Sviluppo di un chip microfluidico per l`elettroporazione

Università degli Studi di Padova
D IPARTIMENTO DI F ISICA E A STRONOMIA
Corso di Laurea in Fisica
T ESI
DI
L AUREA
Sviluppo di un chip microfluidico
per l’elettroporazione capacitiva di cellule
Laureanda
Chiara Nardin
Matr. 1005023
Relatore
Prof. Giampaolo Mistura
Correlatori
Prof. Matteo Pierno
Prof. Stefano Vassanelli
Anno Accademico 2012-2013
Sommario
Il presente lavoro ha l’obiettivo di illustrare l’esperienza svolta presso i laboratori LaFSI,
Dipartimento di Fisica e Astronomia, e di NeuroChip, Dipartimento di Scienze Biomediche, dell’Università degli Studi di Padova per il conseguimento del titolo di Laurea in Fisica.
Nel primo capitolo si descrive in cosa consiste la tecnica dell’elettroporazione, qual è il
panorama dei processi di trasfezione cellulare in cui si inserisce e quali vantaggi e svantaggi
presenta rispetto a tecniche analoghe. Si illustra qual’è stata la storia della sua evoluzione
negli anni. Si approfondisce la procedura dell’elettroporazione in adesione, quella seguita
in questo lavoro di tesi. Infine si espongono i principi fisici che regolano il fenomeno di
elettroporazione e i modelli teorici che ne schematizzano il processo.
Nel secondo capitolo si espone il procedimento seguito per la fabbricazione dei dispositivi di elettroporazione e le procedure di sterilizzazione e di testing di questi ultimi. Si illustrano i materiali impiegati e i metodi sperimentali applicati per condurre
l’elettroporazione.
Nel terzo capitolo si presentano i risultati delle prove preliminari di elettroporazione,
eseguite al fine di testare la funzionalità del dispositivo costruito.
i
Indice
Elenco delle figure
iii
Introduzione
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1 Elettroporazione capacitiva
1.1 Elettroporazione in adesione e altre tecniche di trasfezione .
1.2 Breve storia dell’elettroporazione . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Principi fisici e modelli teorici . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1 Modello elettroporativo di Neumann . . . . . . . . .
1.3.2 Modellizzazione elettrica del sistema cellula-substrato
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2 Materiali e metodi
2.1 Dispositivo per l’elettroporazione capacitiva
2.1.1 Fabbricazione . . . . . . . . . . . .
2.1.2 Pulizia e test di tenuta . . . . . . .
2.2 Materiale biologico per l’elettroporazione . .
2.3 Strumentazione per l’elettroporazione . . .
2.4 Metodo di elettroporazione . . . . . . . . .
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3 Risultati e discussione
3.1 Prove di piastramento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Prove di elettroporazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Conclusioni
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A Potenziali transmembrana e corrente capacitiva nel modello TDS
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Bibliografia
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Introduzione
L’elettroporazione è un metodo fisico atto a permeabilizzare temporaneamente la membrana cellulare, applicandole brevi ed intensi impulsi elettrici, che causano la formazione
di pori transitori sulla superficie della cellula [1]. Tale tecnica rientra nei metodi di trasfezione cellulare sfruttati in campo medico e biotecnologico; con il termine “trasfezione”
ci si riferisce a un processo indotto artificialmente volto a introdurre nella cellula molecole biologiche, farmaci, anticorpi, ioni, DNA, che naturalmente non attraverserebbero la
membrana plasmatica.
Il meccanismo fisico della porazione non è stato ancora del tutto chiarito, soprattutto a
causa della difficoltà sperimentale che si incontra nel monitorare il fenomeno. Le dimensioni nanometriche dei pori (da confrontare con quelle della cellula, 1 ÷ 100 µm) sono infatti
stimate sperimentalmente in modo indiretto, attraverso le dimensioni delle macromolecole
che si riescono ad introdurre nella cellula [2].
Inizialmente sviluppata per il trasferimento genico intracellulare, l’elettroporazione è ora
utilizzata in campo medico, farmacologico, biotecnologico, per la trasfezione di una grande varietà di molecole. Se in principio essa causava considerevoli danni alle cellule, gli
sviluppi degli ultimi trent’anni hanno permesso un perfezionamento dell’equipaggiamento
e un’ottimizzazione del protocollo. La procedura si è dimostrata utile sia in vitro che in
vivo, ad esempio è stata eseguita su pazienti, per la cura di tumori maligni [3].
Il lavoro di tesi si inserisce in un progetto di fabbricazione di un dispositivo microfluidico per misure di elettroporazione capacitiva di cellule, dotato di canali di entrata e
uscita per i liquidi e di un elettrodo in silicio. A tal scopo, il primo passo consiste nella
realizzazione di un dispositivo preliminare, in cui è innestato solamente il chip in silicio,
attraverso il quale è possibile testare il materiale di costruzione, la geometria della cella, la
funzionalità come supporto per la stimolazione cellulare. Verificata l’adeguatezza del procedimento di fabbricazione e della geometria di questo dispositivo iniziale, testata la sua
efficienza attraverso l’esecuzione dell’elettroporazione, si può procedere con la costruzione
dello strumento definitivo, nel quale vengono fatti flussare i vari reagenti da trasfettare.
Nel seguito, dopo aver introdotto i principi fisici che stanno alla base dell’elettroporazione, si descrive l’attività svolta di fabbricazione del dispositivo preliminare, portata a
termine nei laboratori del Dipartimento di Fisica e Astronomia. La fase di testing come
dispositivo adatto all’elettroporazione si è compiuta invece nei laboratori del Dipartimento
di Scienze Biomediche; si illustrano dunque i materiali utilizzati e i metodi seguiti nelle
prove di piastramento delle cellule sul chip e di elettroporazione. Si riportano infine i
risultati di tali prove e le valutazioni compiute in merito.
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