artificial

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di
ISOLARE
AMPLIFICARE
frammenti di DNA
SEQUENZIARE
Perché manipolare i geni?
1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della
regolazione fisiologica;
2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la
sovraespressione;
3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle
proteine;
4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con
particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini
proteici
PROCEDURA di CLONAGGIO
ISOLAMENTO del gene
INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO
INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE
VIVENTI per propagarlo
Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze
di DNA in modo preciso….
…..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI
Cosa serve per un clonaggio
•
•
•
•
•
Gene (DNA di interesse)
Enzimi di restrizione
DNA ligasi
Vettore
Cellula ospite
DNA LIGASI
Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità
ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente.
L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa.



CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE:
Presenza di ATP
10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore
La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle
molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir
stabilizzate dalla ligazione.
BamHI
OH
P
5’-G
AATTC-3’
3’-CTTAA
G-5’
OH
P
OH
OH
EcoRI
OH
P
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
P
P
OH
P
OH
P
OH
P
DNA LIGASI
5’-GTT
3’-CAA
P
OH
P
AAC-3’
TTG-5’
P
OH
OH
P
OH
OH
P
OH
P
BamHI
P
OH
OH
OH
P
OH
HpaI
P
FOSFATASI ALCALINA
OH
OH
OH
OH
Blunt ends ligation
oppure trattamento con
Transferasi terminale
P
OH
P
+ dATP
Sticky ends ligation
P
AAA
AAA
P
TTT
OH
OH
+ dTTP
P
OH
OH
P
OH
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
TTT
Sticky ends
ligation
P
Vettori di clonaggio
•
•
•
•
•
Plasmidi
Fagi
Cosmidi
Yac
Bac
PLASMIDI

Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico,
circolare.

In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che
li contengono.

Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.
Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide
deve avere:
 Dimensioni contenute

