UNIPR_koff - CNR-ISAC

Partner 8
Dipartimento di Scienze Ambientali
Università degli Studi di Parma
LaRIA – Laboratorio Regionale per
l’Innovazione nel controllo della
qualità dell’Aria
Generalità della Sezione
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

La Sezione di Genetica e Biotecnologie
Ambientali è coordinata dal Prof. Nelson
MARMIROLI, attualmente Vice-Direttore del
Dipartimento di Scienze Ambientali
Comprende un Professore Ordinario, due
Professori Associati, quattro Ricercatori, un
Tecnico
Al momento ospita un’assegnista, quattro
dottorandi, due borsisti, tre contrattisti e
alcuni tirocinanti e tesisti di lauree triennali e
specialistiche
Principali attività di ricerca
Tracciabilità attraverso le filiere
agroalimentari per la qualità e la
sicurezza
 Biotecnologie ambientali
 Interazioni tra gli organismi viventi ed
il loro ambiente
 Controllo e ripristino della qualità
ambientale

Composizione del gruppo
Elena Maestri (Prof. Associato)
 Alessio Malcevschi (Ricercatore)
 Giovanna Visioli (Ricercatore)
 Marta Marmiroli (Ricercatore)
 Andrea Pirondini (Dottorando)
 Un borsista da assumere

Contributi previsti

Sottoprogetto 1
OR1, 43 giorni uomo
 OR2, 51 giorni uomo
 OR4, 92 giorni uomo
 OR7, 120 giorni uomo

Approccio generale


L’unità di ricerca propone approcci di bioindicazione e
biomonitoraggio attivi, in cui piante superiori
appositamente scelte in base alle loro caratteristiche
verranno esposte in modo controllato a particolari
condizioni di inquinamento atmosferico, e analizzate al
termine del periodo di esposizione per ricavarne
informazioni utili sul tipo e sul grado dell’inquinamento.
Inoltre, l’Unità svilupperà strategie per il monitoraggio
qualitativo di metalli pesanti mediante la rilevazione in
tessuti umani prelevati da lavoratori professionalmente
esposti e valuterà la frequenza, entro le categorie
esposte, di individui ipersensibili a patologie
dell’apparato respiratorio mediante l’analisi di
marcatori ecogenetici.
OR1, Sviluppo di sensori a stato solido basati su ossidi
semiconduttori nanostrutturati per la rilevazione CO, NOx,
O3, SO2, NH3 e VOC e di strategie innovative di
monitoraggio tramite biosensori

Conoscenze pregresse



I contaminanti aerei raggiungono la superficie delle
piante per deposizione umida o occulta,
deposizione gassosa a secco o deposizione di
particolato a secco. L’importanza relativa dei
diversi eventi dipende dal tipo di emissione, dalle
proprietà fisico-chimiche dei contaminanti, dalle
condizioni atmosferiche e climatiche, dalla struttura
e dalla suscettibilità delle piante. Per i contaminanti
volatili predomina la deposizione gassosa.
L’ingresso di VOC e SVOC nei tessuti vegetali
richiede deposizione e cattura alla superficie
esposta delle piante. Il pathway di assunzione
dipende dalle caratteristiche chimiche della
sostanza e da caratteristiche della pianta, ma
l’effettivo ingresso nei tessuti è modulato da fattori
ambientali.
La concentrazione delle sostanze volatili nella
pianta raggiunge velocemente un equilibrio con la
loro concentrazione nell’atmosfera, e questo rende
le piante ottime indicatici del carico inquinante a
breve termine nel corso del campionamento. Per le
sostanze semivolatili si può considerare invece un
fenomeno di accumulo e quindi di integrazione
temporale delle concentrazioni nel corso di
esposizioni prolungate.
Attività proposte


Si svolgeranno ricerche bibliografiche per
definire le caratteristiche dei sensori
biologici ideali per il lavoro proposto nei
successivi OR; una volta identificate le
piante che da esperienze precedenti o da
dati riportati si riterranno più opportune, si
procederà con limitati esperimenti di
laboratorio per implementare le tecniche
di coltivazione ed esposizione da
utilizzare successivamente.
Indicazioni già acquisite suggeriscono
l’utilizzo di:



