C.d.L.
Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche
Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei
Microrganismi
AA 2007 2008
BIOTECNOLOGIE DEI MICRORGANISMI
Università degli Studi di Bari - Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche 2007 2008
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
1 1
APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE
Farmacologia e Medicina
Identificazione e isolamento del gene:
• Estrazione del DNA e sua frammentazione
separazione del gene di interesse.
e
• Amplificazione enzimatica.
• Nel caso di geni di tipo eucariotico, considerata la loro
discontinuità sintesi a partire dal RNAm.
• Analisi in alternativa della sequenza proteica con
produzione di una sequenza di aminoacidi a cui
corrisponderebbe una sequenza di basi Rnam.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
2
• Libreria genomica: collezione di frammenti
di DNA genomico inserito poi in un fago
(vettore).
• cDNAteca: frammenti di DNA estratti da
un tessuto o da un gruppo di cellule.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
3
APPLICAZIONI DELLE BIOTECNOLOGIE
Farmacologia e Medicina
•
Il processo di ricerca e scoperta di nuovi farmaci sta cambiando,
l’approccio è oggi più biologico di tipo cellulare e molecolare, rispetto
a quello estrattivo e chimico.
•
La ricerca di biotecnologie essenzialmente si basa sulla messa a
punto di nuove tecnologie per la diagnosi, prevenzione, e terapia delle
malattie.
•
I limiti nella produzione dei farmaci umani erano soprattutto (farmaci
di natura proteica) stavano nei costi di produzione e nelle quantità
limitate prodotte (prima dell’introduzione del DNA ricombinante).
•
I prodotti ottenuti per estrazione dal sangue potevano presentare
problemi notevoli di sicurezza. Si pensi all’ AIDS, in seguito alle
trasfusioni e all’inoculazione di prodotti biologici derivati dal sangue
ha causato la tragica diffusione dei virus dell’epatite B e C.
•
La diffusione della BSE ha provocato il ritiro di alcuni emoderivati.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
4
Farmacologia e Medicina
• Le scienze biotecnologiche oggi trovano vasta applicazione
nella diagnosi, terapia e prevenzione delle malattie dell’uomo.
• La maggior parte delle ricerche sono rivolte alla produzione di
proteine o peptidi per scopi terapeutici, ormoni o prodotti del
sangue antinfettivi o immunomodulatori.
• Altre ricerche sono rivolte allo sviluppo di reagenti e tecniche
diagnostiche (anticorpi monoclonali, PCR sonde etc.) .
• Altre ricerche sono rivolte allo studio degli animali transgenici
in grado di produrre farmaci nel loro latte, o modificati
geneticamente inmodo che possano rappresentare donatori di
organi o tessuti.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
5
Il gene che codifica per farmaci salvavita viene
inserito mediante le tecniche del DNA r in un
batterio o in un altro tipo di cellula che è così
commissionata a produrre la molecola
farmacologica in grande quantità e purezza.
Negli anni ’90 sono entrati in uso molti farmaci
ricombinanti : attivatore tissutale del plasminogeno
(TPA), eritropoietina (EPO), colony stimulating
factors (CSF), interleuchina 2 (IL-2), interferone
(IFN), vaccino per l’epatite B.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
6
Farmacologia e Medicina
• La tecnologia del DNA ricombinante permette la
produzione di un’ampia serie di farmaci in quantità
notevoli molto efficaci e sicuri nell’uso.
• Oggi vengono prodotte 300 proteine differenti con
potenziale o già validata attività terapeutica per
l’uomo derivanti da microorganismi ricombinanti nei
quali è stato clonato lo specifico gene codificante
(anche cellule animali).
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
7
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
8
Insulina umana
• È il primo prodotto ricombinante, è prodotta da batteri ricombinanti
geneticamente modificati. (1982), è stato il rimo farmaco
biotecnologico.
• L’insulina è prodotta dalle cellule beta del pancreas, il suo ruolo è
quello di regolare l’assorbimento del glucosio dal sangue ai tessuti.
• La malattia che la carenza o la sua assenza genera è il diabete mellito,
la cui cura prevedeva inizialmente inoculazioni giornaliere di insulina
di origine animale (bovina) con costi (estrazione e purificazione) e
rischi di reazioni collaterali molto gravi, inoltre con efficacia in molti
casi dubbia.