Un sito di origine della replicazione
 Un gene per la resistenza a un antibiotico
 Siti unici di restrizione (polilinker)
TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE:
Inserimento del plasmide nella cellula ospite
Cellule competenti
Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.
Curva di crescita di E. coli
INTERVALLO (Lag phase)
4 - 5 ore
FASE LOGARITMICA
I batteri crescono esponenzialmente.
10 - 11 ore
5.0
Densità cellulare (OD600)
I batteri vengono diluiti nella coltura
iniziale; la divisione procede lentamente
in quanto le cellule si stanno adattando
al terreno fresco.
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0
5
10
15
Tempo (h)
FASE STAZIONARIA
La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una
fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.
20
PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
LISI ALCALINA
1. RISOSPENSIONE
3. NEUTRALIZZAZIONE
KAc
E. coli
NaOH / SDS
RNasi
Centrifugazione
2. LISI
Supernatante
contenente il
DNA plasmidico
DNA cromosomico
DNA plasmidico
Precipitato
contenente DNA
genomico,
proteine, detriti
cellulari
...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr
DNA cromosomico
Bromuro d’etidio
Svolgimento della doppia elica e
diminuzione della densità idrodinamica
DNA plasmidico
Bromuro d’etidio
Svolgimento della doppia elica compensato
dall’introduzione di supereliche
Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro
d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame rendendo la densità
idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.
Topoisomerasi
Tyr-274
P
O
OH
Prodotto di PCR
T
OH
P
O
Tyr-274
Riepilogo di un procedimento di clonaggio
Libreria genomica
Quando si clona l’intero genoma di un organismo si
dice che si costruisce una libreria (library) genomica
Libreria di cDNA (DNA complementare)
La miscela di frammenti che contiene tutte le sequenze codificanti
costituisce la “libreria di cDNA”.
1-Estrazione di mRNA
Caricamento
TTTTT
TTTTT
AAAAAAAA
AAAAAAAA
Lavaggio
TTTTT
Eluizione
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
AAAAA
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
AAAAA
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
AAAAAAAA
AAAAAAAA
AAAAAAAA
2-Sintesi del cDNA (1° metodo)
AAAAAAA 3’
5’
mRNA
+ oligo dT
5’
+ trascriptasi
inversa
5’
3’
AAAAAAA 3’
TTTTTTT 5’
mRNA
AAAAAAA 3’
TTTTTTT 5’
mRNA
DNA
Rimozione del mRNA
(degradazione alcalina o calore)
3’
TTTTTTT 5’
Formazione della forcina
3’
TTTTTTT 5’
Dna polimerasi
Sintesi del filamento complementare
3’
TTTTTTT 5’
3’
TTTTTTT 5’
AAAAAAA
Rimozione della forcina con la nucleasi S1
3’
TTTTTTT 5’
AAAAAAA
cDNA
A
Sintesi del cDNA (2° metodo)
•
•
•
•
•
genoma di 1.85 x 108 bp
dopo digestione, abbiamo avuto frammenti di circa 20.000 basi che
possiamo clonare nel vettore opportuno.
Se ogni tratto del genoma fosse presente una sola volta, basterebbero
10.000 cloni per rappresentare tutto il genoma.
Esiste una formula che permette di calcolare il numero dei cloni necessari
per avere un alta probabilità che tutti frammenti siano rappresentati:
n = ln(1-p)/ln(1-f)
•
f = 20.000 bp/185.000.000 = circa 10-4 cioè ogni inserto di 20 kb è 1/10.000
del genoma totale.
•
La probabilità p può essere scelta come 95%, 99%, 99.9% a seconda della
sicurezza che si desidera avere.
•
•
Nei tre casi il numero dei cloni sarà:
30.000, 4-50.000, 70.000
SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA
Placche o colonie
•
•
•
Replica su filtri di nitrocellulosa
(conservare le piastre originali)
•
•
Denaturazione,
neutralizzazione e legame
del DNA al filtro
Punti di riferimento per l’orientazione
della replica al termine dell’esperimento
Recupero delle placche positive
dalla piastra originale
Autoradiogramma
che mostra la
posizione delle
sonde ibridizzate
•
•
•
•
•
•
Sonda ibridizzata
•
32P
•
Autoradiografia
•
•
Ibridizzazione con sonda marcata
e lavaggio della sonda non legata
32P
32P
32P
32P
32P
Sonda non legata
SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla
biblioteca.
STRATEGIE DI SINTESI:
CASO 1:
E’ nota la sequenza amminoacidica
della proteina codificata dal gene
CASO 2:
E’ nota la sequenza nucleotidica
del gene di interesse
Si predice la sequenza nucleotidica che
dovrebbe codificare per quella proteina
Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche
(degenerate) più appropriate
o
si amplifica un frammento del gene di interesse mediante PCR
Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come
sonda per l’isolamento del corrispondente gene.
Altri vettori di clonaggio
•
•
•
•
Fagi
Cosmidi
Yac (yeast artificial chromosome)
BAC
•
I fagi (o batteriofagi) sono strutture biologiche complesse in grado di fissarsi alla
parete batterica e quindi introdurre il loro DNA all'interno del batterio. (trasfezione) . Il
fago più usato e conosciuto è il fago lambda.
•
Il fago l è un fago temperato, ha un peso molecolare di 31.106 Da ed è lungo 48.502
bp
•
•
•
•
•
•
•
Il DNA isolato da alcune particelle virali è a doppio strand con due estremità a
singolo filamento di 12 nucletotidi complementari fra loro, chiamati siti cos. Questi siti
permettono al DNA di circolarizzare dopo l’infezione della cellula ospite.
5’ GGGCGGCGACCTCGC---------------------- ACG 3’
GCG---------------------TCGCCCGCCGCTGG
La mappa genetica del fago l comprende circa 40 geni che possono essere suddivisi
in tre gruppi funzionali:
la parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della
testa e della coda.
la parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che
porta all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di
questa regione non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la
costruzione di vettori.
la parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico (S,
R), geni regolatori (cI, cII, cIII, cro, N, Q) (Fig. 33)
ASS ORBIM
E
NTO
PA
RE
TE
BA
TT
ER
