la proliferazione cellulare

Principi di Oncologia
Sperimentale (2CFU)
Dal 16 gennaio al 6 marzo
Triennali Sc. Biologiche e Biotecnologie
Oncologia Sperimentale di
Laboratorio (3 CFU)
Dal 16 gennaio al 3 aprile
Magistrali tutte
1° S. BENINATI
LA PROLIFERAZIONE CELLULARE
- L’organizzazione multicellulare dipende da un programma di cooperazione
delle cellule che compongono l’organismo.
- La differenziazione tissutale segue un piano ben preciso.
- In un organismo maturo le cellule sono limitate nella loro intrinseca spinta
a moltiplicarsi a seconda dei loro territori, seguendo un preciso piano di
sviluppo.
- Questo meccanismo dipende dalla comunicazione tra le cellule, in modo
che ogni cellula che occupa il suo posto specifico possa collaborare nel
piano di sviluppo e di moltiplicazione secondo l’economia dell’organismo.
Proliferazione normale
La proliferazione normale dipende da vari eventi:
1.Fattori di crescita: la disponibilità dei fattori di accrescimento specifici
per ogni tessuto è alla base della crescita cellulare, l’insufficenza di questi
fattori porta alla morte cellulare
2.Dipendenza dall’ancoraggio: la proliferazione viene regolata attraverso
interazioni transmembrana di proteine dette integrine, che fanno parte
degli elementi della matrice extracellulare (ECM). Specifiche integrine
riconoscono specifiche molecole di ECM.
3.Inibizione da contatto: il contatto con il medesimo tipo di cellule
inibisce il movimento e la proliferazione cellulare. Il contatto con cellule
di diverso tipo favorisce la motilità e la migrazione spontanea.
4. Riduzione della capacità di proliferazione: le cellule somatiche dei
vertebrati si dividono un numero limitato di volte (50-70) prima di entrare
in uno stato di senescenza e mantenere una attività metabolica, senza
alcun’altra possibilità di divisione. Questo fenomeno è chiamato “Limite
di Hayflick”
Ancoraggio sostanza fondamentale con il
citoscheletro cellulare
S.Beninati
Il blocco della crescita cellulare, denominato senescenza , è stato ipotizzato da
Hayflick* come meccanismo soppressivo della crescita tumorale e in grado di
limitare quindi la capacità replicativa di una cellula tumorale incipiente .
Inizialmente accolta con scetticismo, l'esistenza di senescenza e la sua
importanza come meccanismo tumore soppressiva è ormai accettata .
*Hayflick, L. (1965) The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 37: 614-636.
Recentemente** è stato riportato, che mentre le cellule senescenti non possono
produrre una neoplasia, come citato da Hayflick*, esse possiedono la capacità di
promuovere la crescita delle cellule preneoplastiche nei dintorni e in questo
modo possono contribuire all’aumentata incidenza tumorale legata all'età.
**Pazzolli E. & Stewart SA. (2008) Senescence: the good the bad and the dysfunctional. Curr. Opin. Genet.
Dev.18(1):42-47.
Proliferazione anormale
Un programma di segnali e di sistemi di regolazione controllano la proliferazione
cellulare.
Questo equilibrio può essere distrutto da una varietà di fattori, come alleli mutanti
ereditati dagli ascendenti, mutazioni somatiche insorte nell’organismo e
cambiamenti epigenetici^ che alterano il livello di espressione dei geni.
^
I cambiamenti epigenetici del DNA sono modificazioni chimiche che sono coinvolte nella modificazione
dell'espressione di geni. La metilazione del DNA permette il silenziamento di un gene mentre l'acetilazione degli istoni
aumenta la trascrizione. Non è coinvolta quindi l'alterazione del genotipo,
fattori che possono portare alla trasformazione
cellulare
L’immortalizzazione (capacità di moltiplicazione indefinita in vitro) e
l’aneuploidia: le cellule diploidi arrivate allo stadio della senescenza, a volte danno
origine a delle linee clonali che sopravvivono e si moltiplicano continuamente senza
alcun limite. Generalmente la transizione passa attraverso cambiamenti telomerici^
risultanti in riarrangiamenti cromosomici e in aneuploidia^^.
