Verifiche qualitative dell’RNA e cDNA in
ambito dei trials “BCR/ABL e AML
translocation programme”
Massimo Degan, CRO Aviano (PN)
Verifiche qualitative dell’RNA
…perchè è importante verificare l’RNA…
• La verifica della qualità dell’RNA nei saggi
diagnostico-molecolari viene fatta allo scopo di
evidenziare un’eventuale degradazione del
campione che può compromettere le successive
reazioni di retro-trascrizione e amplificazione del
target.
• Le procedure di verifica dell’RNA e cDNA
permettono di evitare il problema dei falsi negativi.
• Verifica della presenza di DNA contaminante.
• Non è sufficiente considerare il parametro relativo
al rapporto 260/280 nella lettura spettrofotometrica
dell’RNA per stabilirne la qualità.
Verifiche qualitative dell’RNA
…perchè è importante verificare l’RNA…
Il successo delle applicazioni successive
all’estrazione dell’RNA (RT-PCR, microarrays,
etc) dipende da 3 fattori:
QUANTITA’
PUREZZA
INTEGRITA’
RNases
QUALITA’
Verifiche qualitative dell’RNA
…perchè è importante verificare l’RNA…
QUANTITA’
• Lettura Spettrofotometrica
• Lettura Fluorimetrica
Verifiche qualitative dell’RNA
…perchè è importante verificare l’RNA…
QUANTITA’
• Lettura Spettrofotometrica
• Lettura Fluorimetrica
Verifiche qualitative dell’RNA
QUANTITA’
Lettura Spettrofotometrica (tradizionale)
• 260 nm DNA, RNA
• 280 nm contaminanti proteici
260/280 range 1.8-2.2
• 230 nm altri contaminanti
(es. guanidine thiocyanate)
260/230 >1.7
Limitazioni
• Diluizione del campione (la lettura avviene in cuvette)
Lettura tramite Nanodrop (Thermo Scientific)
• Nessuna diluizione del campione
• 0.5-2 ul di campione, range di conc: 2 ng-12 ug
NanoDrop® spectrophotometer data of RNA
with various contaminants.
A. Pure RNA sample.
B. RNA sample with 0.01% (v/v)
guanidine thiocyanate
C. RNA with 5% ethanol (EtOH)
contamination
D. RNA with 5% isopropanol (IPA)
contamination
Verifiche qualitative dell’RNA
Lettura Spettrofotometrica
Limitazioni
•Mancanza di specificità nella lettura dell’RNA.
•Non è in grado di stabilire la purezza del campione.
Il metodo non è in grado di distinguere la presenza di DNA
genomico contaminante.
•La presenza di DNA genomico contaminante contribuisce alla
sovrastima della concentrazione del campione.
•Non è in grado di verificare l’integrità del campione in quanto i
singoli nucleotidi sono in grado di contribuire alla lettura a 260
nm.
Verifiche qualitative dell’RNA
…perchè è importante verificare l’RNA…
QUANTITA’
• Lettura Spettrofotometrica
• Lettura Fluorimetrica
Verifiche qualitative dell’RNA
QUANTITA’
Lettura Fluorimetrica
•Utilizzo di dye fluorescenti che legano gli ac. nucleici, il
cambiamento dello stato conformazionale conseguente, risulta
in un aumento della fluorescenza alla specifica lunghezza d’onda
del fluoroforo.
•L’utilizzo di una curva di calibrazione o di un reference a
concentrazione nota rende possibile la quantizzazione del
campione.
• Sensibilità molto elevata (1 pg/ul – 2.5 ng)
Limitazioni
• Stesse limitazioni della lettura spettrofotometrica.
QuantiFluor™ RNA Dye standard curves
.
A.
high-concentration RNA
standard curve using the
QuantiFluor™ RNA Dye.
B.
low-concentration RNA
standard curve using the
QuantiFluor™ RNA Dye.
Linear range is 0.1–10ng
of RNA in a 200µl assay.
Verifiche qualitative dell’RNA
QUALITA’
PUREZZA
INTEGRITA’
Metodi
•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni
denaturanti
• 2100 Bioanalyzer (Agilent)
Verifiche qualitative dell’RNA
QUALITA’
INTEGRITA’
PUREZZA
Metodi
•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni
denaturanti
• 2100 Bioanalyzer (Agilent)
Verifiche qualitative dell’RNA
Elettroforesi con gel di agarosio
•Metodo economico che permette la verifica dell’integrità
dell’RNA tramite corsa elettroforetica in condizioni
denaturanti (formaldeide / formamide) in presenza di
bromuro di etidio.
