Fondamenti di Biologia
Molecolare
Angela Duilio
Dipartimento di Scienze Chimiche
[email protected]
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Il corso si propone di fornire le
conoscenze di base sulla struttura e
proprietà del materiale genetico degli
organismi viventi e sui meccanismi
molecolari della trasmissione ed
espressione dell’informazione
genetica.
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• La caratteristica dominante degli organismi
viventi è la loro capacità di conservare, utilizzare
e trasmettere le informazioni
• La Biologia Molecolare nasce da un processo
di unificazione della Genetica e della
Biochimica, che si erano fino ad allora
sviluppate su linee divergenti.
• spiega le basi molecolari della trasmissione dei
caratteri ereditari
Il materiale genetico
Gli Acidi Nucleici sono deputati alla trasmissione
dell’informazione genetica
Il DNA (acido desossiribonucleico) è il materiale
genetico
È infatti l’informazione contenuta nel DNA che
permette l’organizzazione di molecole inanimate
in cellule viventi e in organismi capaci di regolare
la propria composizione chimica interna e la
propria crescita e riproduzione
È inoltre il DNA che ci garantisce l’ereditarietà
delle caratteristiche somatiche dei nostri avi,
tramite la trasmissione di geni
Il materiale genetico
I geni contengono l’informazione, sotto forma di
specifiche sequenze nucleotidiche che costituiscono le molecole del DNA
Le molecole del DNA utilizzano:
4 basi azotate, guanina, adenina, timina e
citosina (G,A,T,C),
1 gruppo fosfato
1 zucchero desossiribosio, per formare il
nucleotide
IL MATTONE
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Il materiale genetico
Tutta l’informazione contenuta nei geni deriva dall’ordine in cui i quattro nucleotidi si trovano lungo la
molecola di DNA
Geni complicati possono essere composti da centinaia
di nucleotidi
L’istruzione genetica di un organismo, detta genoma,
è conservata in milioni/miliardi di nucleotidi
NUCLEOTIDE
Ognuno dei cinque atomi di
carbonio del desossi-ribosio
ha assegnato un numero
d’ordine (da 1’ a 5’)
Struttura chimica dell’Adenosina 5’
monofosfato:
ogni
nucleotide
è
composto da tre parti, un gruppo
fosfato, uno zucchero desossiribosio
centrale ed una delle quattro basi
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azotate
Stringhe di nucleotidi possono essere unite
tra loro a formare lunghe catene
polinucleotidiche e, su larga scala, un
cromosoma
Tutti gli esseri viventi formano legami fosfodiestere esattamente allo stesso modo
I gruppi fosfato di ogni nucleotide libero si
trovano sempre legati al carbonio 5’ dello
zucchero
I gruppi fosfato fanno da ponte tra il
carbonio 5’ del desossiribosio di un nuovo
nucleotide e il carbonio 3’ di una catena
polinucleotidica preesistente
Una stringa di nucleotidi termina sempre con
un carbonio 5’, mentre all’altra terminazione
della molecola vi è un carbonio 3’ libero
L’orientamento della molecola del DNA è fondamentale per
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decifrare il contenuto informativo della cellula
Il materiale genetico
Un tema comune a tutti i sistemi
biologici, ed a tutti i livelli, è l’idea
che struttura e funzione siano
intimamente correlate
La scoperta di J. Watson e F. Crick
(1953) che la molecola di DNA
all’interno delle cellule solitamente
esistesse come molecola a doppio
filamento fornì un inestimabile
indizio su come il DNA potesse
agire come materiale genetico
J. Watson e F. Crick (Nobel
per la Medicina con M.