^
Il telomero è la regione terminale del cromosoma che produce trascritti che si ipotizza siano implicati nella regolazione
della telomerasi. La telomerasi è un enzima che aggiunge sequenze ripetitive di DNA non codificante, riallungando così i
telomeri accorciati in modo da mantenere integri i cromosomi. In assenza dei telomeri la replicazione del DNA comporterebbe
dopo ogni replicazione una significativa perdita di informazione genetica. Il progressivo accorciamento dei telomeri ad ogni
ciclo replicativo appare associato all'invecchiamento cellulare.
^^
L'aneuploidia è una variazione nel numero dei cromosomi, rispetto a quello che normalmente caratterizza le cellule di un
individuo della stessa specie. L'aneuploidia è quindi una anomalia cromosomica.
fattori che possono portare alla trasformazione
cellulare
Parziale o completa mancanza di dipendenza dal Growth Factor: le
cellule in trasformazione possono acquistare l’abilità di crescere nel siero
più diluito o in presenza di una minore iniziale densità cellulare.
Perdita dell’ancoraggio. Perdita della inibizione da conatto tipica delle
cellule normali
Perdita dell’inibizione del movimento: in conseguenza del deficit dei
segnali per l’adesione fra le cellule.
Svincolo dal meccanismo dell’apoptosi. La morte cellulare programmata
necessaria per il ricambio cellulare non influenza le cellule trasformate
Aumento dell’angiogenesi. Lo sviluppo di una circolazione accessoria
che porta nutrimento a gruppi cellulari trasformati favorendone lo sviluppo.
Gene
normale
Gene
mutato
difettoso
IL TUMORE
In patologia, un tumore o neoplasia è una massa abnormale di tessuto
che cresce in eccesso e in modo scoordinato rispetto ai tessuti normali, e
persiste in questo stato dopo la cessazione degli stimoli che hanno
indotto il processo
La crescita incontrollata e scoordinata, a scapito
dell‘omeostasi tissutale, di un gruppo di cellule è
determinata da alterazioni del loro patrimonio
genetico, ed è alla base di una vasta classe di malattie
Queste malattie sono classificate per diverse caratteristiche, ma
principalmente in tre modi:
1. secondo il tipo istologico originario delle cellule proliferanti,
principalmente in tumori epiteliali, mesenchimali, delle cellule dl
sangue o del tessuto nervoso
2. secondo l'aggressività e il decorso clinico previsto, in tumori
benigni (non cancerosi) e tumori maligni (cancerosi, o cancro);
3. secondo la stadiazione tumorale, o Classificazione TNM , per
quanto riguarda i tumori maligni.
Affinché una cellula diventi tumorale, deve accumulare una serie di
danni al suo sistema di controllo della riproduzione. Infatti il cancro è
una malattia genetica delle cellule somatiche. Tutte le cellule cancerose
e precancerose presentano alterazioni, spesso molto estese, del loro
assetto cromosomico (cariotipo): il numero di cromosomi presenti nel
loro nucleo può essere alterato e i cromosomi stessi sono danneggiati,
multipli o mancanti (aneploidia).
Popolazione Cellulare Clonale
L'alterazione cromosomica delle cellule tumorali è talmente estesa da
fornire la prova che in ogni caso di tumore tutte le cellule cancerose
discendano da una unica cellula madre mutata (popolazione cellulare
clonale)
Tutte le cellule tumorali infatti condividono la stessa esatta forma di danno
genetico, tanto complessa da rendere altamente improbabile l'eventualità
di due cellule madri diverse che hanno subito per caso la stessa serie di
mutazioni.
Alla base della patogenesi del tumore c'è la mutazione di
determinati geni:
i proto-oncogeni, o oncogeni
i geni oncosoppressori o antioncogeni
i geni coinvolti nella riparazione del DNA.
Proto-oncogeni
Un oncogene è un gene modificato, o una serie di nucleotidi che
codificano una proteina, che indirizzano la cellula verso lo sviluppo di un
fenotipo neoplastico.
Solitamente gli oncogeni intervengono nello sviluppo tumorale e
aumentano le possibilità che lo sviluppo (proliferazione e
differenziamento) di una cellula si diriga in senso tumorale.
