L`argomento di oggi riguarda la “citofluorimetria - Digilander

Medicina di labo
Profssa SCUDERI
13/06/2006
8:30-10:30
citofluorimetria a flusso e sorting
L’argomento di oggi riguarda la “citofluorimetria a flusso e sorting”
Vi presentiamo quelli che sono i concetti di base e le applicazioni della citofluorimetria di tipo
clinico.
Il termine “sorting” è un’applicazione ulteriore della citofluorimetria a flusso che permette non
solo l’identificazione del tipo cellulare ma anche la separazione dei diversi tipi cellulari.
Concetti di base
Nella citofluorimetria si misura alcune proprietà delle cellule che vengono analizzate mentre sono
sottoposte ad un flusso continuo nel senso che fluiscono libere all’interno di una fase fluida e la
singola cellula viene analizzata con la sua proprietà.
Il “sorting” invece permette la separazione delle cellule in base alle proprietà e caratteristiche che
sono state valutate con il sistema dell’analisi in flusso.
Il termine FACS che si intende di sorting , in realtà si parla di sorting mentre nell’uso corrente si
usa come sinonimo di citofluorimetria a flusso a scopo analitico .
La citofluorimetria può contare delle particelle che sono in sospensione, può separare le cellule
viva da morte e questo basato sul principio che bisogna però valutare la vitalità delle cellule
attraverso il citofluorimetro.
Ha una capacità di analisi molto rapida perché può valutare dalla dieci alla quinta alla dieci alla
sesta particelle in meno di un minuto, contemporaneamente fa valutazioni di tipo ottico semplice
che registrazione fluorescenza può fare un’altra fluorescenza quindi è un sistema multivalente
perché può conteporanemante valutare diversi aspetti sulla singola particella.
Come funziona la citofluorimetria?
Dobbiamo distinguere tre sistemi:
1. Il sistema fluidica
2. Il sistema ottico
3. Il sistema elettronico
Il Sistema fluidica è quel sistema di pompe e di canali che permette di fare fluire le cellule in
sospensione in una singola fila attraverso un canale chiamato “ canale di lettura” che permette alla
singola cellula di passare al sistema ottico dove la cellula passa attraverso una finestra ed è colpita
dalla luce ed è in condizione di riflettersi ed eventualmente con la fluorescenza innata o acquisita
perché possiamo conferirla, può essere registrata sul sistema elettronica che ci darà tutti gli eventi
osservati e archiviati sul computer, l’osservatore verrà solo i risultati dei dati elaborati dal computer.
Il citofluorimetrio è in condizione di darci indicazione sulle dimensione cellulare oltre le
caratteristiche strutturale della singola cellula.
Grafico 1.
LEGENDA
E = SUBSISTEMA PNEUMO-FLUIDICO ( Compressore, Filtro aria, Taniche, Regolatori)
F = SUBSISTEMA CELLA A FLUSSO ( Cella, supporto e Porte, Barra di oscuramento )
G = SUBSISTEMA SORGENTE LASER ( Tubo Laser , Ottiche di collimazione )
H = SUBSISTEMA OTTICHE, PIN DIODE, I/V CONVERTER ( Angolo di raccolta : 0° )
A = SUBSISTEMA OTTICHE, 3 PMT's, I/V CONVERTERS ( Angolo di raccolta : 90° )
B = SUBSISTEMA PULSE PROCESSING, PEAK/HOLD, MUX INPUTS ADC 10 BITS
D = SUBSISTEMA WORKSTATION DEDICAT
Si le condizione del flusso del sistema fluidica sono correte cioè fluido laminare vedremo nel
sistema ottica chi può aver 2 tipi di sorgente luminosa focalizzata nel punto del flusso dove la
cellula è canalizzata : laser o sistemi di lampada a riscaldamento maggiore o minore.
Da punto di vista funzionale le laser ha maggiore efficiente, puo avere una luce di lunghezza
d’onde unica o una miscela di lunghezza d’onde, il sistema di lampada è piu economico e contiene
una miscela di lunghezza d’onde per esempio con 3 fluorescenze diversi con eccitazione diversi si
puo arrivare a classificare contemporaneamente diversi tipi di cellule a lunghezze d’onde diversi
selezionati dal sistema ottica con dei filtri dicroici che hanno la capacità di riflettere una particolare
lunghezza d’one e di fare passare tutte le altre cosi si distingue ciascun lunghezza d’onde.