Wilkinson, 1962)
Il materiale genetico
Il DNA è dunque costituito da
due filamenti
Il DNA può essere replicato e
trasmesso fedelmente da una
generazione all’altra separando i due filamenti e usandone
ciascuno come stampo per la
sintesi di un nuovo filamento
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Il materiale genetico
Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento viene separato
Ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento,
Sia gli organismi procarioti (batteri), sia gli eucarioti (organismi complessi)
utilizzano lo stesso alfabeto di nucleotidi e lo stesso approccio per immagazzinare
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e utilizzare l’informazione genetica
Il materiale genetico
L’informazione contenuta nei due filamenti del DNA
è complementare
Per ogni G di un filamento si trova una C sul filamento
complementare e viceversa
Per ogni A di un filamento si trova una T sul filamento
complementare e viceversa
L’interazione tra G e C e tra A e T è specifica e stabile
I due filamenti della molecola di DNA sono antiparalleli
l’estremità 5’ di un filamento che corrisponde
all’estremità 3’ del filamento complementare e viceversa
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Il dogma centrale della biologia
l’informazione conservata nel DNA è utilizzata per
sintetizzare un polinucleotide a singolo filamento,
detta RNA (acido ribonucleico), che è a sua volta
utilizzata per sintetizzare le proteine (enzimi)
I geni contengono le istruzioni necessarie per
realizzare gli enzimi
gli enzimi compiono il lavoro di modifica della
chimica della cellula
Il processo di estrazione dell’informazione
dalla sequenza nucleotidica di un gene per
la costruzione degli enzimi è comune a
tutti gli esseri viventi
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Il dogma centrale della biologia
Il processo di copia di un gene in RNA è
chiamato trascrizione ed è realizzato
attraverso l’attività enzimatica di una RNA
polimerasi
Il processo di conversione dalla sequenza
nucleotidica
dell’RNA
alla
sequenza
aminoacidica che costituisce le proteine è
chiamato traduzione, ed è svolto da un
complesso di proteine ed RNA, detto
ribosoma
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Il dogma centrale della biologia
Trascrizione da DNA a RNA tramite RNA polimerasi
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Il dogma centrale della biologia
Il “linguaggio” del DNA è stato elaborato
all’inizio della storia della vita sulla terra ed ha
subito poche modifiche nel corso di milioni di
anni
L’espressione genica è il processo che utilizza
l’informazione conservata nel DNA per costruire una
molecola di RNA che codifica a sua volta una proteina
Le RNA polimerasi sono responsabili dell’attivazione
dell’espressione genica attraverso la sintesi di copie di
RNA del gene
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La struttura del gene
Le RNA polimerasi devono:
distinguere in modo affidabile l’inizio del
gene
L’RNA polimerasi non può cercare un
particolare nucleotide perché ogni
nucleotide si trova casualmente in
qualsiasi parte del DNA
Sequenza promotrice del gene
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Il codice genetico
Mentre i nucleotidi sono le unità fondamentali
utilizzate dalla cellula per conservare le informazioni (DNA) e per costruire le molecole atte a
trasferirle (RNA), gli aminoacidi sono le unità
fondamentali costitutive delle proteine
La funzione di una proteina è fortemente dipendente dall’ordine in cui gli aminoacidi sono legati
dal ribosoma durante la traduzione
Struttura chimica di un aminoacido: il gruppo
amminico, il carbonio , ed il gruppo carbossilico
sono identici per tutti gli aminoacidi, che si
differenziano invece in base al gruppo R (catena
laterale)
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Il codice genetico
Tuttavia, se per costruire le molecole di DNA e RNA
vengono utilizzati solo 4 nucleotidi, per la sintesi delle
proteine si hanno 20 aminoacidi
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Il codice genetico
Pertanto, non vi può essere corrispondenza uno
auno tra i nucleotidi dei geni e gli aminoacidi
delle proteine che essi codificano, ne vi può
essere corrispondenza fra coppie di nucleotidi (16
al più) e aminoacidi
È necessario che i ribosomi utilizzino un codice a
triplette
ogni gruppo di tre nucleotidi, un codone, corrisponde ad
uno specifico aminoacido, con tre sole eccezioni:
I tre codoni che non indicano al ribosoma di inserire un
aminoacido sono i codoni di stop
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Il codice genetico
La traduzione, ad opera dei ribosomi, avviene a partire
da un sito d’inizio, posto sulle copie di RNA di un gene
e procede fino al primo codone di stop
Il codone d’inizio è costituito dalla tripletta AUG (che
codifica anche la metionina), sia negli eucarioti che nei
procarioti
La traduzione è accurata solo quando i ribosomi
esaminano i codoni all’interno della cornice di lettura
(delimitata da codone d’iniziocodone di stop)
L’alterazione della cornice di lettura di un gene cambia
ogni aminoacido posto a valle dell’alterazione stessa e
causa solitamente la produzione di una versione troncata
della proteina
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La funzione delle proteine
I compiti delle proteine sono incredibilmente
diversificati
Le proteine strutturali, come il collagene, forniscono
supporto alle ossa ed ai tessuti connettivi
Gli enzimi agiscono come catalizzatori biologici,
come la pepsina che regola il metabolismo
Le proteine sono inoltre responsabili del trasporto di
atomi e molecole nell’organismo (emoglobina), dei
segnali e delle comunicazioni intercellulari (insulina), dell’assorbimento dei fotoni per i processi visivi
(rodopsina), etc.
