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Rintracciabilità degli alimenti di origine animale Il tema della rintracciabilità nasce nel 1992, in seguito allo scandalo BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy), una malattia del gruppo delle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE), causata da un agente infettivo definito “prione”, che genera lesioni degenerative conferenti al tessuto nervoso un aspetto spongioso (spongiforme: comparsa di vacuoli a livello dei neuroni). Normale Patologico BSE in Europa • • • • • • • • • • Regno Unito Germania Belgio Danimarca Spagna Francia Irlanda Italia Lussemburgo Portogallo 2000 1312 7 9 1 2 162 152 0 0 2 2001 0 7 0 1 3 6 0 11 0 1 La crisi della BSE ha determinato un’accelerazione e una puntualizzazione della Prof. Luigi Ramunno disciplina della rintracciabilità. L’interesse della collettività verso la sicurezza alimentare deriva anche dall’impatto complessivo generato da altre fonti di rischio come ad esempio i prodotti OGM. Prof. Luigi Ramunno “…la possibilità di ricostruire e seguire il percorso di un alimento, di un mangime, di un animale destinato alla produzione alimentare o di una sostanza destinata o atta ad entrare a far parte di un alimento o di un mangime attraverso tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione…” Art. 18 Reg. CE 178/2002 Prof. Luigi Ramunno In tempi diversi (prima e dopo la crisi BSE) anche per altri alimenti è stata prevista la tracciabilità: Grassi (Reg. CE 20.7.1998 n° 1638), Uova (Reg. CE 14.8.2001 n° 1651), Uva e sua trasformazione in vino (D.M. 29.5.2001), Olio di oliva (Reg. CE 13.6.2002 n° 1019), Tabacco e latte fresco (D.M. 27.6.2002). Prof. Luigi Ramunno Qualità e sicurezza alimentare LE ETICHETTE, STRUMENTO DI TRASPARENZA E INFORMAZIONE “...l’insieme delle menzioni, delle indicazioni, dei marchi di fabbrica o di commercio, delle immagini o dei simboli che si riferiscono al prodotto alimentare e che figurano direttamente sull’imballaggio o su un’etichetta appostavi o sul dispositivo di chiusura o su cartelli o su anelli o fascette legate al prodotto medesimo...” Dlg. 109 del 1992; Dlg. 101 del 2003 Prof. Luigi Ramunno Rintracciabilità dei prodotti alimentari Procedure Analitiche Analisi Morfologica dei tessuti Può essere utilizzata solo sui prodotti i cui tessuti non hanno subito modifiche in seguito a cottura o trattamenti meccanici, quali macinazione. Analisi delle proteine Trovano applicazione solo sui prodotti non sottoposti a trattamenti termici intensi dal momento che le proteine subiscono processi degradativi durante la cottura. Prof. Luigi Ramunno Ogni soggetto ha una sua “Impronta Digitale” 1. Il DNA è facilmente reperibile 2. Elevata sensibilità 3. Stabilità delle molecole di DNA Prof. Luigi Ramunno Rintracciabilità del latte di bufala Prof. Luigi Ramunno DPCM 10 maggio 1993 GU n. 219 del 17 settembre 1993 Art. 3 - La "Mozzarella di bufala Campana DOP" è prodotta esclusivamente con latte di bufala intero, proveniente da bufale allevate in… …il latte deve essere consegnato al caseificio entro la sedicesima ora dalla mungitura… Prof. Luigi Ramunno Mozzarella di Bufala Campana Un po di statistica… 40 35 30 25 20 15 10 5 0 35 40 36,7 38,3 35 E’ un mercato in forte espansione con un incremento della produzione del 33 % nel periodo 20002005 30 200 0 200 1 200 2 200 3 200 4 200 5 300 Produzione in Milioni di Kg 280 280 258,2 270 270 250 200 206,5 150 Nello stesso periodo il volume di affari è aumentato di circa 75 milioni di euro 100 50 0 200 Prof. Luigi Ramunno 0 200 1 200 2 200 3 200 4 Fatturato in Milioni di Euro 200 5 L‘ area di consumo coincide in prevalenza con l'area di produzione. Gran parte dei prodotti viene assorbito dai mercati campani e laziali. Dove però si concentrano anche il maggior numero di