• L’ingegneria genetica ha risolto questi problemi presentano un ormone
perfettamente identico a quello naturale umano attraverso il clonaggio
del gene all’interno di un batterio.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
9
Processo produttivo insulina
• L’insulina nella sua forma attiva è costituita da due
catene polipeptidiche (A, B) formate da 21 e 30
amminoacidi tenute insieme da ponti disolfuro.
• Tratti separati del singolo gene codificante codificano per
l’insulina. Il gene dell’insulina codifica per un’unica e
lunga catena polipeptidica chiamata proinsulina.
• La proinsulina viene poi convertita in insulina attraverso
il clivaggio del polipeptide centrale le due unità sono
tenute insieme da ponti disolfuro.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
10
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
11
Processo produttivo insulina
•
Per risolvere il problema sono stati due approcci, il primo prevede
l’inserimento nel batterio del gene tal quale e successivo clivaggio
chimico del prodotto ottenuto con asportazione del polipeptide
centrale.
•
Produzione da parte di due colture batteriche di delle singole catene A
e B e quindi legame chimico tra di loro per ottenere la molecola attiva.
•
Per ottenere il gene umano sono state usate tecniche differenti (è
molto difficile isolare un singolo gene dal genoma umano) , un primo
metodo è isolare dal pancreas l’RNA m che codifica per l’ormone
insulina e retro trascriverlo in una copia di DNA (sono presenti elevate
quantità di RNA m nelle cellule beta)
•
Il gene può essere anche sintetizzato a partire dalla sequenza di
amminoacidi presenti nella molecola della proinsulina e insulina, nella
corretta sequenza nucleotidica.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
12
Processo produttivo insulina
• Dopo avere ottenuto il gene
dell’
insulina derivato da RNA o dopo sintesi
chimica questo viene inserito nel
genoma di Escherichia coli che sarà
commissionato alla produzione di
insulina umana.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
13
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
14
Categorie di farmaci prodotti con
tecnica del DNA ricombinante
• Sono numerosi i farmaci prodotti mediante ingegneria genetica
in cellule procariote o eucariote:
• Ormoni peptidici: si identificano con peptidi o piccole proteine,
svolgono funzioni essenziali nel metabolismo e trovano quindi
grande impiego (farmaci, salvavita), ormone della crescita e
eritropoietina.
• Proteine del sangue: numerose proteine del sangue per uso
terapeutico che vengono prodotte per ingegneria genetica,
importanti proteine coinvolte nei processi di coagulazione del
sangue (fattore VII, VIII, IX) sia nei processi che degradano i
coaguli (plasminogeno), in questo modo è possibile curare con
basso costo numerose malattie genetiche, questi fattori erano
ottenuti da sangue di donatori e hanno provocato in passato
numerose infezioni virali (AIDS. Epatiti).
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
15
Categorie di farmaci prodotti con
tecnica del DNA ricombinante
•
Immuno modulatori e antitumorali : tra le principali sostanze sono da ricordare la serie
degli interferoni con attività antivirale o immuno modulatrice o ancora antitumorale, altre
molecole nella terapia antitumorale sono l’ interleuchina il tumor necrosis factor e
granulocyte – macrophage colony stimulating factor. Queste molecole agiscono o
direttamente sulla massa tumorale oppure possono stimolare le cellule delle difese
immunitarie, in modo da consentire un uso di farmaci citotossici a più levate
concentrazioni.
•
Peptidi atriali e neuropeptidi : gli atrii cardiaci sintetizzano e liberano una serie di peptidi
(attività endocrina) che influiscono su escrezione del sodio, volume dell’urina, tono della
muscolatura liscia, e vasodilatazione renale selettiva. Quindi la loro produzione è
importantissima nella prevenzione dell’ipertensione
•
Neuropeptidi: che comprendono endorfine e encefaline gastrine ed altri consentono la cura
di malattie mentali (Alzheimer, schizofrenia o depressione
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
16
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
17
Categorie di farmaci prodotti con
tecnica del DNA ricombinante
•
Antibiotici: negli anni ’40 ha inizio la produzione industriale di antibiotici con lo
sviluppo di ceppi fungini mutati e le colture sommerse capaci di produrre
elevate quantità di penicillina.