Nuove ricerche indicano che piccoli RNA di 21-25 nucleotidi, detti
miRNA, possono controllare tali geni attraverso la downregolazione.
antioncogene
Gene, detto anche gene oncosoppressore, che inibisce la proliferazione
cellulare. Un gene oncosoppressore è un gene che codifica per prodotti
che agiscono negativamente sulla progressione del ciclo cellulare
proteggendo in tal modo la cellula dall'accumulo di mutazioni
potenzialmente tumorali.
Le mutazioni necessarie che una data cellula deve accumulare per dare
origine a un cancro sono i seguenti, e sono comuni a tutti i tipi di cancro:
1.
acquisizione dell'autonomia moltiplicativa per sopravvenuta incapacità a
sottostare ai meccanismi regolatori della proliferazione cellulare;
2. assenza di inibizione dipendente dalla densità (le cellule normali si
moltiplicano fino a una definita densità cellulare, raggiunta la quale diventano
quiescenti);
3. ridotta capacità di adesione con altre cellule o componenti tissutali;
4. assenza di matrice extracellulare (spesso digerita da proteasi dette metalloproteasi, )
che favorisce l'invasione di tessuti normali adiacenti;
5. Angiogenesi formazione di nuovi vasi sanguigni per fornire ossigeno e fattori
nutritivi alle cellule tumorali;
6. riduzione o perdita della capacità differenziativa;
7. acquisizione della capacità di replicazione illimitata per effetto dell'espressione della
telomerasi;
8. riduzione o perdita della possibilità di andare incontro a morte cellulare programmata
(apoptosi).
9. perdita della cosiddetta inibizione da contatto.
TERAPIA
In generale, la terapia del cancro - per quanto riguarda l'obiettivo di
guarire l'organismo malato, di ridurre l'estensione della malattia
ottenendo una regressione parziale, o di rallentarne la progressione si basa sull'applicazione di una serie di tecniche diverse integrate fra di
loro, con protocolli specifici per lo specifico tipo di cancro e per le
caratteristiche del paziente, ferma restando la libertà di scelta del
paziente fra i diversi approcci possibili e il suo consenso informato al
protocollo proposto.
Poiché il cancro colpisce più frequentemente la popolazione anziana,
in molti casi la regressione parziale o anche il semplice rallentamento
della progressione equivale, in sostanza, alla guarigione completa, in
quanto libera il malato dai sintomi di malattia per tutto il suo periodo di
vita residua.
Le tecniche utilizzate sono:
la chirurgia
la radioterapia
la chemioterapia
l'ormonoterapia
la immunoterapia
l'ipertermia
E altre tecniche (termodistruzione con radiofrequenze; alcoolizzazione;
crioterapia;
embolizzazione
e
chemioembolizzazione),
appannaggio della radiologia interventistica
in
genere
I tumori si suddividono in:
"benigni", sono costituiti da cellule che mantengono in parte le loro
caratteristiche morfologiche e funzionali, pur esibendo autonomia
moltiplicativa. Essi sono caratterizzati da un tipo di sviluppo detto
espansivo, perché comprime i tessuti vicini senza distruggerli: i
tumori benigni che originano dall'epitelio ghiandolare (adenomi) sono
spesso avviluppati da una capsula di tessuto connettivo fibroso che li
delimitano nettamente dai tessuti confinanti, coi quali assumono un
rapporto di contiguità.
"maligni" o "cancro", sono invece costituiti da cellule che appaiono
morfologicamente e funzionalmente diverse dalle corrispondenti normali.
L'atipia morfologica, che è tanto maggiore quanto più indifferenziato è il
tumore, si manifesta con mancanza di uniformità nella forma e nelle
dimensioni delle cellule (polimorfismo) e degli organi cellulari, in
particolare del nucleo, che è frequentemente ipercromico ed in fase
mitotica. I tessuti vicini al tumore maligno vengono invariabilmente
infiltrati e distrutti dalle cellule tumorali che si sostituiscono a quelle
normali, fenomeno questo caratteristico della malignità e noto col
termine "invasività neoplastica".
Aspetti citologici di malignità
Mitosi Atipiche
• Le figure mitotiche sono presenti in tutte le
iperplasie, cioè tessuti in rapida crescita.
