Che cosa sono le biotecnologie
• Come è noto, la tecnologia si sviluppa parallelamente alla scienza,
rappresentandone alcune volte lo strumento per renderne possibile
l'avanzamento (ad esempio quando si costruisce un telescopio), altre
volte il naturale sbocco applicativo (come quando si costruisce un bypass).
• Le biotecnologie sono un insieme di tecniche sviluppate a partire dalle
conoscenze scientifiche acquisite nel campo della biologia e della
genetica, finalizzate alla produzione di nuove molecole a partire da
sistemi biologici esistenti in natura ed opportunamente selezionati o
appositamente creati in laboratorio.
Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie che
usano organismi viventi, o parti di essi allo scopo
di produrre quantità commerciali di prodotti
utili all'uomo, di migliorare piante ed animali o
sviluppare microrganismi utili per usi specifici
Le biotecnologie
Sulla base dei metodi impiegati per la
realizzazione dei prodotti possiamo
distinguere
TRADIZIONALI
INNOVATIVE
Biotecnologie
Le biotecnologie microbiche possono essere
definite come l'uso di organismi viventi, di
loro componenti o prodotti per ottenere
beni e servizi.
Queste biotecnologie, che sono denominate
"classiche" in contrapposizione alle
biotecnologie "innovative" dei nostri giorni,
constano essenzialmente di processi
fermentativi.
BIOTECNOLOGIA
• Tecnica consistente nell'utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo
scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili, o per migliorare
le caratteristiche di piante ed animali
• Ingegneria genetica (innovative): Insieme di tecniche che consentono di
modificare il patrimonio genetico di organismi in modo da trasferire da un
essere vivente ad un altro caratteristiche utili
INTRODUZIONE ALLE BIOTECNOLOGIE
RICOMBINANTI
Il clonaggio molecolare
Nell’accezione più comune un “clone” è una copia esatta di qualcosa e “clonare”
significa riprodurre esattamente qualcosa. Per esempio si clonano i numeri dei
cellulari o i DVD.
In termini biologici con il termine clonaggio si intende la riproduzione di organismi
geneticamente uguali mediante la mitosi, o riproduzione asessuale. Per esempio la
riproduzione dei batteri è di tipo clonale.
Naturalmente sebbene tutti i cloni siano geneticamente uguali, non sono sempre
fenotipicamente uguali, a causa dell’influenza di fattori di tipo epigenetico. Per es.
considerate il caso dei gemelli omozigoti.
Sebbene animali e piante normalmente si riproducono per meiosi, è possibile
clonare organismi superiori e, in effetti, il clonaggio di organismi è oggetto di intenso
studio e fonte di acceso dibattito.
E’ importante sottolineare la differenza tra il clonaggio (o clonazione) di organismi
superiori e il clonaggio molecolare.
Nel primo caso, come quello, per esempio della pecora Dolly, per quanto tecnicamente
complesso, si arriva alla creazione di individui geneticamente uguali senza prevedere
alcuna modifica genetica.
Nel secondo caso, invece, come nel caso del mais trasgenico per esempio, i geni ven
gono manipolati ed introdotti in organismi ospiti, arrivando infine alla creazione di
organismi geneticamente modificati (OGM). Questi organismi non necessariamente
hanno geni modificati; molto spesso contengono semplicemente nuove combinazioni
geniche, introducendo, per esempio, un gene vegetale utile, in una specie vegetale
che ne è sprovvista.
Il clonaggio molecolare, effettuato con tecniche di ingegneria genetica, consiste
nel creare, modificare o trasferire geni, inserirli in vettori di replicazione ed
introdurli in un organismo che provvederà a produrne copie esatte.
Definizione di biotecnologie ricombinanti
Il termine “biotecnologie ricombinanti” comprende e definisce tutte quelle
tecnologie centrate sulla manipolazione del materiale genetico per la realizzazione
di nuove combinanzioni di caratteri e che includono numerose tecniche applicate
allo studio e alla diagnostica a livello molecolare
Questa definizione è un sinonimo di “Ingegneria genetica”,
Nascita e sviluppo dell’ingegneria genetica
1928 Dimostrazione che il DNA può trasformare geneticamente (Griffith)
1944 Si dimostra che l'informazione genetica è contenuta nel DNA (Avery)
1953 Si pubblica la struttura del DNA (Watson e Crick )
1966 Decifrazione del codice genetico
1970 Isolamento dei primi enzimi di restrizione
1972 Sintesi chimica di un gene (Khorana)
1973 Primi clonaggi in batteri (Boyer e Cohen)
1976 Conferenza di Asilomar sulle ricadute delle tecniche del DNA ricombinante
1976 Metodo di sequenziamento del DNA (Maxam e Gilbert)
1978 Si commercializza la prima insulina umana
1980 Si brevettano in USA i primi organismi ricombinanti
1983 Si ottengono le prime piante transgeniche
1988 Viene pubblicato il metodo della PCR (Mullis)
1990 Si inizia la sperimentazione sull'uomo della terapia genica
1996 Viene completata la prima sequenza di un genoma eucariotico
1997 Viene clonata una pecora (Dolly) da un nucleo di cellula differenziata
2001 Viene pubblicata la sequenza del genoma umano
Stabilito che ci occuperemo di manipolazione genica il primo passo consiste nell’ identificare
isolare ed amplificare il DNA oggetto del nostro studio, introducendolo in un organismo dove
possa replicarsi indefinitivamente; in altre parole dobbiamo clonarlo. Qui sotto è riportato lo
schema generale di clonaggio molecolare che si effettua in batteri per isolare ed amplificare un
frammento di DNA.
