La divisione cellulare
rappresenta un evento cruciale per
la sopravvivenza di una popolazione di organismi unicellulari così
come per la vita e la riproduzione di un organismo multicellulare.
Il meccanismo di divisione cellulare è sottoposto a
rigorosi meccanismi di controllo
In un organismo complesso, una cellula che si divide in modo
inopportuno provoca la formazione di neoplasie
La formazione di due cellule figlie da una singola cellula
madre comporta una suddivisione equilibrata delle
molecole e dei compartimenti cellulari
il ciclo di divisione è il risultato della successione coordinata di
quattro processi essenziali:
- crescita della cellula
- duplicazione del DNA
- separazione e distribuzione dei
cromosomi
- divisione cellulare
Le cellule procariotiche
Le cellule procariotiche non possiedono un nucleo
L’informazione genetica (aploide) è racchiusa in un’unica molecola,
cromosoma batterico che si aggrega a formare il Nucleoide
Ciclo cellulare nei procarioti
I due cromosomi si separano
man man che la cellula batterica
si accresce
La membrana e la parete si
accrescono determinando una
strozzatura del citoplasma che
progredisce fino alla completa
separazione in due cellule figlie
Ciclo cellulare negli eucarioti
G1: marcato accrescimento della
cellula, che sintetizza componenti
strutturali ed enzimi per la
duplicazione del DNA.
S: duplicazione del DNA e sintesi
di proteine cromosomiche
G2: sintesi di proteine necessarie
per la mitosi.
M: segregazione dei componenti
citoplasmatici e del materiale
nucleare in due cellule figlie.
Prometafase
Profase
Metafase
Anafase
Telofase precoce
Telofase tardiva
Fasi della mitosi (Rieder and Khodjakov, 2003).
Il ciclo di divisione cellulare è costituito dalla successione
ordinata di una serie di fasi.
L’insieme di proteine ed enzimi che attuano gli eventi del ciclo cellulare
deve funzionare sotto stretto controllo da parte di un circuito molecolare
di regolazione.
Un oscillatore molecolare scandisce la durata e la successione
unidirezionale delle fasi del ciclo, integrato con dei circuiti di controllo che
prevengono le transizioni da una fase alla successiva fino a che alcune
condizioni non siano verificate
checkpoint
Il ruolo dei checkpoints
nella regolazione del ciclo cellulare
Esistono durante il ciclo dei checkpoint controls, che assicurano che
ogni fase del ciclo sia completata correttamente prima dell’inizio di
quella successiva.
1. La presenza di DNA non replicato impedisce l’entrata in M
2. L’erroneo assemblaggio del fuso mitotico porta l’arresto in
anafase
3. L’arresto in G1 e in G2 delle cellule con DNA danneggiato
dipende da P53
Checkpoint della
replicazione del DNA
•Difetti del fuso
•Cromosomi non
completamente allineati
Strutture
replicazionali
G1
S
Checkpoint assemblaggio del fuso
G2
Profase
Metafas
e
Anafase
Telofase
Citochinesi
Danni
al DNA
Checkpoint del danno
al DNA
Rappresentazione schematica dei checkpoint del ciclo cellulare. Le frecce
indicano la progressione tra le transizioni del ciclo cellulare, e le barre indicano
l’induzione di arresto, che persiste sino a quando l’evento precedente non sia
stato completato/riparato (da: Elledge, 1996).
Regolazione delle progressione durante il ciclo cellulare
1. La regolazione della progressione durante il ciclo cellulare è affidata
a protein chinasi eterodimeriche, composte da una subunità
catalitica e da una regolativa
2. Le subunità regolative sono dette cicline, poiché il loro livello di
espressione oscilla in modo specifico durante le fasi del ciclo
cellulare.
3. La subunità catalitica presenta un’attività chinasica che è
dipendente dall’associazione con la ciclina, da cui il nome cdk
(cyclin dependent kinase).
4. Catalizzano il trasferimento di un gruppo fosfato dall’ATP al residuo
laterale di serine e treonine in un’ampia varietà di proteine che
svolgono un ruolo fondamentale per la progressione del ciclo.
5. A loro volta l’attività dei complessi cdk/cicline è controllata da eventi
fosforilativi e dall’associazione con proteine regolatrici.
Regolazione del ciclo cellulare nei mammiferi
1. Negli eucarioti inferiori una singola cdk (cyclin dependent kinase) regola le
varie transizioni del ciclo cellulare associandosi sequenzialmente a G1, S e
M cicline
2. Nei mammiferi invece esiste un’intera famiglia di cdk che regolano la
progressione attraverso il ciclo mediante l’associazione con G1, S e M
cicline.