frodi. Mozzarelle in confezioni senza sigillo possono essere facilmente sostituite con mozzarelle non DOP Prof. Luigi Ramunno Mozzarelle vendute al banco senza confezione possono essere facilmente sostituite con mozzarelle non DOP Attività Ispettiva N.A.S. Consorzio di Tutela Ispettorato Centrale Repressioni Frodi La Mozzarella di Bufala Campana DOP è stato nel 2003 il formaggio DOP più controllato in assoluto Prof. Luigi Ramunno Attività Ispettiva N.A.S. Consorzio di Tutela Ispettorato Centrale Repressioni Frodi Attività ispettiva del Consorzio di Tutela al 29 dicembre 2006: ● 306 analizzati e circa il 10% hanno riscontrato la presenza di latte non bufalino ● 11 sequestri convalidati relativi a 13 procedimenti per uso irregolare del marchio DOP ● 130 ispezioni presso locali commerciali sull’intero territorio nazionale ● 6 interventi aggiuntivi, in collaborazione con Istituto Centrale Repressione Frodi e con il contributo delle ASL. Al 29 dicembre 2006 i caseifici DOP risultano essere 132 Prof. Luigi Ramunno La frode più comune è la sofisticazione per aggiunta di latte di altre specie Bovino Ovino Caprino Composizione Chimica del latte di varie specie Costituente Bufalo Bovino Capra Pecora Acqua g. 82.6 88.5 89 83.5 Proteine g. 4.5 3.2 3.1 5.4 Grassi g. 8.0 3.5 3.5 6.0 Lattosio g. 4.9 4.8 4.4 5.1 Energia Kcal 110 66 60 95 Saturi g. 4.2 2.4 2.3 3.8 Insaturi g. 1.9 1.2 0.9 1.8 Colesterolo mg. 8.0 14.0 10.0 11.0 Ac. Grassi Prof. Luigi Ramunno Resa alla trasformazione Bovino Bufalo Capra Pecora Composizione Chimica del latte di varie specie Costituente Bufalo Bovino Capra Pecora Acqua g. 82.6 88.5 89 83.5 Proteine g. 4.5 3.2 3.1 5.4 Grassi g. 8.0 3.5 3.5 6.0 Lattosio g. 4.9 4.8 4.4 5.1 Energia Kcal 110 66 60 95 Saturi g. 4.2 2.4 2.3 3.8 Insaturi g. 1.9 1.2 0.9 1.8 Colesterolo mg. 8.0 14.0 10.0 11.0 % ~24.6 ~13.0 ~12.5 ~23.0 Ac. Grassi Resa Marcatore molecolare Specifico e Monomorfo all’interno della specie Bovina Bufalina Ovina Caprina Sequenza SINE al 5’ del gene che codifica per l’α-lattalbumina (Isaac et al., 2001). Prof. Luigi Ramunno Sequenza SINE al 5’ del gene che codifica per l’α-lattalbumina Pecora 746 bp Bovino delezione di ~180bp Bufalo delezione di ~170bp Capra delezione di ~110bp Prof. Luigi Ramunno BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 1 1 1 1 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 61 61 61 61 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 121 121 121 121 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 181 181 181 181 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 241 241 241 241 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 301 301 301 301 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 361 361 361 361 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 421 421 421 421 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 481 481 481 481 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 541 541 541 541 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 601 601 601 601 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 661 661 661 661 BOVINO.TXT BUFALO.TXT CAPRA.TXT PECORA.TXT 721 721 721 721 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 GCTCAGGTTC AGAATCTTGT TTTATAGGCT CTAGGTGTAT ATTGTGGGGC TTCCCTGGTG 60 70 80 90 100 110 120 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 120 ATCCAGGTAG ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 120 ATCCAGGTAG CTGCATTCAG TCATGGCAAT GACCAAACTG CGGGTCTCAG CCAATCGACT 120 ATCCAGGTAG CTGCATTCAG TCATGGCAAT GACCAAACTG CGGGTCTCAG CCAATCGACT 120 130 140 150 160 170 180 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 180 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 180 ACACGTCA-- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 180 ACACGTCAAG ATGTCATTTA AACAGTCAGT ACAGTGACTG GACAAAATAG