Piante accumulatrici di xenobiotici
organici: Brassica oleracea cv.
acephala; Lolium multiflorum,
Taraxacum officinale.
Piante modello per studi di
genotossicità: Arabidopsis thaliana
ecotipo Columbia.
Piante per indagini proteomiche:
Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia
Biomonitoraggio


Il gruppo ha già svolto in passato esperienze di
biomonitoraggio con piante superiori. In particolare, una
lunga collaborazione con l’azienda AMNU e la sezione
ARPA di Parma ha riguardato il monitoraggio della zona
circostante l’inceneritore di rifiuti, ora dismesso, e zone a
diverso livello di traffico nella rete urbana della città di
Parma.
Il Comune di Santo Stefano Magra (SP) ha deciso di
monitorare l’inquinamento nel trafficatissimo incrocio tra il
raccordo autostradale e la statale della Cisa non per mezzo
delle tradizionali centraline, bensì affidandosi alle piante.
L’iniziativa, denominata “Pianta Mia”, si avvale della
collaborazione dell’Università di Parma e ha previsto la
messa a dimora, in una grande aiuola, alle porte del paese,
di piante di cavolo ornamentale, bosso, aucuba, erica,
iperico, cineraria, ginepro, evonimo e Cotoneaster. Nella
scelta delle essenze ci siamo basati su precedenti studi.
OR2, Sviluppo di sistemi per la
rilevazione di gas inquinanti in
ambienti outdoor

Conoscenze pregresse


Le piante devono essere esposte all’inquinamento atmosferico con
le loro parti aeree, in siti dove l’aria possa circolare liberamente
senza ostacoli, idealmente nella stessa posizione delle centraline di
rilevamento di parametri fisico-chimici. La posizione deve essere
elevata per impedire l’accesso volontario o accidentale di persone o
animali terrestri, e sarà necessaria una protezione contro gli uccelli.
Per evitare effetti di dilavamento da parte delle precipitazioni il
biosensore sarà coperto da una tettoia e il terreno dei vasi sarà
adeguatamente rifornito di acqua mediante annaffiatura dal basso.
Le piante per la captazione delle sostanze gassose saranno esposte
all’aria in sistemi chiusi protetti da filtri atti a fermare il particolato
atmosferico (cellulosa).
Per motivi di uniformità, le piante da usare come biosensori
dovranno essere, entro specie, geneticamente uniformi (anche se
non omozigoti), allevate a partire da seme o talea in condizioni simili
e tutte con la stessa età, evitando esemplari evidentemente anomali
o malati.
Attività proposte




Le attività saranno rivolte alla scelta e coltivazione delle piante da
utilizzare come biosensori in numero sufficiente alla preparazione
dei necessari sistemi di monitoraggio: Brassica oleracea cv
acephala coltivata da seme, Lolium multiflorum, Taraxacum
officinale, Arabidopsis thaliana, o altre identificate nell’OR1
Scelta dei siti da sottoporre a monitoraggio e delle sostanze da
analizzare in accordo con altre Unità
Progettazione dei biosensori e loro preparazione
Definizione delle metodologie per




Analisi chimica e identificazione delle sostanze organiche presenti
in campioni vegetali (IPA in foglie di Brassica oleracea cv acephala
dopo 8 settimane di esposizione)
Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante modello (in situ ed
ex situ): Arabidopsis
Analisi proteomiche in Arabidopsis
Analisi statistica dei risultati
Analisi di polimorfismi