• Nelle lesioni maligne molte figure mitotiche
sono atipiche o mitosi multiple
M
M
Mitosi ad anello
Gradi di differenziamento del tumore
• Le cellule tumorali possono essere simili al
tessuto dal quale hanno avuto origine:
• Il tumore si definisce ben differenziato
Tumore scarsamente differenziato
• Se le cellule ricordano scarsamente il
tessuto di origine la neoplasia si definisce
come:
• Scarsamente differenziata
Tumore anaplastico
• La scomparsa totale della somiglianza con
il tessuto d’origine conduce alla:
• Tumore anaplastico
lume
Cellule mucipare
(Ricche di muco)
Nuclei delle cellule
epiteliali colonnari
(piccoli)
Mucosa normale del colon
Neoplasia begnina del colon
Cellule mucipare
(Povere di muco)
Nuclei delle cellule
epiteliali
(grandi e disordinati)
Porzione basale
Neoplasia maligna del colon ben differenziata
Assenza di mucina
Forma prismatica delle
cellule conservata
Nuclei irregolari per
forma e disposizione
Nuclei stratificati e
ipercromici
Nucleoli grandi e
irregolari
Neoplasia maligna del colon scarsamente differenziata
Mitosi atipiche
Variabilità della forma e
delle dimensioni cellulari
Pleomorfismo cellulare
Nuclei disomogenei
Pleomorfismo nucleare
Scarsa somiglianza con il
tessuto d’origine
Nuclei colorati
Ipercromatismo nucleare
"borderline",
in
alcuni
casi,
i
tumori
presentano
un
comportamento intermedio fra la malignità e la benignità (tumori
"borderline") o risultano inclassificabili (tumori a comportamento
biologico incerto). In questi casi, generalmente la frequenza
delle metastasi è molto bassa e il decorso è lento
Il processo metastatico
Il processo metastatico
• Quando il numero di cellule tumorali diviene
visibile clinicamente, il tumore si definisce
primario.
• Alcune cellule del tumore primario
acquisiscono la capacità di penetrare e di
infiltrare il sistema ematico e linfatico
formando le metastasi
1.
2.
3.
4.
5.
Cellule tumorali in crescita
Le cellule si staccano dal tumore primario e invadono il sangue o la linfa
Le cellule viaggiano attraverso il sangue o la linfa in altre parti del corpo
Lasciano il letto ematico o linfatico e penetrano nei tessuti
Si dividono formando tumori secondari o metastasi
• La formazione delle metastasi è un processo
complesso che deriva dalla proprietà, acquisita
dalle cellule tumorali maligne, di degradare le
proteine presenti in una barriera naturale
presente sotto gli epiteli e sotto gli endoteli, la
membrana basale.
emazie
leucocita
ADHESION E.C.
PROTEOLYSIS
ADHESION B.M.
INVASION
angiogenesi
• Uno degli eventi critici necessari per la
crescita del tumore è la formazione di una rete
capillare che possa nutrire le cellule tumorali.
• Questo processo è denominato Angiogenesi.
Vaso ematico dell’ospite
Rete capillare
tumore
Sistema arterioso
Sistema venoso
Farmaci citotossici
• Il controllo della crescita neoplastica si
attua
influenzando
i
processi
di
proliferazione cellulare, inducendo il
differenziamento e la morte cellulare
• Un farmaco si definisce citotossico quando
uccide la cellula neoplastica.
• La chemioterapia attuale utilizza farmaci
citotossici
Farmaci differenzianti
• Un’alternatica alla terapia citotossica è la
terapia differenziativa.
• In questo caso il farmaco induce il
differenziamento della cellula neoplastica
e blocca la proliferazione.
Test di laboratorio
• Per dimostrare che un farmaco possieda
attività differenziante è necessario
effettuare una serie di prove di laboratorio.