•
Le biotecnologie innovative compaiono negli anni ’70 quando i classici ceppi di
produzione funghi (Penicillium, Aspergillus etc.) e batteri (Acinetobacter,
Pseudomonas) vengono modificati geneticamente per ottenere prodotti più
attivi.
•
La resa di produzione è stata aumentata nel corso degli anni 10.000 volte,
costruendo geneticamente mediante trasferimento del plasmide con la
resistenza all’antibiotico ceppi microbici in grado di produrre elevate quantità
senza risentirne, nel corpo batterico i plasmidi inseriti potevano essere diverse
centinaia. La capacità di produzione dell’antibiotico era già presente nel
genoma batterico.
•
Attualmente l’obiettivo è la clonazione di geni che codificano per l’antibiotico e
trasferimento in opportune cellule ospiti mediante tecniche di ricombinazione
genetica, il primo antibiotico clonato è stato l’eritromicina (diverse decine di
geni clonati insieme)
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
18
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
19
Piante transgeniche
•
La tecnica del DNA r consente di far esprimere nelle piante rese transgeniche
sia proteine animali che prodotti medicinali.
•
Le piante producono proteine che sono quasi sempre indistinguibili da quelle
prodotte da un mammifero
•
I risultati più interessanti sono stati ottenuti in Nicotiana tabacum rese
transgeniche mediante Agrobacterium tumefaciens (vettore) in grado di
trasferire alle cellule vegetali i geni che codificano per l’emoglobina umana. Si
tratta di un batterio patogeno che invade l’ospite modificando il suo genoma e
introducendo i propri geni (galla), il batterio viene modificato in modo da non
indurre danni alla pianta e al suo interno (genoma) sono presenti geni di utilità
come quelli dell’emoglobina e dell’eritropoietina
•
Le piante erano quindi in grado di produrre emoglobina funzionante e
eritropoietina che regola la produzione di di globuli rossi nel midollo osseo.
•
Il principale inconveniente è relativo alla comparsa di reazioni immuni nei
confronti di queste proteine (glicosilazione e presenza di glucani)
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
20
vaccini
•
I vaccini ricombinanti sono stati prodotti clonando in una
cellula procariota o eucariota il gene del microrganismo che
codifica per la principale proteina immunogena cioè quella che
induce nell’ospite la produzione di anticorpi.
•
questi vaccini sono costituiti da subunità di una proteina del
microorganismo patogeno (vaccini a sub unità); nei vaccini
virali è una proteina del capside o dell’envelope, nei vaccini
batterici adesine o tossine modificate (anatossine).
• Dopo selezione del gene questo viene inserito in un apposito
vettore (clonaggio) per il suo trasferimento nel microorganismo
che produrrà in grande quantità la proteina immunogena poi
purificata e usata come vaccino.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
21
vaccini
•
La produzione di questi tipi di prodotto nei procarioti (E. coli) non sempre origina un prodotto
efficace in quanto questi organismi non sono in grado di apportare una serie di modificazioni post
traduzionali tipiche delle cellule eucariote
•
Per questo motivo vengono impiegate cellule eucariote come i lieviti che sono in grado di
apportare le modifiche volute quali ospiti di espressione in modo da vere il corretto pattern di
glicosilazione e altre modificazioni delle proteine da impiegare come vaccino.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
22
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
23
Vaccini contro l’epatite B
•
Il virus che causa l’epatite B oltre che essere causa di cirrosi epatica è in grado di causare cancro
al fegato è in effetti un agente cancerogeno
•
Attualmente il numero dei portatori cronici è di circa 300 milioni, molti portatori cronici possono
apparire in buona salute ma possono ugualmente trasmettere il virus a coloro con i quali vengono
in contatto, mantenendo così molto elevato il numero degli infetti che possono facilmente
sviluppare un cancro al fegato.
•
Il virus HBV contiene due antigeni associati al guscio proteico e un antigene di superficie (Hbc,
Hbe e HBsAg). L’antigene di superficie è detto anche antigene australia induce nel corso
dell’infezione la formazione di anticorpi protettivi, non solo costituisce il guscio del virus matura
ma è anche libero nel sangue sottoforma di strutture sferiche e filamentose.