La valutazione della frequenza di mutazioni insorte nel corso
dell’esposizione ai contaminanti si effettuerà calcolando il numero di
polimorfismi evidenziabili all’interno della popolazione esposta in
confronto al numero di polimorfismi evidenziabili in popolazioni di
controllo mantenute in ambienti controllati (camera di crescita) senza
alcuna esposizione. L’ipotesi di lavoro è che nelle popolazioni non
esposte insorgano poche o nessuna mutazione, e che nelle
popolazioni esposte ne insorgano con maggiore frequenza, portando
quindi a un numero di polimorfismi maggiore nelle popolazioni
esposte.
L’identificazione di polimorfismi si effettuerà con le tecniche basate
sui marcatori molecolari di tipo RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) e AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), tecniche che analizzano simultaneamente decine di
siti genomici grazie all’amplificazione mediante PCR di frammenti a
partire da inneschi molecolari di sequenza definita e arbitraria (Conte
et al. 1998, Chemosphere 37:2739-2749).
Variazioni nel numero e nella lunghezza dei frammenti amplificati in
individui diversi identificano i polimorfismi e sono indice di mutazioni
avvenute nella popolazione esposta. Il numero di polimorfismi è
correlabile alla durata dell’esposizione per cercare una stima
quantitativa della relazione tra esposizione ed effetto.
10
9
*
8
No. amplified products
*
*
*
*
*
7
6
5
4
3
2
*
OPG 19
OPG 16
OPG 14
OPG 10
OPG 06
OPG 02
OPAS 15
OPAS 14
OPAS 13
OPAS 12
OPAS 09
OPAS 07
OPAS 06
OPAS 04
0
*
*
*
1
Primer
Diverse combinazioni di marcatori molecolari
saggiate su piantine di Arabidopsis ottenute da
semi esposti a mutagenesi con elevate
concentrazion di metalli pesanti: Cd, Pb, Mn. Il
grafico mostra i numeri relativi di prodotti di
amplificazione che erano esclusivamente
presenti negli individui trattati con Cd
in
confronto con i prodotti esclusivamente presenti
nei controlli non trattati
o comuni a
entrambi
*
*
Esempi di gel
*
Analisi proteomiche




Estratto proteico
Separazione delle proteine (gel
bidimensionali, cromatografia liquida) e
individuazione di eventuali differenze tra
diversi estratti
Isolamento di questi “spot” e analisi ulteriore
attraverso spettrometria di massa
Individuazione della proteina attraverso
appositi database informatici
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA 2-D
“ProteomeLab PF-2D”



Consiste in una doppia colonna
cromatografica
La prima colonna separa il campione
secondo il punto isolettrico “Highperformance chromatofocusing (HPCF)”.
Le frazioni cosi’ ottenute vengono raccolte
e iniettate all’interno della seconda colonna
cromatografica che ci permette di separare
le proteine secondo la loro polarita’ “highresolution reversed-phase chromatography
(HPRP)” .
DeltaVue è un software che serve per confrontare le frazioni
ottenute ed evidenziare eventuali differenze qualitative e
quantitative
2-D differential map of selected pH fractions (pH range 6,17-6,47)
OR4, Prove in campo con i prototipi dei
sistemi sviluppati nei precedenti OR

Le attività saranno rivolte a:
 Installazione e mantenimento dei biosensori
 Campionamento periodico
 Analisi chimica e identificazione delle sostanze
organiche presenti in campioni vegetali: IPA in foglie
di Brassica oleracea cv acephala dopo 8 settimane di
esposizione
 Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante
modello (in situ ed ex situ): Arabidopsis
 Ricerca di biomarcatori proteomici in Arabidopsis
 Analisi statistica dei risultati
 Correlazioni con dati da misure puntiformi forniti da
altre Unità
OR7, Biomonitoraggio di particolato
atmosferico (APM) in piante superiori e gruppi
di lavoratori professionalmente esposti

