Diapositiva 1 - Axada Catania

Università degli Studi di Catania
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Scuola di Specializzazione in Genetica Medica
Dottorato di Ricerca in Malattie Genetiche dell’Età
Centro di Riferimento Regionale
per la Diagnosi e Cura delle Malattie Genetiche
Teresa Mattina
Integrità del genoma
L’integrità del genoma è fondamentale
per la sopravvivenza e la funzione e
la riproduzione cellulare.
Anche una singola mutazione può
impedire o danneggiare gravemente
lo sviluppo di un organismo
Nuove mutazioni

Frequenza
proporzionale alla
gravità della
patologia
 Un terzo delle DMD
sono nuove
mutazioni
Integrità del genoma
La cellula possiede meccanismi
intrinseci, codificati nel DNA, che le
garantiscano la capacità di
mantenere l’integrità del genoma
riparando i danni del DNA.
 Integrità
del genoma
 Plasticità
del genoma
Integrità del genoma
Un sistema rigido nel mantenimento della sequenza
del DNA non permette l’evoluzione.
La sopravvivenza delle specie nel lungo periodo
richiede la possibilità di adattamento a nuove
condizioni fisiche e biologiche dell’ambiente
Integrità del genoma
La cellula possiede meccanismi
intrinseci al DNA, che le
garantiscano la capacità di adattarsi
ai cambiamenti ambientali.
Mutazioni e selezione
Il DNA è soggetto fisiologicamente al
verificarsi continuo di rimaneggiamenti
casuali.
I rimaneggiamenti del DNA vengono
continuamente corretti: ciò tutela
dell’integrità del genoma, ma consente
l’evoluzione.
Le Mutazioni- la selezione
I rimaneggiamenti del DNA che si integrano
nel genoma cellulare: mutazioni

comportano danno cellulare vengono
selettivamente perduti nelle successive
generazioni cellulari.

conferiscono vantaggio cellulare vengono
mantenuti nelle successive generazioni
cellulari.
Le Mutazioni- la selezione
Mutazioni che causano danno cellulare
•Ridotta o anomala funzione
cellulare
•Ridotta velocità di replicazione
cellulare
•Alterazione delle
caratteristiche antigeniche
•Generazione di anticorpi
•Attivazione dei macrofagi
Morte cellulare
Invecchiamento tissutale
Le Mutazioni- la selezione
Mutazioni che conferiscono vantaggio cellulare
•Ridotta o anomala funzione
cellulare
•Aumentata velocità di
replicazione cellulare
Iperplasia
Neoplasia
•Alterazione delle caratteristiche
antigeniche
•Generazione di anticorpi
•Attivazione dei macrofagi
Danno sul DNA
1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo
Metabolismo
Cellulare
Attivazione
dei
Checkpoints
UV
Attivazione
dei fattori
trascrizionali
IR
Agenti
Chimici
Sistemi di riparo:
BER,
NER,
MMR,
HER
Errori di
Virus
Replicazione
Apoptosi
DNA RIPARO
Arresto ai checkpoints
Attivazione sistemi di riparo
Induzione di APOPTOSI
p16
ARF
pRb
p53
p21
ATM
S
G1
G2
M
p21
ATM
1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo
Metabolismo
Cellulare
Attivazione
dei
Checkpoints
UV
Attivazione
dei fattori
trascrizionali
IR
Agenti
Chimici
Sistemi di riparo:
BER,
NER,
MMR,
HER
Errori di
Virus
Replicazione
Apoptosi
1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo
Agenti
Metabolismo
Cellulare
Errori di
Virus
UV
Replicazione
Esposizione
adIRagenti Chimici
mutageni
Attivazione
dei
Checkpoints
Attivazione
dei fattori
trascrizionali
Sistemi di riparo:
Apoptosi
Anomalie della riparazione del
BER, DNA
NER,
MMR,
HER
DNA RIPARO
Difetti del DNA RIPARO

Invecchiamento precoce dei tessuti a
rapida proliferazione
– Cute
– Mucose
– Linfociti

Degenerazione tessuti
– SNC

Neoplasie
Difetti del DNA RIPARO
S. Bloom
Acrosteolisi?
Atassia telangectasia
Metodi di studio

Studio di crescita clonale

Studio dei cromosomi

Studio dei micronuclei

COMET
Metodi di studio cromosomico

Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche
spontanee

Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche
indotte

Analisi degli scambi fra cromatidi fratelli SCE

Analisi citogenetica costituzionale
Studio cromosomico del tessuto neoplastico

Metodi di studio cromosomico

Ricerca delle rotture
cromosomiche/cromatidiche spontanee o
indotte su 100 metafasi
Indice mitotico
Percentuale di cellule con rotture
Numero di rotture per cellula
Metodi di studio cromosomico