Identificazione di un gene
Isolamento di un gene
Inserimento in un vettore
Introduzione in un ospite per amplificare il gene
Selezione della sequenza genica
GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE
Sono enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in
corrispondenza di specifiche sequenze. Per questo
motivo vengono anche detti endonucleasi di
restrizione (invece le esonucleasi distruggono il
DNA partendo dalle estremità).
Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali
riconosce una sequenza particolare.
VETTORI
Sistemi utilizzati per inserire un certo costrutto
genico in particolari tipi di cellule, superando le
barriere di specie imposte dai normali processi
riproduttivi.
I possibili vettori sono 2 (i piu’ importanti):
1. Plasmidi;
2. Virus fagi;
VETTORI: PLASMIDI
Molecole extra-cromosomali di DNA circolare capaci di replicarsi e
di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale batterico.
Presenti in natura (batteri, lieviti, alcuni eucarioti superiori)
in stato di relazione parassitica o simbiontica verso la cellula ospite.
portatori di geni che arrecano un vantaggio selettivo
alla cellula ospite (es. resistenza a un antibiotico)
Possono ospitare DNA estraneo (con limiti di grandezza)
Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale
del batterio.
Caratteristiche essenziali dei vettori plasmidici:
1)
Origine di replicazione in E. Coli
2) Marcatore di selezione che permette ai
batteri trasformati di crescere su terreno
selettivo
INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO
IN UN VETTORE DI CLONAGGIO
I Plasmidi
Sono degli utili vettori in quanto si moltiplicano rapidamente
e sono facilmente inglobati dai batteri attraverso la
membrana cellulare. Sono però vettori affidabili solo per
segmenti lunghi fino a 4000 coppie di basi azotate, infatti
tollerano solo brevi sequenze di DNA estraneo, mentre i
segmenti lunghi tendono ad essere eliminati col passare delle
generazioni
I Virus fagi
Anche i virus possono fungere da vettori che spostano pezzi
di DNA da una cellula ad un’altra. Infatti il DNA dei fagi
temperati può integrarsi nei siti specifici del cromosoma
ospite e duplicarsi con il cromosoma stesso. I virus utilizzati
sono modificati in modo tale da non essere più patogeni, ma
da poter ancora trasmettere informazione genetica .
Il fago lambda come vettore di clonaggio
VIRUS FAGI
CLONAGGIO:
-PREPARAZIONE DI VETTORE
E INSERTO
- LIGASI
- TRASFORMAZIONE
- SELEZIONE
- CRESCITA COLONIE
IDENTIFICAZIONE
DELLA COLONIA
BATTERICA DI INTERESSE
Resistenza agli antibiotici:
Solo i batteri che hanno integrato un plasmide codificante il gene per
la resistenza possono crescere su agar nutritivo in presenza di
antibiotico
La tecnologia del Dna ricombinante è uno strumento potente di
analisi della struttura e della regolazione dei geni. Inoltre,
permette di aggirare gli ostacoli che si frappongono alla totale
libertà di scambio e mescolamento dei geni, permettendo la
combinazione di geni provenienti da specie molto distanti tra
loro.
In modo molto schematico, per isolare e clonare un gene di
interesse è necessario tagliare il cromosoma in frammenti
utilizzando un adatto enzima di restrizione con taglio
"sfasato". I frammenti ottenuti vengono mescolati con il Dna di
un plasmide vettore che presenti le stesse "estremità
appiccicose". Si ottengono così tanti piccoli anelli di Dna
formati dal frammento con il gene di interesse e il plasmide
legati insieme dalla Dna ligasi, l'enzima capace di "legare" fra
loro frammenti di Dna.