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Introni ed esoni
IN PROCARIOTI
Le copie di RNA messaggero, mRNA, dei geni
corrispondono perfettamente alle sequenze di DNA
presenti nel genoma,
La trascrizione e la traduzione avvengono in
contemporanea
IN EUCARIOTI
le due fasi dell’espressione genica sono fisicamente
separate dalla membrana nucleare:
la trascrizione avviene nel nucleo,
la traduzione solo dopo che l’mRNA è stato trasportato nel
citoplasma
Le molecole di RNA trascritte dalla polimerasi
eucariotica possono essere modificate prima che i
ribosomi le traducano
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Introni ed esoni
La modificazione più evidente che subisce il trascritto
primario dei geni eucariotici è lo splicing, che prevede
il taglio degli introni ed il ricongiungimento degli esoni
che li affiancano
Molti geni eucariotici hanno
un numero di introni assai
elevato
Esempio: il gene associato alla fibrosi cistica ha 24 introni
ed è lungo più di un milione di
coppie di basi, mentre l’mRNA
tradotto dai ribosomi è costituito da circa mille coppie di
basi
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Strumenti per la biologia molecolare
Sei principali tecniche di laboratorio definiscono l’intera
disciplina della biologia molecolare:
Enzimi di restrizione
Elettroforesi su gel
Blotting e ibridazione,
Clonaggio
Reazione a catena della polimerasi
Sequenziamento del DNA
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Enzimi di restrizione
Il lavoro originale di Wilkinson,
Watson e Crick (1953), che valse loro
il Nobel nel 1962, spiegava come il
DNA fungesse da materiale genetico
Ma fu solo venti anni dopo che H.
Smith et al. scoprirono gli enzimi di
restrizione,
che
permisero
di
manipolare le molecole di DNA in
modo spe-cifico per decifrare il loro
contenuto informativo
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Enzimi di restrizione
Nel corso dello studio sulla causa che portava
alcune cellule batteriche a migliorare la propria
difesa contro le infezioni virali, infatti, rilevarono
che i batteri producevano degli enzimi capaci di
rompere le molecole di DNA in corrispondenza di
particolari stringhe di nucleotidi
Gli enzimi di restrizione possono essere isolati
dalle cellule batteriche ed utilizzati come “forbici”,
che permettono ai biologi di tagliare/incollare le
molecole di DNA
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Enzimi di restrizione
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Enzimi di restrizione
tagliando una molecola di DNA e determinando
l’ordine dei tagli (ottenuti con più enzimi) ed il
numero di frammenti, si può comprendere la
specifica organizzazione e sequenza della molecola
mappe di restrizione
con gli enzimi di restrizione si possono isolare e
manipolare sperimentalmente i singoli geni
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Elettroforesi su gel
Per genomi composti da milioni (come il genoma
di E.coli) o da miliardi di coppie di basi (come il
genoma umano), la scissione completa tramite
enzimi di restrizione può fornire centinaia di
migliaia di frammenti di DNA
L’elettroforesi su gel di agarosio (o poliacrilammide) è una tecnica classicamente utilizzata per
analizzare e separare tali frammenti
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Elettroforesi su gel
L’elettroforesi su gel sfrutta le cariche presenti
nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente, grazie alla presenza dei fosfati) per farle
migrare, in un campo elettrico, attraverso il gel
Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una
rete di pori, che consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole
attraversano più velocemente i pori rispetto a
quelle più grandi
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Elettroforesi su gel
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Clonaggio
Tramite il clonaggio molecolare è possibile
isolare un singolo gene o, più in generale,
un frammento di DNA dal genoma di un
organismo e produrne
molte copie
identiche
La disponibilità di un gene in forma pura e
in grande quantità ne consente lo studio a
livello molecolare
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Clonaggio
Il clonaggio coinvolge l’inserimento di frammenti
specifici di DNA all’interno di trasportatori
chiamati
vettori,
che
ne
permettono
la
replicazione e l’isolamento all’interno di cellule
viventi
I primi vettori che furono utilizzati derivavano da
virus batterici e da DNA extra-cromosomale, detti
plasmidi, presenti nelle cellule procariotiche
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Clonaggio
Tutti i vettori devono possedere le seguenti
caratteristiche:
Possedere una zona in cui può essere inserito il
DNA esogeno (detta polylinker)
Contenere le sequenze che permettono al vettore di
replicarsi all’interno della cellula vivente
Contenere le sequenze che conferiscono alla cellula
ospite la capacità di rilevarne la presenza
Dimensioni e forma tali da permettere al vettore di
essere separato dal DNA della cellula ospite
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Clonaggio
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Reazione a catena della polimerasi
La tecnica della reazione a catena della polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, PCR, K. Mullis, 1985)
è un metodo che ha rivoluzionato le tecniche
dell’ingegneria genetica offrendo uno strumento
straordinariamente potente nell’amplificare in vitro e in poco tempo definite sequenze di DNA
Questa tecnica consente di ottenere centinaia di
migliaia di copie del DNA di interesse per successive caratterizzazioni (determinazione della lunghezza, della sequenza nucleotidica, etc.)