Conoscenze pregresse - piante



Per i contaminanti non volatili e i metalli pesanti predomina la deposizione
come particolato sia umida che a secco. Solo pochi elementi chimici possono
essere assunti a livello delle foglie, quali carbonio, ossigeno, azoto, fluoro,
zolfo. Altri elementi possono però essere adsorbiti dalla superficie fogliare ed
essere evidenziabili analizzando le superfici non lavate. Il pathway di
assunzione dipende dalle caratteristiche chimiche della sostanza e da
caratteristiche della pianta, ma l’effettivo ingresso nei tessuti è modulato da
fattori ambientali. I contaminanti legati alle particelle, come metalli pesanti e
composti organici non volatili, si depositano sulla superficie e possono essere
adsorbiti alla cuticola, inglobati in essa oppure addirittura assunti tramite
essa. Lo strato ceroso agisce come accumulatore di inquinanti particolati.
Si è dimostrato che nella cuticola si accumulano elementi che comprendono
Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb, e che questi non possono essere dilavati facilmente
delle precipitazioni. Elementi quali Mg, K, Ca, Cd e Zn non si legano invece
significativamente alla cuticola. Tutti questi elementi possono comunque
essere distribuiti ad altre parti della pianta.
L’apporto di composti organici da parte del particolato è significativo solo per
molecole con coefficienti di ripartizione ottanolo/aria superiori a 11, quali
diossine e furani, e composti policiclici aromatici con più di 5 anelli.
Attività previste
(sovrapposizioni con OR4)
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


Scelta dei siti
Scelta e coltivazione delle piante
Installazione e mantenimento dei biosensori
Campionamento periodico
Analisi chimica e identificazione delle sostanze organiche
presenti in campioni vegetali
Analisi SEM/EDX del particolato presente sui campioni di
foglie: Lolium e Taraxacum e altre specie
Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante modello (in
situ ed ex situ): Arabidopsis
Ricerca di biomarcatori proteomici in Arabidopsis
Analisi statistica dei risultati
Correlazioni con dati da misure puntiformi forniti da altre
Unità
Analisi chimiche

Le analisi chimiche (ICP-OES) e spettroscopiche
(SEM/EDX) sono state applicate negli ultimi 7 anni a
diverse piante in diversi contesti:
 Piante di interesse agricolo per valutare il flusso di
metalli pesanti nelle parti commestibili
 Piante iperaccumulatrici di nichel da siti naturalmente
contaminati per rilevare i siti di accumulo e le
differenze con congeneri non accumulatori
 Piante arboree sottoposte a trattamento con piombo
per identificare i siti di accumulo nella radice
 Piante modello geneticamente modificate per
evidenziare il trasporto di cesio
 Piante acquatiche in celle di trattamento per reflui
caseari per evidenziare l’accumulo di contaminanti
inorganici e nutrienti
Alyssum
Phragmites
Juglans
OR7, Biomonitoraggio di particolato
atmosferico (APM) in piante superiori e gruppi
di lavoratori professionalmente esposti

Conoscenze pregresse – ipersensibilità



Il particolato atmosferico è ritenuto responsabile della maggior parte degli effetti avversi
sulla salute umana provocati dall’inquinamento atmosferico. Un’esposizione ad alti livelli e
prolungata nel tempo aumenta i rischi di cancro, malattie respiratorie, arteriosclerosi,
mentre le brevi esposizioni esacerbano bronchiti e asma. Gli effetti si correlano alla
presenza di IPA, metalli di transizione, benzene. Una valutazione dell’esposizione a livello
dei singoli individui della popolazione sarebbe un primo passo per stabilire relazioni tra
causa ed effetto nelle patologie provocate dall’inquinamento. La valutazione
dell’esposizione individuale può essere eseguita misurando un “biomarcatore”
meccanicisticamente correlato, che sia sensibile e specifico. Ad esempio, il metabolita 1idrossipirene (1-HP) nelle urine è considerato un biomarcatore di esposizione a IPA.
Per quanto riguarda l’esposizione a metalli pesanti, l’analisi degli elementi nei capelli è
considerata una buona fonte di informazione. I capelli riflettono la presenza di metalli e
altri elementi nel sangue e sono considerati utili specialmente per individui
professionalmente esposti. Anche altri peli corporei possono essere usati per lo stesso
scopo.
Un importante gruppo di contaminanti del particolato sono gli IPA, ad effetto cancerogeno,
e la loro attività mutagena dipende spesso dalla attivazione metabolica ad opera di enzimi,
in particolare citocromi P450 monossigenasi della famiglia CYP1A1. Perciò si considera
che variazioni nei livelli individuali di attività enzimatica CYP1A1 possano essere correlate
con variazioni nella sensibilità individuale ai danni prodotti da questi composti. Valutare i
polimorfismi genetici per questo gene (di cui sono noti 9 alleli), e quindi la frequenza di
questo marcatore ecogenetico, consente di stimare l’esistenza di individui ipersensibili
nella popolazione. La presenza di individui ipersensibili nelle categorie di lavoratori
professionalmente esposti all’inquinamento atmosferico è quindi un ulteriore fattore di
rischio occupazionale, che dovrebbe essere conosciuto per meglio prevenire l’insorgenza
di malattie gravi.
Attività proposte