•Può essere determinata anche la concentrazione dell’RNA
se si dispone di software di analisi dell’immagine e di uno
STD a quantità note (densitometria).
•Nei mammiferi si osservano 2 bande predominanti di rRNA:
28S e 18S. Il rapporto 2:1 è indicatore di buona qualità
dell’RNA.
Verifiche qualitative dell’RNA
Intact High Quality RNA Characterized by:
Two prominent rRNA Bands (28S e 18S)
Slight smear of various sized mRNA molecules in
background
Verifiche qualitative dell’RNA
Elettroforesi con gel di agarosio
Limitazioni
•L’analisi elettroforetica richiede quantità significative di
RNA (~ 1 ug).
•Il metodo non permette di determinare se il campione
contiene degli inibitori che potrebbero inficiare le reazioni
successive di reverse transcriptase e PCR.
•Esposizione di agenti tossici da parte dell’operatore
nell’allestimento dell’elettroforesi in condizioni denaturanti.
Verifiche qualitative dell’RNA
QUALITA’
PUREZZA
INTEGRITA’
Metodi
•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni
denaturanti
• 2100 Bioanalyzer (Agilent)
Verifiche qualitative dell’RNA
2100 AGILENT Bioanalyzer
•Miglior metodo esistente nel mercato, sfrutta il principio
dell’elettroforesi capillare permettendo la verifica dell’integrità
dell’RNA tramite chips. In pratica il campione combinato con un
fluorescente, viene iniettato nel pozzetto del chip e attraverso una
matrice di poliacrilammide presente nei microchannels viene
separato elettroforeticamente in base al peso molecolare.
•1 ul di campione di RNA (~ 25 ng; 12 samples / chip), rilevato
tramite fluorescenza
•RNA 6000 Nano kit: 25 a 500 ng/µL di RNA
•RNA 6000 Pico Kit: 50 pg/µL a 5000 pg/µL di RNA
Verifiche qualitative dell’RNA
2100 Bioanalyzer
•L’algoritmo RIN (RNA Integrity number) è un’indice
qualitativo dell’RNA che il software di analisi attribuisce al
campione biologico in esame.
•RIN: range 0-10.
RIN = 0
RNA completamente
degradato;
RIN = 10
RNA eccellente.
Analisi qualitativa tramite 2100 Bioanalyzer
High integrity RNA
Low integrity RNA
Very low integrity RNA
Routine Diagnostica in OECS (CRO)
Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA
• Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop
• Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioanalyzer
• Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M
Verifica cDNA con B2M
B2M =800 bp
Comp =600 bp
Competitive RT- PCR
Principio
Un competitore interno di
dimensione differente rispetto
all’amplicone specifico di B2M
preparato da un frammento di
DNA eterologo e ingegnerizzato in
modo da contenere la stessa
sequenza dei primers della B2M,
viene amplificato in presenza del
campione che deve essere
quantizzato.
Dal momento che è nota la
quantità di competitore aggiunto
nel mix di reazione, è possibile
determinare la quantità in termini
di cDNA del campione ignoto.
Routine Diagnostica in OECS (CRO)
Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA
• Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop
• Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioanalyzer
• Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M
• Multiplex PCR con primers di B-actin e primers BCR/ABL
I°R p210
B-ACT
B3A2
Verifica cDNA con B2M
B2M =800 bp
Comp =600 bp
UK NEQAS
BCR/ABL and AML
Translocation Programme
Foglio di accompagnamento
campioni (attuale)
Il campione liofilizzato viene
risospeso con 1 ml di H2O
RNAse free.
Verifiche qualitativa del cDNA
UK NEQAS
BCR/ABL and AML Translocation Programme
Campione 122
I°R p210
Analisi Elettroforetica
I°R p190
I°R p230
UK NEQAS
BCR/ABL and AML Translocation Programme
CONCLUSIONI
• Negli esercizi UK NEQAS che prevedono RNA come
materiale di partenza, è preferibile addizionare
direttamente TRIzol al campione liofilizzato, al posto
dell’H2O.
• RNA è facilmente degradabile ed è preferibile mantenerlo
nelle condizioni di maggior stabilità (TRIzol).
• L’utilizzo di H2O nella risospensione del campione
liofilizzato deve essere di assoluta qualità in termini di
RNAse free.