La PCR sfrutta in vitro la reazione di sintesi del
DNA, reazione catalizzata dalla DNA polimerasi
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Reazione a catena della polimerasi
Le molecole di DNA amplificate sono prodotte
molto più velocemente ed efficacemente rispetto
a quelle ottenibili dai cloni
Il maggior vantaggio della PCR, tuttavia, consiste
nel poter iniziare con quantità di materiale (come
quelle tipicamente associate a campioni provenienti da musei, o fossili o forensi) molto minori di
quanto non siano solitamente disponibili (e necessarie) negli esperimenti di clonaggio
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Sequenziamento del DNA
Il termine sequenziamento indica il processo per
la determinazione della struttura primaria esatta
di un biopolimero (una macromolecola), cioè dell’ordine delle basi nel caso di un acido nucleico, o
degli aminoacidi nel caso delle proteine
La caratterizzazione molecolare finale di un frammento di DNA consiste, infatti, nella determinazione dell’ordine, o sequenza, dei suoi nucleotidi
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Sequenziamento del DNA
Metodo di A. M. Maxam e W. Gilbert (1977):
degradazione chimica del DNA
Metodo di F. Sanger (1978): a terminazione di
catena
Hanno in comune la generazione di una scaletta di
frammenti di DNA a singolo filamento, ciascuno più
lungo del precedente di una base
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Concludendo…
Il DNA è la molecola che contiene l’informazione
conservata all’interno della cellula
L’ordine specifico dei quattro differenti nucleotidi
è trascritto dalla RNA polimerasi in mRNA, che
viene tradotto in proteine
Per costruire le proteine vengono utilizzati venti
diversi aminoacidi e l’ordine e la composizione
specifica di questi “mattoni” giocano un ruolo
importante nella costruzione e nel mantenimento
della struttura e della funzione delle proteine
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Concludendo…
I biologi molecolari hanno a disposizione un numero
piuttosto limitato di strumenti per studiare il DNA e
l’informazione contenuta al suo interno
Gli enzimi di restrizione tagliano la molecola di DNA quando
riconoscono una determinata stringa di nucleotidi
L’elettroforesi permette la separazione dei frammenti di DNA in
base alla loro lunghezza ed alla loro carica
Le tecniche di blotting e ibrididazione garantiscono il reperimento di specifici frammenti di DNA in una mistura
Il clonaggio permette la propagazione di sequenze specifiche,
per un utilizzo ripetuto
La PCR garantisce una rapida amplificazione e caratterizzazione
di specifici frammenti di DNA
Il sequenziamento, infine, determina l’ordine dei nucleotidi,
garantendo la caratterizzazione della molecola di DNA
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Blotting ed ibridazione
Individuare il singolo frammento di DNA
che contiene uno specifico gene tra
centinaia di migliaia di frammenti, anche
se divisi per dimensione, è un compito
impossibile
L’ibridazione è una tecnica che consente di
verificare la complementarietà esistente
tra due molecole di acidi nucleici in base
alla loro omologia di sequenza
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Blotting ed ibridazione
L’appaiamento di basi può avvenire tra due DNA,
due RNA o un DNA ed un RNA
Il principio della reazione consiste…
…nell’esporre l’una all’altra due preparazioni di
acido nucleico a singolo filamento (di cui uno
marcato radioattivamente)
e, successivamente, nel visualizzare
(autoradiografia o colorazione) il DNA a doppio
filamento che si è formato (quantificandone la
radioattività incorporata)
Blotting ed ibridazione
La tecnica di ibridazione su filtro o membrana,
detta blotting, è la più utilizzata per verificare la
presenza di sequenze complementari (geni) di
diversa origine, provenienti ad esempio da un
altro animale o da un’altra specie
Si utilizzano a questo scopo delle sonde molecolari, cioè frammenti di DNA che codificano per
la proteina da analizzare
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Blotting ed ibridazione
Blotting: ibridazione su membrana
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![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