•
L’antigene di superficie costituisce quindi la molecola di scelta per allestire un vaccino e infatti
prima dell’avvento dell’ ingegneria genetica le particelle di HBsAg
ottenute per
ultracentrifugazione dal sangue di un portatore sano.
•
Mediante ingegneria genetica il gene virale è stato clonato in un vettore Saccharomyces
cerevisiae.
•
ROSATO
e Farm non solo ma viene trattato con
24
L’ antigene prodotto presenta ANTONIO
un grado di
purezzaMed
elevatissimo,
02 garantiscono
2007 08
una serie di tecniche di separazione che ne
l’assoluta affidabilità
Vaccini contro l’epatite B
• L’ antigene prodotto presenta un grado di
purezza elevatissimo, non solo ma viene
trattato con una serie di tecniche di
separazione che ne garantiscono l’assoluta
affidabilità
(cromatografia,
ultrac.
e
frazionamento, purezza > 98%)
• Presenta tutte le caratteristiche della
proteina glicosilazione e modificazioni post
traduzionali, dopo la sua purificazione la
molecola è pronta a essere impiegata come
vaccino.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
25
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
26
Vaccini contro la meningite batterica
•
L’ hemophilus influenzae di tipo B era il
maggiore responsabile della meningite
batterica.
•
Oltre ai vaccini prodotti da sub unità vengono
allestiti altri tipi di vaccini
•
Negli anni ‘’80 (USA) era colpito da meningite
1 bambino su 200, il 25% di chi sopravviveva
presentava lesioni cerebrali permanenti.
•
•
Dopo l’introduzione del vaccino ricombinante
la malattia è scomparsa o ridotta del 90%.
E’ stato sviluppato in Italia (Chiron spa) un
vaccino contro la pertosse, il ceppo è stato
modificato geneticamente e produce una
tossina identica ma del tutto priva di tossicità
(Bordetella pertussis), la tossina pè prodotta su
larga scala e impiegata come vaccino.
•
Vaccini ricombinanti batteri o virus
modificati in modo da poter essere usati come
vaccini vivi ricombinanti
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
27
Vaccini vivi ricombinanti
•
Microorganismi eterologhi naturalmente non
patogeni o resi tali, poxvirus o batteri dei generi
Salmonella o Escherichia, dopo manipolazione
•
Microorganismi omologhi patogeni nei quali
sono stati modificati i geni che ne
fungono da vettori di geni esogeni, in grado cioè di
esprimere proteine immunogene di un agente
patogeno verso cui si vuole proteggere un
influenzano la virulenza o deleti il virus può
quindi stimolare una reazione immune
individuo.
senza però scatenare la malattia ad es. il
•
Ad esempio nuovi vaccini sono allestiti
virus erpetico dopo delezione del gene TK
incorporando nel genoma di pox virus non
patogeni dei geni appartenenti ai virus dell‘ HBV e
dell’ Herpes simplex , è stato dimostrato nel
che causa la neurovirulenza e dal batterio
del colera privato della capacità di produrre
coniglio in cui l’uso del Vaccinia virus ha indotto
immunizzazione per la presenza nel suo genoma di
la sua enterotossina.
geni corrispondenti ad antigeni appartenenti alle
specie di HBV ed Herpes.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
28
Il gene mutato
non è
patogeno
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
29
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
30
Vaccini commestibili
•
Sono vaccini prodotti in vegetali transgenici proteine immunogene sono state
introdotte nel genoma di piante come tabacco, pomodori, soia ( ad esempio alte
concentrazioni di proteine virali appartenenti al virus HBV. Da prove preliminari
sembra acquisito il concetto che l’ingestione di questi prodotti dia immunizzazione.
•
Vaccini prodotti da animali transgenici: capre transgeniche che producono latte
contenente le proteine del parassita responsabile della malaria da utilizzare per la
vaccinazione.
•
Più esattamente frammenti della proteina MSP-1, Principale proteina di superficie del
plasmodio, la ricerca tende a valutare gli effetti di questa operazione su animali da
esperimento (scimmie) prima di passare alla sperimentazione sull’uomo.
•
Ogni anno 500 milioni di persone contraggono la malattia e 3 milioni muoiono.
ANTONIO ROSATO Med e Farm
02 2007 08
31
