degan 2013
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Verifiche qualitative dell’RNA e cDNA in ambito dei trials “BCR/ABL e AML translocation programme” Massimo Degan, CRO Aviano (PN) Verifiche qualitative dell’RNA …perchè è importante verificare l’RNA… • La verifica della qualità dell’RNA nei saggi diagnostico-molecolari viene fatta allo scopo di evidenziare un’eventuale degradazione del campione che può compromettere le successive reazioni di retro-trascrizione e amplificazione del target. • Le procedure di verifica dell’RNA e cDNA permettono di evitare il problema dei falsi negativi. • Verifica della presenza di DNA contaminante. • Non è sufficiente considerare il parametro relativo al rapporto 260/280 nella lettura spettrofotometrica dell’RNA per stabilirne la qualità. Verifiche qualitative dell’RNA …perchè è importante verificare l’RNA… Il successo delle applicazioni successive all’estrazione dell’RNA (RT-PCR, microarrays, etc) dipende da 3 fattori: QUANTITA’ PUREZZA INTEGRITA’ RNases QUALITA’ Verifiche qualitative dell’RNA …perchè è importante verificare l’RNA… QUANTITA’ • Lettura Spettrofotometrica • Lettura Fluorimetrica Verifiche qualitative dell’RNA …perchè è importante verificare l’RNA… QUANTITA’ • Lettura Spettrofotometrica • Lettura Fluorimetrica Verifiche qualitative dell’RNA QUANTITA’ Lettura Spettrofotometrica (tradizionale) • 260 nm DNA, RNA • 280 nm contaminanti proteici 260/280 range 1.8-2.2 • 230 nm altri contaminanti (es. guanidine thiocyanate) 260/230 >1.7 Limitazioni • Diluizione del campione (la lettura avviene in cuvette) Lettura tramite Nanodrop (Thermo Scientific) • Nessuna diluizione del campione • 0.5-2 ul di campione, range di conc: 2 ng-12 ug NanoDrop® spectrophotometer data of RNA with various contaminants. A. Pure RNA sample. B. RNA sample with 0.01% (v/v) guanidine thiocyanate C. RNA with 5% ethanol (EtOH) contamination D. RNA with 5% isopropanol (IPA) contamination Verifiche qualitative dell’RNA Lettura Spettrofotometrica Limitazioni •Mancanza di specificità nella lettura dell’RNA. •Non è in grado di stabilire la purezza del campione. Il metodo non è in grado di distinguere la presenza di DNA genomico contaminante. •La presenza di DNA genomico contaminante contribuisce alla sovrastima della concentrazione del campione. •Non è in grado di verificare l’integrità del campione in quanto i singoli nucleotidi sono in grado di contribuire alla lettura a 260 nm. Verifiche qualitative dell’RNA …perchè è importante verificare l’RNA… QUANTITA’ • Lettura Spettrofotometrica • Lettura Fluorimetrica Verifiche qualitative dell’RNA QUANTITA’ Lettura Fluorimetrica •Utilizzo di dye fluorescenti che legano gli ac. nucleici, il cambiamento dello stato conformazionale conseguente, risulta in un aumento della fluorescenza alla specifica lunghezza d’onda del fluoroforo. •L’utilizzo di una curva di calibrazione o di un reference a concentrazione nota rende possibile la quantizzazione del campione. • Sensibilità molto elevata (1 pg/ul – 2.5 ng) Limitazioni • Stesse limitazioni della lettura spettrofotometrica. QuantiFluor™ RNA Dye standard curves . A. high-concentration RNA standard curve using the QuantiFluor™ RNA Dye. B. low-concentration RNA standard curve using the QuantiFluor™ RNA Dye. Linear range is 0.1–10ng of RNA in a 200µl assay. Verifiche qualitative dell’RNA QUALITA’ PUREZZA INTEGRITA’ Metodi •Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti • 2100 Bioanalyzer (Agilent) Verifiche qualitative dell’RNA QUALITA’ INTEGRITA’ PUREZZA Metodi •Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti • 2100 Bioanalyzer (Agilent) Verifiche qualitative dell’RNA Elettroforesi con gel di agarosio •Metodo economico che permette la verifica dell’integrità dell’RNA tramite corsa elettroforetica in condizioni denaturanti (formaldeide / formamide) in presenza di bromuro di etidio. •Può essere determinata anche la concentrazione