Le cicline: regolatori del ciclo cellulare
Mentre le CDK sono presenti a livelli
essenzialmente costanti durante il ciclo
cellulare, i livelli delle cicline variano
nel tempo in conseguenza della sintesi
e della regolazione controllata della
stessa, mediata da coniugazione con
ubiquitina
e
dipendente
dal
proteasoma
MPF maturation promoting factor
protein chinasi dimerica formata dalla chinasi Cdk1 e dalla ciclina B
Controllo temporale del ciclo cellulare
G0
cdk1
ciclina B1
M
Punto di
restrizione
cdk4/6
ciclina D1
G2
G1
S
cdk2
ciclina A
L’attività delle CDK si esplica
mediante la fosforilazione dei loro
specifici substrati. Diversi substrati
sono coinvolti nel regolare diverse
transizioni del ciclo cellulare
cdk2
ciclina E
Ogni ciclina è espressa in una determinata finestra temporale del ciclo cellulare e la
sua associazione con una specifica cdk promuove il passaggio da una fase alla
successiva del ciclo: il complesso cdk4/6-ciclina D1 promuove la fase G1;
cdk2/ciclina E promuove la fase S; cdk2/ciclina A agisce durante la fase S e alla
transizione G2/M; e cdk1/ciclina B1 promuove la fase M
Transizione G1/S
G0
cdk1
ciclina B1
M
Punto di
restrizione
cdk4/6
ciclina D1
G2
G1
S
cdk2
ciclina A
cdk2
ciclina E
Punto di restrizione superato il
quale la cellula entra in fase S e
procede
con
il
ciclo
indipendentemente
dai
segnali
esterni
La presenza di fattori di crescita
stimola le cellule in fase G0 a
rientrare nella fase G1 e procedere
attraverso il punto di restrizione
Espressione di un ampio gruppo di
geni tra cui fattori di trascrizione
La mitosi è il punto culminante del ciclo cellulare, quando la cellula si
divide ed in materiale genetico deve essere ripartito con grande precisione
nelle due cellule figlie. La fase M è divisa in 5 stadi
Drastica riorganizzazione
strutturale per assiurare la
corretta segregazione dei
cromosomi
Gli eventi che si osservano in mitosi sono:
- Condensazione dei cromosomi
- Formazione del fuso mitotico
- Aggancio dei cromosomi alle fibre del fuso
- Separazione dei cromatidi fratelli
- Formazione di due nuclei
- Separazione delle due cellule figlie
Citodieresi
Formazione anello contrattile formato da
filamenti di actina e miosina, posto
perpendicolarmente al fuso centrale
Proliferazione Cellulare
Il ciclo di divisione cellulare è costituito da una sequenza ordinata di eventi che
assicura la generazione di due cellule figlie geneticamente identiche.
il cinetocore che si assembla al livello
del centromero è costituito da diversi
complessi che se da un lato legano il
DNA
dall’altro
contattano
l’estremitÀà(+) dei microtubuli
Il fuso mitotico
La segregazione dei cromosomi è operata dal
fuso mitotico, struttura bipolare formata da
microtubuli e da un insieme di proteine motrici
e regolatrici ad essi associate
I microtubuli sono più dinamici in fase M
L’estremità
(+)
dei
microtubuli può allungarsi o
accorciarsi
restando
strettamente associata al
cinetocore
Il ciclo dei centrosomi
I centrosomi fungono da centri organizzatori, da cui si dipartono i microtubuli.