ATCACAAAAT 180 190 200 210 220 230 240 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----GCTCAG 240 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----GCTCAG 240 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----GCTCAG 240 GCATGACAAT GCGTGGGCAT CCATGTTTGC ATGACATACA GATAGGCCCA GTAAGCTCAG 240 250 260 270 280 290 300 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 ATGGTAAAGT GTCTGCCTGC AATGTGGGTG ATCTGGGTTC GATCCCTGGC TTGGGAAGAT 300 310 320 330 340 350 360 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 CCCCTGGAGA AGGAAATGGC AACCCACTCT AGTACTCTTA CCTGGAAAAT TCCATGGACA 360 370 380 390 400 410 420 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 GAGGAGCCTT GTAAGCTACA GTCCATGGGA TTGCAAAGAG TTGAACACAA CTGAGCAACT 420 430 440 450 460 470 480 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 AAGCACAGCA CAGTACAGTA TACACCTGTG AGGTGAAGTG AAGTGAAGGT TCAATGCAGG 480 490 500 510 520 530 540 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 GTCTCCTGCA TTGCAGAAAG ATTCTTTACC ATCTGAGCCA CCAGGGAAGC CCAAGAATAC 540 550 560 570 580 590 600 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 TGGAGTGGGT AGCCTATTCC TTCTCCAGGG GATCTTCCCA TCCCAGGAAT TGAACTGGAG 600 610 620 630 640 650 660 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 TCTCCTGCAT TTCAGGTGGA TTCTTCACCA GCTGAACTAC CAGGTGGATA CTACTCCAAT 660 670 680 690 700 710 720 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 ATTAAAGTGC TTAAAGTCCA GTTTTCCCAC CTTTCCCAAA AAGGTTGGGT CACTCTTTTT 720 730 740 750 760 770 780 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG...... .......... .......... .......... 780 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG...... .......... .......... .......... 780 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG...... .......... .......... .......... 780 TAACCTTCTG TGGCCTACTC TGAG...... .......... .......... .......... 780 •Denaturazione (94-95°C) Separazione completa dei due filamenti del DNA Annealing •appaiamento di primers al DNA (la temperatura varia Estensione Polimerizzazione della Taq polimerasi Prof. Luigi Ramunno Sequenza SINE al 5’ del gene che codifica per l’α-lattalbumina a-la F 570 bp 5’ Bovino a-la F 3’ 580 bp a-la F Btu63109R 3’ 5’ Bufalo Btu63109R 638 bp 5’ Btu63109R 3’ Capra a-la F Pecora Prof. Luigi Ramunno 5’ 746 bp Btu63109R 3’ 1) Bovino 570 bp 2) Bufalo 580 bp 3) Caprino 638 bp 4) Ovino 746 bp 5) Mix bovino/ bufalo 6) Mix caprino/ovino 7) Mix totale 600 bp 700 bp 1000 bp M Prof. Luigi Ramunno 1 2 3 4 5 6 7 Tecniche di biologia molecolare applicate all’analisi della variabilità genetica Cronologia dello sviluppo delle Biotecnologie Molecolari 1865 Mendel presenta i suoi esperimenti di ibridazione 1944 Si dimostra che il DNA è materiale genetico 1953 Watson e Crick determinano la struttura del DNA 1973 Boyer e Cohen fondano la tecnologia del DNA ricombinante 1975 Sviluppo di tecniche per analizzare e sequenziare il DNA 1978 Genentech produce insulina umana ricombinante in E.coli 1982 Il primo farmaco GM: l’insulina 1982Primo vaccino animale prodotto con tecnologie ricombinanti (epatite B) introdotto i 1983 Sviluppo di un vettore per le piante 1983 La prima pianta transgenica: il tabacco 1985 Reazione a catena della polimerasi (PCR) Com’era l’analisi genetica prima della PCR? • Il sequenziamento del DNA (1975) richiedeva che i geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago l) • Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni e delezioni) • La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato Southern blotting Preparazione dei campioni prima della corsa elettroforetica Nel Southern blot il DNA (sia genomico che plasmidico) viene digerito con enzimi di restrizione. Southern Blotting (DNA) L’invenzione della PCR • Ideata da Kary Mullis nel 1983 • La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 • Premio Nobel per la chimica nel 1995 • Serve per ottenere una grande quantità di una specifica sequenza di acido nucleico in vitro • Può amplificare un tratto di acido nucleico per più di 1 milione di volte • L’acido nucleico diviene più facile da manipolare e viene utilizzato in tutti gli esperimenti di Biologia molecolare DNA Estrazione del DNA o RNA dal campione trascrizion e inversa RNA Amplificazion e DNA Elettroforesi •Composizione di una reazione di PCR – DNA O RNA – Primer (18-25 nt di lunghezza) – dNTP (desossinucleotidi trifosfati) – Buffer di reazione (tampone) – MgCl 2 – Taq Polimerasi Primer ASSUMONO UN DOPPIO RUOLO FUNZIONANO DA SONDA, CERCANDO LUNGO IL GENOMA LA SEQUENZA SPECIFICA A CUI LEGARSI RICONOSCIUTA LA REGIONE AGISCONO DA INNESCO Disegnati mediante un software, utilizzando come stampo le sequenze relative al gene depositate in EMBL. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Strumento per ottenere molte copie di una sequenza di DNA La reazione di amplificazione avviene ad opera di un enzima, la DNA polimerasi, e di sonde (primer) Il processo di amplificazione avviene in tre fasi o ciclo: 1) Denaturazione del DNA ad una temperatura di circa 94 °C 2) Ibridazione del primer ad una temp. da 45 a 65 °C 3) Estensione del nuovo frammento ad una temp. di circa 72 °C Tale ciclo si ripete n volte. La reazione viene effettuata in un termostato programmabile I prodotti possono essere visualizzati su un gel d’agarosio Separazione di macromolecole per mezzo di elettroforesi sul gel Analisi quantitativa attraverso l’uso di Real-time PCR E’ una tecnica, basata sull’impiego di molecole fluorescenti (SYBR Green, FAM, TAMRA, ecc…), che consentono di monitorare la reazione di amplificazione ciclo dopo ciclo. L’emissione di fluorescenza è direttamente correlato alla quantità di DNA amplificato, ciò permette di avere corrette quantificazioni dei prodotti di partenza Prof. Luigi Ramunno TaqManTM probe l R Q Integra non emette fluorescenza Distrutta è libera di emettere fluorescenza Prof. Luigi Ramunno TM TaqMan Taq Denaturazione l Q R Q R 5’ 3’ Annealing 3’ Estensione R Q R Taq 5’ R Q Taq 1. Taglio della sonda 5’ 5’ 3’ Taq R 2. Polimerizzazione Completa 5’ 5’ 3’ l Taq R 5’ 5’ 3’ 3. Fluorescence Detection L’ammontare di DNA amplificato è correlato all’ammontare iniziale di DNA target: QF = QI (1 + ) (n-1) dove: QF = Quantità finale di DNA amplificato QI = Quantità di DNA target prima della PCR = Efficienza di Amplificazione (tra 0 e 1) n = numero di cicli Prof. Luigi Ramunno Qual’è la realtà Curva di Amplificazione PCR L’efficienza non è 100% Una fase lineare segue quella esponenziale Possibilità di plateaus Il plateau non è correlato all’iniziale quantità di target DNA Theoretical Log Target DNA Real Life Cycles Prof. Luigi Ramunno = efficienza QF = QI (1 + ) (n-1) 96 Repliche di una identica reazione danno diverse quantità finali di prodotti di PCR Quale è la fase migliore per avere esatte informazioni di quantificazione? L’inizio della fase esponenziale Il ciclo soglia (Ct) è il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione si porta al di sopra del valore di soglia. Il ciclo soglia, Ct, di 96 repliche dello stesso campione mostra valori identici Durante la fase esponenziale: -Nessun fattore è limitante -I prodotti di amplificazione si accumulano in modo costante Prof. Luigi Ramunno Il ciclo soglia (Ct) Correlato fortemente con l’ammontare iniziale di DNA target Se la concentrazione [C] di template è doppia, il Ct si raggiungerà un ciclo prima Se la concentrazione [C] di template è la metà, il Ct si raggiungerà un ciclo dopo Qual è il Il meno [C]? più [C]? Applicazione dell’analisi quantitativa alla specie suina Prof. Luigi Ramunno Marcatore molecolare: 17° ESONE CSN1S1 SUINO