• Misure della proliferazione cellulare
• 1. curve di crescita
• 2. conta cellulare
• 3. vitalità cellulare
Metaboliti
• Anche la ricerca di metaboliti legati alla
crescita tumorale può essere utile
• Tali molecole vengono denominate
“Markers”
• I markers studiati nel nostro laboratorio
sono:
• Poliammine come fattori di crescita
• Enzima transglutaminasi come marker di
differenziamento
Linee cellulari
• Si usano come modello di crescita
cellulare neoplastica
• Noi useremo come campione il melanoma
sia umano che murino
• Una delle caratteristiche del melanoma è
che durante il differenziamento producono
melanina
• Un pigmento nero
Modelli di studio
Il melanoma
Il melanoma
Il melanoma è un tumore cutaneo maligno che origina dai melanociti, cellule dello
strato basale dell’epidermide responsabili della produzione di melanina.
Sebbene la neoplasia insorga principalmente nella pelle, esistono altri siti possibili,
tra cui la mucosa nasale ed ano-genitale, l’esofago, le meningi e l’occhio
Melanoma Superficiale
Melanoma Nodulare
Lentigo Maligna
Melanoma Acro-lentiginoso
Melanoma Muco-lentigginoso
Melanoma Amelanotico
L’aspetto di ogni melanoma può variare ma, generalmente, mostrano tutti le
caratteristiche definite ABCD
Asimmetria: le due metà del neo non hanno stessa forma.
Bordo: i bordi sono spesso sfumati e dal contorno irregolare.
Colore: il colore è irregolare. Il neo presenta sfumature di colore nero e marrone,
si osservano inoltre zone bianco, rosso, rosa o blu.
Diametro: le dimensioni del neo cambiano.
Asimmetria
Bordo
Colore
Diametro
Vengono adottati vari sistemi di classificazione per descrivere la profondità di
invasione: il più utilizzato è il Metodo di Clark e quello di Breslow (BW)
In particolare:
- lesione di Clark di 1° livello, è un melanoma in situ confinato all’epidermide;BW 1
- lesione di Clark di 2° livello, caratterizzata da piccoli nidi e cellule singole nel derma
papillare; BW 2
- lesione di Clark di 3° livello, il tumore invade il derma papillare; BW 3
- lesione di Clark di 4° livello, la lesione invade il derma in profondità (strato
reticolare);BW 4
- lesione di Clark di 5° livello, il melanoma invade il tessuto sottocutaneo. BW 5
ESAME MORFOLOGICO
Control
Linea cellulare di melanoma
murino (B16-F10)
Cellule non trattate
AE
Cellule trattate con molecola
differenziante (bassa conc)
Morfologia stellata
AE
Cellule trattate con molecola
differenziante (alta conc)
Presentazione di un lavoro di
oncologia sperimentale
• Trattamento di melanomi umani e murini
con molecole differenzianti
• Vari test di proliferazione e di invasione
• Ipotesi di metabolismo coinvolto nel
controllo della crescita tumorale
• Poliammine e transglutaminasi
polyamines
protein cross-linking
- Theophylline
- other activators
motility
TGase activity
Polyamination of BM proteins
adhesion
BM digestion
BM
Controllo B16-F10
B16-F10 differenziate
ADHESION E.C.
PROTEOLYSIS
ADHESION B.M.
INVASION
Capillary lumen
Tumor cell
LN-R
LN
Target tissue
Integrins
BASEMENT MEMBRANE
COMPONENTS
Laminin
IV
factors
Collagen
Entactin
Growth
Invasion
(Boyden Chamber assay)
medium
Matrigel
filter
chemoattractant
Control
48h
72hr
120
100
% invasion
80
60
40
20
0
Control
48h
72h
I PARAMETRI CHE VENGONO CONTROLLATI PER AVERE LA CERTEZZA
CHE UNA DATA MOLECOLA POSSA ESERCITARE POTERE
ANTIPROLIFERATIVO E/O ANTIMETASTATICO SU DI UNA LINEA
CELLULARE O SULL’ORGANO BERSAGLIO DI UN ANIMALE
1.
VITALITA’ CELLULARE
2.
PROLIFERAZIONE CELLULARE
3.
ANALISI MORFOLOGICA AL MO
4.
SEGNI DI DIFFERENZIAMENTO
5.
POTERE METASTATICO
6.
POTERE INVASIVO
7.
METALLOPROTEASI
8.
TRANSGLUTAMINASI
9.
POLIAMMINE
10. MELANINA
11. APOPTOSI
12. ANGIOGENESI