Contengono centinaia di strutture ad anello composte da tubulina γ, ciascuna sito di
nucleazione per la crescita di un microtubulo
All’interno del centrosoma si trovano i centrioli, simili ai corpuscoli
basali, centri organizzatori dei microtubuli di ciglia e flagelli
I centrioli contengono triplette di microtubuli
Centriolo parentale
Appendici distali
Appendici subdistali
Microtubulo
Materiale pericentriolare
(PCM)
Centriolo figlio
Fibre interconnetenti
Il centrosoma. Rappresentazione schematica delle componenti del
centrosoma (da Doxsey, 2001)
I microtubuli in crescita sono caratterizzati da instabilità dinamica,
ovvero crescono o si accorciano improvvisamente. I dimeri tubulinici
hanno attività GTPasica. Se legate al GTP le molecole di tubulina
restano ben organizzate a formare il microtubulo, se legate al GDP
cambiano conformazione e stabiliscono fra loro legami meno stabili
In modo analogo ai cromosomi, anche I
centrosomi devo essere correttamente
segregati nelle due cellule figlie in mitosi
ed è necessario che si duplichi una sola
volta in fase S
attivazione
separasi
meccanismo di replicazione
semiconservativo
La meiosi: particolare tipo di divisione cellulare che
permette la formazione di gameti aploidi (cellule sessuali)
Questo tipo di divisione assegna un intero corredo aploide (una copia
di ciascun cromosoma) ad ogni gamete assortendo in modo casuale i
cromosomi di origine paterna e materna
I meccanismi di ricombinazione fra cromosomi omologhi
contribuiscono ad assortire in ogni gamete un numero incalcolabile di
combinazioni diverse degli alleli di origine paterna e materna
Il rimescolamento di geni è alla base della varibilità che
caratterizza la riproduzione sessuata
Condensazione del DNA mitotico
Cariotipo diploide Umano di una cellula somatica
Due copie di ciascun cromosoma una derivata
dal gamete paterno e l’altro dal gamete materno
I gameti sono cellule aploidi, ovvero contengono una sola copia del
corredo genetico dell’organismo
Profase della prima divisione mitotica:
-Condensazione dei cromosomi
-Riconoscimento e appaiamento degli
omologhi
-Compimento di fenomeni di ricombinazione
Chiasma: punti in cui è
avvenuta la ricombinazione
Crossing over
La distribuzione casuale dei
cromosomi nel corso della
meiosi permette di ottenere
la variazione genetica
La non
disgiunzione
causa aneuploidie
Mitosi e Meiosi
Risultato della meiosi: 4 nuclei figli apoidi differenti
Morte cellulare: necrosi e apoptosi
Proliferazione e morte cellulare sono eventi fisiologici:
-Omeostasi tissutale (di tessuti dinamici)
-Sviluppo embrionale
-Eliminazione di strutture corporee “inutili”
-Fasi di scultura/rimodellamento del corpo
Malattie connesse a difetti nel processo di morte
cellulare:
- malattie neurodegenerative
-cancro
Morte Cellulare
1. Le cellule non sono entità immortali, ma invecchiano e muoiono
2. La morte cellulare in seguito a ipossia, ischemia, ipertermia,
avvelenamento è detta necrosi
3. La morte cellulare fisiologica che segue all’invecchiamento cellulare è
detta apoptosi
4. Le due modalità di morte cellulare sono molto diverse dal punto di
vista morfologico e biochimico
Necrosi: morte accidentale e disordinata, non fisiologica e passiva, in
genere causata da traumi: cellula si rigonfia, rompe e riversa il proprio
contenuto all’esterno
Apoptosi: morte programmata e definita dall’attuazione di un
programma genetico, evento rapido e “pulito”: non restano frammenti
perchè la cellula espone antigeni riconosciuti da cellule spazzino: cellule
morenti sono fagocitate
La necrosi è causata da danni alla cellula irreparabili, repentini
La sequenza degli eventi che si susseguono in una cellula che sta
morendo per necrosi possono variare a seconda del tessuto e del tipo
di danno; tuttavia, indipendentemente dall’ordine questo è quello che
accade in una cellula che va incontro a necrosi:
•
La produzione di ATP nei mitocondri si arresta.
•
Le pompe ioniche di membrana, che funzionano con l’ATP, si
bloccano.
•
Nella cellula entrano sodio e acqua.
•
La cellula e gli organuli interni si rigonfiano.
•
La cellula avvia la risposta allo shock termico (allo stress) con
aumento della sintesi di alcune proteine (chaperonine) che
tentano di contrastare la denaturazione delle proteine e della
ubiquitina (proteina che lega in maniera covalente le proteine
denaturate e le indirizza alla distruzione).
•
Il pH scende.
Questi processi determinano il rigonfiamento della cellula
cui segue la rottura della membrana, compreso l’involucro
nucleare e la disgregazione della cromatina
Il materiale citoplasmatico viene rilasciato nello spazio
extracellulare e questo si traduce in processi
infiammatori che possono danneggiare interi tessuti
L’apoptosi è la modalità fisiologica di morte cellulare
Ruolo biologico dell’Apoptosi
L’apoptosi rappresenta un meccanismo endogeno
di suicidio cellulare, ben distinto dalla necrosi, che
gioca un ruolo importante in una serie di processi
biologici fondamentali, tra cui
•
Embriogenesi
•
Rimodellamento tissutale e metamorfosi
•
Turn-over cellulare
Tappe cronologiche dell’apoptosi
La cellula apoptotica passa attraverso una serie di stadi morfologicamente
identificabili:
•
Nella fase iniziale dell’apoptosi una singola cellula perde i contatti con le
altre cellule del tessuto.