La molecola di Dna ricombinante così ottenuta viene introdotta
all'interno di un batterio ospite, il quale moltiplicandosi
produce grandi quantità del prodotto codificato dal gene
1.Il DNA viene tagliato
tramite specifici enzimi di
restrizione
2.Il plasmidio viene tagliato
con gli stessi enzimi
3.Il plasmide viene aperto
4.Il DNA, portatore del
gene isolato, vine incollato
al plasmidio tramite un
specifico enzima detto DNA
ligasi
5. Si forma un plasmidio
transgenico con la
resistenza all'antibiotico
datagli dal gene estraneo
Terapia Genica
Future targets
1. Gene identified
and cloned
2. Gene inserted into
harmless virus
carrier
3. T cells taken from
patient’s blood
4. T cells grown in lab,
then infected with
virus
6. T cells infused
back into patient
5. T cells start producing
life-saving enzyme
Hemophilia
Cancer
Cystic fibrosis
Tay-Sachs disease
Gaucher disease
Duchenne muscular dystrophy
Phenylketonuria
Sickle cell anemia
Parkinson’s disease
Diabetes
Familial cholesterol disorders
Alzheimer’s disease
Polycystic kidney disease
Early onset breast cancer
Progressive myoclonic epilepsy
IL MAIS
Il più noto alimento
transgenico è il mais
bt, molto più
produttivo rispetto al
fratello "naturale",
grazie alla capacità di
uccidere le larve di
lepidotteri e di
resistere agli erbicidi.
Il rischio e le biotecnologie
• rischi di variazione
• rischio di creazione (di organismi nuovi e
potenzialmente pericolosi)
L’inquinamento genetico produce nuovi
microrganismi che possono migrare e
riprodursi e cambiare a loro volta, rendendo
praticamente impossibile il controllo e la
reversibilità di processi di mutazione su base
genetica.
Il punto sulla ricerca
• Esistono barriere naturali che impediscono
la casuale mescolanza dei geni limitando il
numero di combinazioni possibili tra gli
individui che appartengono a una specie.
• In un certo senso, non c’è nulla di nuovo
nell’ingegneria genetica: sono diverse
migliaia d’anni che gli agricoltori(innesto)
cercano di migliorare le razze di animali e le
varietà di piante per ottenere caratteristiche
più interessanti
Oltre ad accelerare i programmi di ibridazione e
a migliorare le probabilità di successo, la
tecnologia genetica é in grado di combinare
materiale genetico in modi che in natura non
sarebbero spontaneamente possibili.
Per esempio copie di geni animali possono essere
introdotti nelle piante e copie di geni vegetali
possono essere inseriti nei batteri.
E' proprio questa potenzialità a sollevare quelle
preoccupazioni in merito all'etica e alla sicurezza,
Il mais dell Ciba-Geigy contiene il gene per una tossina
chiamata Bt (perchè ricavata da Bacillus thuringiensis), che
rende i tessuti della pianta capaci di sintetizzare la
glicoproteina selettivamente tossica per gli insetti dannosi,
ma innocua per tutti gli altri animali e per l'uomo.
Purtroppo nella costruzione di tali piante transgeniche è
stato usato come marcatore un gene per la resistenza
all'ampicillina, uno dei principali antibiotici sia nella medicina
umana che in veterinaria.
Non è ancora stata esclusa la possibilità che tale gene si
trasferisca alla flora batterica degli animali nutriti con
mangime a base di mais geneticamente modificato,
incrementando la già deplorata diffusione di ceppi batterici
resistenti agli antibiotici
Le regole della ricerca
L’ingegneria genetica, a differenza della
biotecnologia più tradizionale, non prevede
un rimescolamento totale, ma solo
l’inserimento di un gene, o di un gruppo
ristretto di geni, nel Dna di un’altra cellula.
La nuova proteina per es. può interferire con
quelle prodotte dall’animale: una volta che il
gene è inserito in un patrimonio genetico, si
può trasmettere ad altri, favorendo in seguito
nuove combinazioni.
• Un settore su cui si concentra l’interesse
dei ricercatori è la produzione di animali
resistenti alle infezioni, allo scopo di ridurre
l’impiego di antibiotici negli allevamenti.
• La complessità degli animali superiori
rende la manipolazione genetica molto più
difficile, e quindi più costosa, di quella relativa
ai vegetali.
• Dal latte di capra si ricava l’attivatore
tissutale del plasminogeno, che scioglie i
coaguli del sangue e che viene quindi
somministrato agli infartuati.
• Dal latte di alcuni conigli transgenici
viene estratta l’interleuchina-2, una
proteina umana implicata nella
regolazione del sistema immunitario che
viene somministrata ai malati di cancro