OVINO CAPRINO BOVINO BUFALO 1 1 1 1 1 SUINO OVINO CAPRINO BOVINO BUFALO 51 51 51 51 51 SUINO OVINO CAPRINO BOVINO BUFALO 101 101 101 101 101 SUINO OVINO CAPRINO BOVINO BUFALO 151 151 151 151 151 SUINO OVINO CAPRINO BOVINO BUFALO 201 201 201 201 201 TCTATTTTGA ------------------------------------60 GCTACCTGGT GGTGCCTGGT GGTGCCTGGT GGTGCCTGGT GGTGCCTGGT 110 ATTCACCAAC ATTCTCTGAC ATTCTCTGAC ATTCTCTGAC ATTCTCTGAC GCCTCTCCAC GCTTTTCAGA GCTTTTCAGA GCTTTTCAGA GCTTTTCAGA 70 ATTATCCTCC ATTACCTTCC ACTACCTTCC ATTACGTTCC ATTACGTTCC 120 ATCCCTCAAC ATCCCTAATC ATCCCTAATC ATCCCTAATC ATCCCTAATC CAGTTCTACC CAATTCTACC CAATTCTACC CAATTCTACC CAATTCTACC 80 AC-------ACTAGGCACA ACTAGGCACA ACTAGGCACA ACTAGGCACG 130 CCACTGCCCC CCATTGGCTC CCATTGGCTC CTATTGGCTC CCATCGGCTC AGCTTGATGC AGCTGGACGC AGCTGGACGC AGCTGGATGC AGCTGGATGC 90 -AATATATTG CAATACACTG CAATACACTG CAATACACTG CAATACCCTG 140 TGAGAAGGGT TGAGAACAGT TGAGAACAGT TGAGAACAGT TGAGAACAGT CTATCCCTAT CTATCCATCT CTATCCATCT CTATCCATCT CTATCCATCT 100 CTCACCCATT ATGCCCCCTC ATGCCCCCTC ATGCCCCATC ATGCCCCATC 150 GGAAAAACTG GGAAAGATTGGAAAGACTGAAAAGACTGGAAAGACT- AGATTATGCC --ACTATGCC --ACTATGCC --ACTATGCC --ACTATGCC 210 ATTATGGCCT ATTATGGTCT ATTATGGTCT GTTATGGTCT ATTATGGTCT l TCAGTGGTGA ACTGTGGTGA ACTGTGGTGA ACTGTGGTGA ACTGTGGTGA 220 TTG....... TTG....... TTG....... TTG....... TTG....... R AGAATTAAGT AGAGTCAAGT AGAGTCAAGT GGAGTCAAGT AGAGTCAAGT 230 .......... .......... .......... .......... .......... GAATTCTCAG GAATTCTGAG GAATTCTGAG GAATTCTGAG GAATTCTGAG 240 .......... .......... .......... .......... .......... Q GAACTCCACA GAACTCCACA GAACTCCACA GGACTCCACA GGACTCCACA 250 .......... .......... .......... .......... .......... 5’ l 1) campione individuale 2) campione individuale 3) campione individuale R 4) campione individuale 5) campione individuale 1 2 3 4 5 3’ di DNA suino di DNA ovino di DNA caprino di DNA bovinoQ di DNA bufalino 50 50 50 50 50 100 100 100 100 100 150 150 150 150 150 200 200 200 200 200 250 250 250 250 250 100 ng 10 ng 1 ng 0.1 ng 0.01 ng Log Starting Quantity Starting Quantity Threshold Cycle (medio) 2 100 ng 20.66 1 10 ng 24.79 0 1 ng 27.13 -1 0.1 ng 29.95 -2 0.01 ng 32.09 Threshold Cycle Standard Curve Graph 33 y = -2.802x + 26.924 28 R = 0.9854 2 23 18 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 Log Starting Quantity, nanograms Log. Starting Quantity Starting Quantity Ct. Treshold med. 2 100 ng 20.66 +/- 0.47 1 10 ng 24.79 +/- 0.47 0 1 ng 27.13 +/- 0.23 -1 0.1 ng 29.95 +/- 0.057 -2 0.01 ng 32.09 +/- 0.99 Prof. Luigi Ramunno 2 2.5 Prodotto Wurstel Dichiarato in Etichetta Risultato delle analisi effettuate Prodotto di sola carne di pollo e tacchino 0.06% di DNA Suino (0.035 ng) / (138 ng) Analisi sudi carne prodotti commerciali Prodotto equina 59 % di DNA Suino Wurstel Tortellino (45%) e suina (55%) (29.63 ng) / (50 ng) Prodotto di sola carne suina 54% di DNA suino (9 ng) / (16 ng) Prof. Luigi Ramunno Ma la frode davvero conviene? …facciamo il conto della massaia Prezzo latte Bufalo 1.3€/lt Mozzarella 100% Bovino 0.5€/lt Capra 0.56€/lt Pecora 0.7€/lt Mix 50%+50% Mix 50%+50% Mix 50%+50% 100 litri di latte costano 130 € 90 € Con 100 litri produco 24 Kg 18 Kg Se vendo a 12 € al Kg ricavo 288 € 216 € 216 € 288 € 288 € - 216 € - 216 € - 288 € - 130 € = 90 € = 93 € = 100 € = Il conto totale è: + 158 € Prof. Luigi Ramunno + 126 € 93 € 100 € 18 Kg 24 Kg + 123 € + 188 € Sequenziamento del DNA (1): strutture dei nucleotidi Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger Caricati in 4 tubi di reazione Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilamide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l’estremità 5’ mentre il nucleotide T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento stampo. Sequenziamento automatico
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