•
Il nucleo si condensa (picnosi) e successivamente si frammenta (carioressi).
•
La cellula si contrae a causa della disidratazione citoplasmatica e della
condensazione delle proteine.
•
La maggior parte degli organuli intracellulari rimane intatta, sebbene si verifichi
la dilatazione del reticolo endoplasmatico e dei mitocondri
•
Nella fase successiva il “ruffling” (increspatura) e il “blebbing” (formazione
di estroflessioni) della membrana plasmatica portano alla frammentazione
cellulare.
•
I frammenti, o corpi apoptotici, che ne derivano, contengono anche porzioni
di nucleo.
•
Infine, i macrofagi fagocitano i frammenti e li degradano completamente
Cellula normale
Cellula in vescicolazione
L’apoptosi non causa infiammazione
Il processo apoptotico è molto rapido: cellule che vanno incontro ad
apoptosi possono scomparire completamente entro alcune ore
dall’attivazione del processo.
L’apoptosi non porta alla liberazione di prodotti cellulari all’esterno della
cellula.
Apoptosi delle cellule epiteliali (I)
5. Cellula epiteliale normale (piatta)
6-7.Cellula epiteliale apoptotica che
presenta un progressivo
arrotondamento, blebbing superficiale e
retrazione cellulare
Apoptosi delle cellule epiteliali (II)
8-9. Progressiva retrazione cellulare e
blebbing
10. Gemmazione dei corpi apoptotici
Corpi apoptotici
Apoptosi = dal greco, caduta delle foglie da una pianta
L’apoptosi è un processo attivo
L’apoptosi si può verificare quindi in seguito della perdita di
segnali trofici che normalmente sopprimono l’espressione del
programma genetico di morte cellulare: numerosi fattori di crescita,
ormoni e altri stimoli esterni prevengono l’apoptosi.
L’apoptosi, a differenza della necrosi, è un processo attivo che
richiede energia metabolica, oltre alla sintesi di RNA e proteine.
L’innesco del fenomeno apoptotico è seguito da modificazioni della
permeabilità di membrana, con uscita rapida e selettiva di ioni ed
acqua dalle cellule, che porta alla condensazione citoplasmatica e
all’aumento della densità cellulare.
La condensazione del citoplasma avviene parallelamente alla
condensazione e alla frammentazione della cromatina nucleare,
che si verifica a livello dei siti internucleosomici, con la formazione di
frammenti di DNA di lunghezza pari a multipli interi di 180-200 pb
Segnali in grado di indurre l’apoptosi:
-extracellulari, sistema mediato da recettori di morte
-intracellulari provenienti dal reticolo endoplasmatico e
dal nucleo, entrambi convergenti verso i mitocondri, che
costituiscono il principale punto di controllo dell’apoptosi
indotta da vari stimoli
Attivazione a cascata di una particolare famiglia di proteasi
denominate CASPASI essenziali nello smantellamento
della struttura cellulare
Fase di induzione
-Via estrinseca: interazione tra citochine pro-apoptotiche (TNF- , TNF- ,
Fas-L) espresse sulla superficie di alcune cellule (MF o sulle cellule dei
testicoli e dell'apparato oculare) e recettori sulla superficie della cellula
bersaglio (TNF-R, Fas)
- Via intrinseca: mancanza di fattori di crescita, danni cellulari al DNA o ai
mitocondri per es.
Fase di esecuzione
Propagazione
della
cascata
delle
caspasi
e
di
altre
proteine
proapopoptotiche (Bid, Bad, p53)
Rilascio dai mitocondri dell'APOPTOSOMA (citocromo c e Apaf 1), AIF,
DNAsi
Fase di degradazione
Frammentazione del DNA da parte di endonucleasi attivate da caspasi
e da ioni calcio a livello delle regioni tra due nucleosomi, in frammenti
da 180-200 pb
I processi di proliferazione ed apoptosi sono correlati
Nei tessuti con capacità di ricambio (fegato, epiteli, midollo osseo) la
proliferazione ha inizio da una popolazione di cellule staminali. Una
frazione di queste cellule va incontro continuamente a differenziamento e,
dopo un periodo di vita limitato, ad apoptosi.