ICA
R
CICLO LITICO
A
CICLO
LISOGENICO
A
REPLICAZIONE
TARDIVA
(modello circolare)
COS
REPLICAZIONE
PRECOCE
(bidirezionale)
R
DNA
E. coli
RICOMBINAZ.
bio
GAL
ATT
CROMOSOMA
E. coli
ATT R COS
CON CATAMERO
GAL
TAGLI AD OPERA
PROTEINA A
A J ATT
RICOMBINAZ.
REPLICAZIONE CON
DNA CROMOSOMICO
PARTICELLA
FAGICA
MATURA
INCAPSIDAZIONE
LISI DELLA
PARETE BATTERICA
bio
CICLO LISOGENICO
Ad alto stato di infezione la cellula contiene alte concentrazioni di
cIII:
Hfl è inibita
cII stimola la trascrizione di cI e la proteina Integrasi
cI è un repressore dei geni del ciclo litico e blocca la
sintesi di N, O, P e Q legandosi agli operatori OL e OR,
bloccando il ciclo litico
CICLO LITICO
A basse concentrazioni di cIII:
Hfl non inibita
riduce l’attività o la quantità di cII
blocco della sintesi di cI
la sintesi di N, O, P, Q non è più bloccata
IMPACCAMENTO IN VITRO
Geni fagici
Geni fagici
Proteine di
assembaggio
pD
Proteine di
assembaggio
Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione
amber BHB2690. L’induzione porta alla produzione di
di code di l, dei precursori delle teste e delle proteine di assemblaggio,
ma non di proteina D.
L’impaccamento è impedito a causa della mancnaza di proteina D
Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione
amber BHB2688. L’induzione porta alla produzione di
di code di l, di proteina D e delle proteine di assemblaggio,
ma non di proteina E. Non si formano i precursori delle teste.
LISI E MISCELAZIONE DEGLI ESTRATTI
+ AGGIUNTA DI ATP + DNA CONCATAMENRIZZATO
COS
COS
+
+
COS
Proteine di
assembaggio
+
COS
pD
PARTICELLA FAGICA
MATURA
• La regione tra i geni J e N del genoma di l non è
essenziale per la crescita litica. In linea di principio, un
vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa
14.500 bp di DNA estraneo
• Nella testa del fago può trovare posto fino al 105% della
lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di l
altre regioni non essenziali che possono essere rimosse.
• Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo
di circa 22 Kb di DNA estraneo inseribile.
• Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma
di l, pari a circa 37 Kb, al di sotto il DNA non viene
impaccato e il l non è vitale.
• Esistono due tipi di vettori l
• * I vettori d'inserzione
• * I vettori di sostituzione
DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO
Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago l, lungo 49 Kb.
Eliminazione del DNA
non essenziale
DNA virale
Regione non essenziale
(circa 20 Kb)
DNA ricombinante
DNA da
clonare
Assemblaggio in vitro
delle particelle virali
Teste e code
del virus
Il DNA virale entra nelle cellule, viene
replicato e dirige la sintesi delle proteine
virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove
particelle virali assemblate
Infezione
dei batteri
Recupero delle particelle virali e
isolamento del DNA clonato
IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE
Estremità
coesive
Estremità
coesive
Sito cos
All’interno della cellula, le
estremità si appaiano
originando una molecola di
DNA circolare
Il DNA virale a doppia elica entra
nelle cellule batteriche durante
l’infezione come molecola lineare
Cicli ripetuti di replicazione
con il meccanismo del
cerchio rotante
Concatameri di copie di DNA virale
Il DNA viene inserito nelle
teste del virus e tagliato
a livello del sito cos
•
Il DNA codifica per le
proteine della testa e
della coda del virus
Sono aggiunte
le code
Particella virale infettiva.
I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e
possono infettare altre cellule batteriche.
5’
COSMIDI
Sono PLASMIDI,
ma contengono, oltre alle caratteristiche
essenziali di un plasmide, anche un
SITO COS
La presenza di questo elemento è determinante per consentire
l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del virus
che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per infezione.
c) cosmidi
Sono plasmidi che utilizzano la capacità del batteriofago
lambda di impacchettare lunghi frammenti di DNA lineare
all’interno del capside, di aderire alla superficie delle cellule
batteriche e di iniettare il loro contenuto all’interno del
batterio.
Rispetto al batteriofago lambda, può contenere un inserto
di DNA di dimensioni maggiori (45 kb).
Il cosmide circolarizza e si comporta come un grande
plasmide replicando il proprio genoma.
d) Vettori BAC
Bacterial Artificial Chromosome
Plasmidi di dimensioni enormi, consentono l’inserimento di
frammenti di DNA umano fino a 300 Kb.
Il DNA viene inserito nei batteri mediante processo di
elettroporazione: uno shock elettrico provoca la
formazione transitoria di pori sulla membrana batterica
attraverso i quali passa il DNA.
Ospiti per i vettori
• Le caratteristiche di un ospite di clonaggo sono:
• crescita rapida
• capacità di crescere in terreni di coltura poco
costosi
• non patogencità
• capacità di essere trasformato
• stabilità della coltura.
Curva di crescita di E. coli
INTERVALLO (Lag phase)
4 - 5 ore
FASE LOGARITMICA
I batteri crescono esponenzialmente.
10 - 11 ore
5.0
Densità cellulare (OD600)
I batteri vengono diluiti nella coltura
iniziale; la divisione procede lentamente
in quanto le cellule si stanno adattando
al terreno fresco.
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0
5
10
15
Tempo (h)
FASE STAZIONARIA
La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una
fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.
20
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
3’-GGCTAAC
DNA stampo a
singola elica
5’
Ibridazione con
Il primer
3’
3’-GGCTAAC
+
[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT
ddATP, dNTP
ddCTP, dNTP
-CCG ddA
-ddC
-C ddC
A C
(dNTP) +Sequenasi
ddGTP, dNTP
ddTTP, dNTP
-CC ddG
-CCGATT ddG
G
-CCGA ddT
-CCGAT ddT
T
-CCGATT ddG
-CCGAT ddT
-CCGA ddT
-CCG ddA
-CC ddG
-C ddC
-ddC
G
T
T
A
G
C
C
Sequenza: 5’-CCGATTG
Direzione di
lettura