velocità. Eliminare il flow-through.
8. Aggiungere 500 µl di Buffer RPE alla colonnina, centrifugare per 15 sec alla massima velocità. Scartare
il flow-through.
9. Aggiungere 500 µl di Buffer RPE alla colonnina, centrifugare per 2 minuti alla massima velocità. Scartare
il flow-through.
10. Posizionare la colonnina su una provetta da 2 ml e centrifugare per 1 minuto alla massima velocità.
11. Posizionare la colonnina su una provetta 1.5 ml. Aggiungere 40 µl di H2O DEPC direttamente sulla
membrane della colonnina. Centrifugare 1 minuto alla massima velocità per eluire l’RNA.
ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA PIANTE MEDIANTE TRIzol Reagent (Invitrogen)
1. Determinare la quantità di materiale vegetale da estrarre. Non usare più di 100 mg di tessuto.
2. Trasferire il tessuto nel mortaio e macinarlo con il pestello fino a ridurlo in polvere. Trasferire la
polvere in una provetta da 2 ml (raffreddare provetta e spatola prima di aggiungere la polvere).
3. Aggiungere 1 ml di TRIzol e mescolare vigorosamente mediante il vortex. Incubare 5 minuti a T°
ambiente, per permettere la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici.
4. Aggiungere 200 µl di cloroformio. Vortex ed incubare 3 minuti a T° ambiente. Centrifugare a 12000
rpm per 15 minuti. Dopo centrifugazione si ha una separazione di fase, si recupera la fase acquosa
superiore e la si trasferisce in un nuovo tubo da 1.5 ml.
5. Aggiungere 500 µl di isopropanolo, si mescola e si incuba 10 minuti a T° ambiente. Centrifugare a
12000 rpm per 15 minuti a 4°C. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo 70%, centrifugare a 9000 rpm per
10 minuti a 4°C.
6. Eliminare l’etanolo e fare asciugare il pellet.
7. Aggiungere 30 µl di H2O DEPC.
MISURA DELLA CONCENTRAZIONE DELL’RNA ALLO SPETTROFOTOMETRO A CAPILLARI.
Si utilizza uno spettrofotometro a capillari di quarzo, con il quale misuriamo l’assorbanza del campione a 260
e 280 nm. In questo modo è possibile ottenere sia la concentrazione di acido nucleico nel campione, sia la
purezza.
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La concentrazione, in g/ml, viene ottenuta moltiplicando l’assorbanza del campione misurata a 260 nm, per
un opportuno fattore di conversione, variabile in funzione del tipo di acido nucleico che intendiamo
determinare.
Abs260nm x fattore conversione = Concentrazione (g/ml)
Acido nucleico
Fattore di conversione
RNA
40
ssDNA e OligoDNA
33
dsDNA
50
La purezza del campione di acido nucleico viene espressa come rapporto Abs260/Abs280 ed è circa 1.9-2.0
nel caso di campioni di RNA.
TRATTAMENTO DELLA PREPARAZIONE DI RNA TOTALE MEDIANTE DNASE
2 g RNA totale
1 l 10x buffer
2 l RQ1 enzima (1U/g RNA totale)
H2O DEPC Fino a 10 l
Incubare a 37°C per 30 minuti. Aggiungere 1 l di RQ1 DNase stop solution per terminare la reazione.
Incubare a 65°C per inattivare la DNase.
Reverse transcription
10 l RNA trattato con DNase nello step precedente
1 l oligo (dT)15 (0.5 g/reazione)
Incubare a 70°C per 10 minuti. Centrifugare 10 secondi alla massima velocità e porre in ghiaccio.
Miscela di retrotrascrizione:
4 l
1.3l
1l
0.5 l(20U/rx)
1 l
5 minuti a 25°C
42°C per 1 ora
70°C per 15 minuti
Conservare il campione a -80°C.
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