Molti tessuti con capacità di ricambio possono rispondere allo stress
fisiologico mediante un notevole aumento della proliferazione cellulare e
quindi del numero di cellule (iperplasia).
Questo fenomeno è il risultato di due componenti: una proliferativa,
attivata da fattori come le citochine e gli ormoni, che stimolano la
moltiplicazione delle cellule staminali, e una di sopravvivenza attivata da
fattori che sopprimono l’apoptosi delle cellule progenitrici.
Principali caratteristiche dell’apoptosi
1. Ha specifici marcatori morfologici e biochimici
2. E’ un processo regolato finemente da un programma
genetico
3. E’ richiesta l’attività trascrizionale e traduzionale
4. La frammentazione della cromatina nucleare anticipa
la morte cellulare
5. La frammentazione del DNA e la condensazione della
cromatina sono importanti marcatori del processo
apoptotico
Modificazioni biochimiche in corso di apoptosi
1. Frammentazione del DNA nucleare
2. Riduzione del contenuto di DNA
3. Riduzione del contenuto proteico
4. Espressione di nuovi antigeni di membrana e citosolici
L’apoptosi dipende da un programma genetico
La sequenza di eventi che segnano l’innesco e la progressione del
fenomeno apoptotico è soggetta ad una regolazione molto accurata
si parla quindi di apoptosi come di morte cellulare programmata
(PCD, Programmed Cell Death), cioè come di un evento che
richiede l’innesco di un ben preciso programma genetico da parte
della cellula:
la teoria oggi universalmente accettata è quella che il programma
genetico di morte sarebbe sempre in esecuzione, se non venisse
contrastato continuamente da stimoli promuoventi la
sopravvivenza
PERCHE’ UNA CELLULA VA IN APOPTOSI
la morte cellulare programmata è necessaria nel modellare
l’organismo durante l’embriogenesi o, più in generale, per un
appropriato sviluppo:
- la formazione delle dita del feto richiede la rimozione del tessuto che le unisce
- lo sfaldamento dell’endometrio che dà inizio alle mestruazioni avviene per apoptosi.
- la formazione di opportune connessioni fra i neuroni (sinapsi) richiede che le cellule in eccesso
siano eliminate per apoptosi.
la morte cellulare programmata è necessaria per distruggere cellule
che costituiscono un pericolo per l’integrità dell’organismo:
cellule infettate da virus
(Uno dei metodi attraverso cui i linfociti T citotossici uccidono le cellule infettate è
inducendo l’apoptosi)
cellule del sistema immunitario auto-responsive ( difetti nel macchinario
apoptotico si accompagnano alla comparsa di malattie autoimmunitarie)
cellule con DNA danneggiato (improprio sviluppo embrionale, trasformazione
neoplastica). Le cellule rispondono ad un danno al DNA aumentando la produzione di
p53, un potente induttore dell’apoptosi.
cellule tumorali (radiazioni e chemioterapici inducono apoptosi in alcuni tipi di
tumore).
via intrinseca: dipendente
dalla
fuoriusita
dal
mitocondrio di citoromo c
e altre piccole proteine
via estrinseca: attivata da recettori
presenti sulla membrana detti
recettori di morte appartenenti alla
famiglia del recettore TNF(fattore di
necrosi tumorale)
Fattori
anti-apoptotici
Fattori
pro-apoptotici
LE CASPASI
Sono delle Cisteina Proteasi che tagliano proteine a livello di residui di acido
aspartico (da cui C-ASP-asi). Per la maggioranza delle caspasi i loro substrati
sono altre caspasi. La cascata di attivazione delle caspasi culmina
nell’attivazione delle caspasi effettrici, quali la caspasi 3 e 6.
Queste sono responsabili della proteolisi di proteine cellulari chiave che
determinano cambiamenti morfologici tipici di una cellula che va in apoptosi.
CAD: Caspase Activated DNAse (frammenta il DNA in unità nucleosomali, ben
visibili nel DNA laddering assay)
ICAD: Inhibitor of CAD, attivata dalla caspasi 3
PARP: Poly-ADP-ribosio-polimerasi. E’ coinvolta nel riparo del DNA
danneggiato; il taglio da parte della caspasi 3 ne previene l’attività. Anche la
topoisomerasi (replicazione e riparo del DNA) viene inattivata dalle casp3.