Gruppi di lavoratori professionalmente esposti: autisti di mezzi pubblici,
addetti alla distribuzione della posta, vigili urbani. Controllo: colleghi che
lavorano in ufficio (non esposti) con simile distribuzione per sesso, età,
abitudini relative al fumo.
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

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



Scelta dei gruppi da sottoporre a monitoraggio per marcatori ecogenetici di
suscettibilità, per metabolici di IPA nelle urine e per il contenuto di metalli
pesanti nei capelli. Ottenimento delle autorizzazioni e dei consensi.
Analisi delle abitudini di vita e lavorative, costituzione dei gruppi esposti e di
controllo, identificazione dei periodi di esposizione.
Campionamento periodico
Analisi chimica di idrossipirene nelle urine
Analisi SEM/EDX di campioni di capelli
Analisi di polimorfismi in marcatori ecogenetici: CYP1A1 (metabolismo degli
IPA), CYP2E1 (metabolismo del benzene), NQO1 (detossificazione di
chinoni), GSTM1 e GSTT1 (inattivazione per coniugazione).
Analisi statistica dei risultati
Correlazioni con dati da misure puntiformi forniti da altre Unità
Analisi di marcatori
ecogenetici



A causa della diversità genetica tra individui, gli appartenenti a
popolazioni umane diverse sono diversamente suscettibili agli
agenti inquinanti, e più o meno predisposti allo sviluppo di
sintomatologie patologiche
L’identificazione di questi fattori genetici polimorfici, attuabile
attraverso tecniche biotecnologiche, è molto importante per
comprendere il fenomeno che chiamiamo “ipersuscettibilità
individuale”
Esempio

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

L’enzima alfa1-antitripsina del siero è un fattore di suscettibilità
Infatti, la carenza di questo enzima sarebbe connessa allo sviluppo
di patologie broncopolmonari (enfisema) e del fegato
Il rischio è ulteriormente aumentato da particolari abitudini di vita,
come il fumo
Quindi, un individuo carente per questo enzima, se esposto
all’inquinamento atmosferico, ha una maggiore probabilità di
ammalarsi rispetto ad altri individui. Se inoltre fosse un fumatore, il
rischio sarebbe ancora maggiore.
Esperienza del gruppo
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
Il gruppo ha una lunga esperienza nell’analisi di marcatori
genetico-molecolari in organismi diversi. Di recente, il
laboratorio si è dotato di sofisticate strumentazioni per
l’analisi genetica che faciliteranno questa parte del lavoro
(sequenziatore automatico di acidi nucleici, RealTime PCR).
Per quanto riguarda l’analisi di elementi chimici quali i
metalli pesanti in tessuti, da diversi anni il gruppo
proponente ha applicato tecniche di microanalisi a
scansione e microfluorescenza alla descrizione qualitativa e
quantitativa della localizzazione tissutale di Pb, Ni, Cu, Zn,
Cs ed altri elementi in diverse specie vegetali. Tale
esperienza è facilmente estendibile a tessuti di provenienza
umana.
Contatti con colleghi dell’area medica sono già stati
intrapresi.