Cosa legge un citofluorimetrio?
Ci sono diversi sensori in un sistema ottica , un sensore posto frontalmente al raggio di luce e dal
lato opposto al canale dove fluiscono le cellule che registra l’emissione della luce e si parla dello
scarter forward o frontale, la luce sarà difratata e diffusa dalla cellula in funzione delle sue
dimensione (una differenza tra granulocita e una linfocita). L’intensità della luce frontale sarà
proporzionale alla forma , alle dimensione e all’omogeneità ottica .ci una informazione strutturale e
di dimensione.E piu sensibile alle proprietà superficiale delle cellule e serve per dare il numero
delle cellule vive da morte.
Con un sensore laterale a 90 gradi(scarter laterale o side scarter) , la luce sarà in confronto alla
disomogeneità ottica della particelle (granulocita sarà superiore al linfocita) ,difraggerà
lateralmente tanto piu è omogeina la particella .E piu sensibile alle inclusione della cellule,alle
complessità intracellulare (sarà maggiore per le cellule granulate dalle cellule non granulate).
Ci sono una seria dei fotomultiplicatori che ricevono e analizzano le bande di emissione di luce che
possono essere verde,rossa,blue…. alla lunghezza d’onde selezionate dalle filtri dicroici,chi isolano
la luce della lunghezza d’onde ad analizzare .
Adesso parliamo dei fluorocromi che sono molecole utilizzati per marcare altre molecole
assorbendo la luce ad una lunghezza d’onde per passare da uno stato quiescente ad uno eccitato e
emettono la luce e ritornano ad una lunghezza d’onde piu basso,cosi si puo distinguere la luce
dell’assorbimento della luce dell’emissione.
Grafico 2
Nel grafico 2 abbiamo l’immagine elaborata al computer dei diversi luce ai lunghezza d’onde .
Tipi di fluorocromi utilizzato:
1.PE: phicoedithina
2.Texas red:emette su rossa
3.Ethidim
4.FITC:fluoresceina
La banda di eccitazione del fluorocromo è a lunghezza d’onde inferiore quasi 500nm e la banda di
emissione è a lunghezza d’onde superiore.
L’analisi fluorometrico deve essere fatto subito dopo la preparazione delle cellule per non perderle e
le marcature .
Nelle routine diagnostiche si puo utilizzare questo metodo per studiare le globuli bianchi,con una
lettura frontale e laterale dello scater di una campione del sangue solo con linfociti,i granulociti
saranno localizzati in alto e a destra , i monociti in posizione intermedio perché sono meno
complessi invece i linfociti a sinistra e inferiormente,cosi isolando solo i linfociti si puo selezionare
e fare il”gate”di letture su una particolare popolazione cellulare.
Grafico 3
Solo per la popolazione dei linfociti.
Presentazione dei dati
Abbiamo diversi tipi di presentazione dei dati dal computer:
-Istogramma:ci dà la distribuzione delle frequenze degli eventi all’intensità di fluorometria,quindi ci
dà l’immagine dell’omogeneità del marcatore cellulare utilizzato sul tipo cellulare in analisi.
-Dot blot:l’intensità del colore ci dà l’indicazione della frequenza degli eventi.
-Contour plot:ci dà l’identificazione il sottopopolazione con appropriati linee di contorno con una
omogeneità .
-3D-space:ci dà la distribuzione cellulare in modo tridimensionale.
Analisi della fluorescenza
(si riferisce ad un grafico)
Per l’analisi della registrazione della fluorescenza da una istogramma semplice avremo un grafico
con 2 picchi,il picco a sinistra piu piccolo rappresenta la quota cellulare non marcata dal
fluorocromo mentre il picco a destra rappresenta quota cellulare positive per il marcatore.
Sorting cellulare
Avendo la quota cellulare positive per il nostro marcatore, io posso innescare un sistema di
separazione di queste cellulare per il sorting quando il numero di cellule viene letto dal
citofluorimetria. La separazione cellulare si fa in base alla polarità cellulare con 2 piastra cariche
elettricamente che mi danno una differenza di potenziale all’interiore del canale ottico, le cellule
vengono raccolte in diverse provette secondo la loro carica. Queste tecnica dà dei buoni risultati
solo con un campione con un numero di cellule alto.