Ricerca delle rotture
cromosomiche/cromatidiche spontanee o
indotte su 100 metafasi
Conta delle rotture per cellula
Numero di rotture/100
Conta delle rotture per cellula
Percentuale di cellule con rotture
Conta
Contadelle
dellerotture
rottureper
percellula
cellula
Percentuale
Percentualedi
dicellule
cellulecon
conrotture
rotture
Conta
Contadelle
dellerotture
rottureper
percellula
cellula
Percentuale
Percentualedi
dicellule
cellulecon
conrotture
rotture
Tipo di danno cellulare
25
CGG-CGG-CGG-CGG
CGG-CGG-CGG-CGG
CGG-CGG-CGG
CGG-CGG- CGG-CGG-CGG
SCE
SCE
SCE Ciclo cellulare
I divisione
II divisione
III divisione
SCE
Tipo di danno cellulare
25
Metodi di studio cromosomico
Analisi
degli scambi fra cromatidi fratelli SCE
Rotture normali
Rotture aumentate
SCE normali
SCE aumentati
Metodi di studio cromosomico

Analisi citogenetica costituzionale
 Studio cromosomico del tessuto
neoplastico
Cariotipo standard
Riarrangiamenti clonali
FISH
•Denaturazione
•Scelta della sonda
•Ibridazione
•Lettura
SONDE FISH





Yac: 100-150kb-2Mb
Bac: fino a 330kb di DNA
Cosmidi: fino a 40kb di DNA
Fagi: fino a 14-15kb di DNA
Plasmidi: fino a 4-5kb di DNA
Sonde per FISH
Painting:
 identificare
materiale da
uno
specifico
cromosoma
FISH
M-FISH
• Immagini catturate separatamente per ciascun
fluorocromo utilizzando filtri ottici modificati
• Immagini elaborate da uno specifico software
SKY
• Acquisizione delle
immagini: microscopio
ad epifluorescenza,
immagini chargecoupled device (CCD)
e spettroscopio Fourier
• Misurazione dell’intera
emissione dello spettro
con una singola
esposizione di tutte le
immagini
SKY-M-FISH
Sono particolarmente utili per:
• Evidenziare traslocazioni
• Identificare marker cromosomici, regioni colorate in
modo omogeneo, duplicazioni cromosomiche
• Individuare alcuni riarrangiamenti complessi
Array CGH
Array CGH
M-CGH
Array-CGH
Metodi di studio

Studio dei micronuclei
Metodi di studio cromosomico

COMET
Cellule inglobate in
agarosio su vetrino
Lisi delle cellule in situ
Elettroforesi su
vetrini
Colorazione del
DNA
Analisi con
microscopio a
fluorescenza
Diametro della testa circa 40 m
Strumentazione per l’analisi del danno al
DNA mediante
COMET ASSAY
A
B
Microscopio a fluorescenza
collegato con il computer
che analizza i risultati tramite
software opportuno
A: Esempio di “cometa”
B: Cellula con DNA integro
Studi genotossici
Riparazione del DNA
Analisi di apoptosi
Biologia dei radicali liberi
Tossicologia alimentare
Biomonitoraggi
Indagini cliniche
Analisi del ciclo cellulare
VERSIONE ALCALINA
VERSIONE NEUTRA
8000
7000
6000
A
5000
B
4000
C
3000
D
CTRL
2000
1000
0
TEMPO 0
TEMPO 1
TEMPO 2
TEMPO 3
TEMPO 4
DNA in equilibrio
Predisposizione Genetica
Fattori ambientali
• Checkpoint
• Enzimi del DNA riparo
• Metabolismo
• Metabolismo cellulare
• Agenti fisici UV, RI,
• Agenti chimici: ossidanti,
benzene, fumo di sigaretta,
caffè, farmaci
• Virus
• Carenze vitaminiche (vit. C,
acido folico)
Genotipo
DNA
Replicazione
Riparo
Trascrizione
RNA
Traduzione
Proteine
Recettori
Fenotipo
Fattori ambientali

ROMA (ANSA 11.05.06) - Sono circa 14.000
l'anno i casi stimati di tumore tra gli
adolescenti e i giovani adulti (tra 15 e 39
anni) in Italia, ……..………….crescono i
tumori in qualche modo legati ai cattivi stili
di vita, a partire dal fumo di sigaretta e la
mania per l'abbronzatura.