dell’RNA se si dispone di software di analisi dell’immagine e di uno STD a quantità note (densitometria). •Nei mammiferi si osservano 2 bande predominanti di rRNA: 28S e 18S. Il rapporto 2:1 è indicatore di buona qualità dell’RNA. Verifiche qualitative dell’RNA Intact High Quality RNA Characterized by: Two prominent rRNA Bands (28S e 18S) Slight smear of various sized mRNA molecules in background Verifiche qualitative dell’RNA Elettroforesi con gel di agarosio Limitazioni •L’analisi elettroforetica richiede quantità significative di RNA (~ 1 ug). •Il metodo non permette di determinare se il campione contiene degli inibitori che potrebbero inficiare le reazioni successive di reverse transcriptase e PCR. •Esposizione di agenti tossici da parte dell’operatore nell’allestimento dell’elettroforesi in condizioni denaturanti. Verifiche qualitative dell’RNA QUALITA’ PUREZZA INTEGRITA’ Metodi •Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti • 2100 Bioanalyzer (Agilent) Verifiche qualitative dell’RNA 2100 AGILENT Bioanalyzer •Miglior metodo esistente nel mercato, sfrutta il principio dell’elettroforesi capillare permettendo la verifica dell’integrità dell’RNA tramite chips. In pratica il campione combinato con un fluorescente, viene iniettato nel pozzetto del chip e attraverso una matrice di poliacrilammide presente nei microchannels viene separato elettroforeticamente in base al peso molecolare. •1 ul di campione di RNA (~ 25 ng; 12 samples / chip), rilevato tramite fluorescenza •RNA 6000 Nano kit: 25 a 500 ng/µL di RNA •RNA 6000 Pico Kit: 50 pg/µL a 5000 pg/µL di RNA Verifiche qualitative dell’RNA 2100 Bioanalyzer •L’algoritmo RIN (RNA Integrity number) è un’indice qualitativo dell’RNA che il software di analisi attribuisce al campione biologico in esame. •RIN: range 0-10. RIN = 0 RNA completamente degradato; RIN = 10 RNA eccellente. Analisi qualitativa tramite 2100 Bioanalyzer High integrity RNA Low integrity RNA Very low integrity RNA Routine Diagnostica in OECS (CRO) Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA • Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop • Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioanalyzer • Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M Verifica cDNA con B2M B2M =800 bp Comp =600 bp Competitive RT- PCR Principio Un competitore interno di dimensione differente rispetto all’amplicone specifico di B2M preparato da un frammento di DNA eterologo e ingegnerizzato in modo da contenere la stessa sequenza dei primers della B2M, viene amplificato in presenza del campione che deve essere quantizzato. Dal momento che è nota la quantità di competitore aggiunto nel mix di reazione, è possibile determinare la quantità in termini di cDNA del campione ignoto. Routine Diagnostica in OECS (CRO) Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA • Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop • Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioanalyzer • Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M • Multiplex PCR con primers di B-actin e primers BCR/ABL I°R p210 B-ACT B3A2 Verifica cDNA con B2M B2M =800 bp Comp =600 bp UK NEQAS BCR/ABL and AML Translocation Programme Foglio di accompagnamento campioni (attuale) Il campione liofilizzato viene risospeso con 1 ml di H2O RNAse free. Verifiche qualitativa del cDNA UK NEQAS BCR/ABL and AML Translocation Programme Campione 122 I°R p210 Analisi Elettroforetica I°R p190 I°R p230 UK NEQAS BCR/ABL and AML Translocation Programme CONCLUSIONI • Negli esercizi UK NEQAS che prevedono RNA come materiale di partenza, è preferibile addizionare direttamente TRIzol al campione liofilizzato, al posto dell’H2O. • RNA è facilmente degradabile ed è preferibile mantenerlo nelle condizioni di maggior stabilità (TRIzol). • L’utilizzo di H2O nella risospensione del campione liofilizzato deve essere di assoluta qualità in termini di RNAse free.