Campi di applicazione
La prima applicazione è nell’analisi di DNA e RNA per studiare il ciclo cellulare, l’apoptosi
cellulare nella vitalità cellulare.
In microbiologia viene applicato per identificare i microrganismi , per studiare la sensibilità degli
antibiotici
In immunologia e in patologia per l’immunofenotipizzazione che frutta la presenza dell’Ag sulle
linfociti che saranno legate alle Ac monoclonale in modo specifico o non specifico poi viene
coniugato con un marcatore fluorescente facile da riconoscere . fondamentalmente nella
caratterizzazione delle globuli bianche, nell’identificazione delle sottoclassi
linfocitari,nell’ematologia nella classificazione dei linfomi e leucemie, con l’utilizzazione di Ac
monoclonale per identificare il singolo Ag rispettive e viene marcato per la lettura.
Con una marcatura diretto : il marcatore fluorescente è attaccato direttamente all’Ac,il segnale di
lettura sarà specifico ma debole perché il legame non specifico perché legato per il tratto FcR.
Quindi bisognerebbe usare dei sistemi di accorgimento per tagliare l’aspecifico.
Per la marcatura indiretta il marcatore fluorescente viene attaccato ad un Ac secondario in questo
caso ci sarà un alto segnale specifico di 5 a 6 Ac, 2 per ciascuno Ac primario ed un alto legame non
specifico. Per aver un sistema di lettura ancora piu efficiente si puo usare il metodo con Avidina e
biotina : in questo caso l’Ac primario viene legato alla biotina. L’obiettivo sarà di leggere per
esempio la popolazione dei linfociti,come sappiamo dell’immunologia i LT vengono identificati dai
marcatori chi sono Cd3 nell’interna di questa popolazione abbiamo dei LT marcato Cd4+ o Cd8+
facendo una colorazione diversi per i marcatoreCd3,Cd4+ e Cd8+ posso aver un immagine diversi
di fluorescenze per ciascuna popolazione dal grafico cosi si puo ricavare il rapporto Cd4/Cd8: 0,93,10 molto importante in diagnostica per determinare l’immunodepressione quando diminuisce
come nel caso dell’HIV ma non solo, anche nel SLE (Lupus eritomatosi sistemica)con malattie
renale,infezione da citomegalovirus,da HSV(herpes simplex virus),nel mononucleosi infettive.
Questo rapporto viene aumentato nel caso dell’artrite reumatoide,nel caso del diabete di tipo I , nel
SLE senza malattie renale fondatamente nei malattie autoimmune.
Applicazione nelle funzione cellulare:
Fagocitosi
Killing index dei fagociti
Citochine intracellulare
Flusso di Calcio
Burst ossidativi
Potenziale di membrane
Prendiamo qualche esempio:
Nella reazione ossidative le sostanze non fluorescente sottoposto all’azione degli enzimi di
ossidative diventano fluorescente come per la superosside si usa l’hydroethidina,per il perosside di
idrogeno si usa la diclorofluoresceina. Poi dall’intensità degli immagine noi possiamo valutare e
quantificare gli enzimi ossidative nella cellula
Nel flusso di Calcio:si usano delle sostanze che sono indicatore della concentrazione del Calcio il
piu importante sono la Indo-1 e la Furo-2 che penetrano nella membrane solo se vengono tagliati
dagli esterasi di membrana poi si legano all’ione Calcio e l’intensità della fluorescenza ci da la
concentrazione del Calcio intra o extracellulare.
Citochine intracellulare: si deve prima trattare la membrane renderlo permeabile agli Ac specifici
per un tale citochine poi viene marcato con una sostanza fluorescente che si lega all’Ac.
Fine
Ringrazio tutti per la pazienza a leggere questo sbob marathon ma vi prego di leggere anche queste
righe:
Wisdom time’s
Credo dei vincenti:
Davanti alla montagna , non mollerò mai, lotterò, fino a quando riuscirò a superarla, fino a
quando troverò una strada, un passaggio sotterrano o rimarrò li semplicemente e cambierò
questa montagna in miniera d’oro con l’aiuto di Dio.
Il successo è solo il fatto di non mollare mai invece il fallimento è il fatto di mollare troppo in
fretta.
Paul kateta