Il DNA: il materiale genetico

Corso teorico-pratico:
LA GENETICA E LE SUE APPLICAZIONI
IN AMBITO FORENSE
7-9 settembre 2005 (ore 9-17)
Life Learning Center,
via della Beverara 123, Bologna
Principi di genetica: il DNA,
trasmissione ed analisi molecolare.
Dott.ssa Silvia Bonaccorsi,
Consiglio Nazionale delle Ricerche, Roma
[email protected]
4 miliardi di anni per generare i meccanismi con cui
tutti gli organismi viventi, dai batteri, alle piante all’uomo,
devono immagazzinare, replicare, trasmettere alla
generazione successiva e utilizzare le informazioni
necessarie per lo sviluppo, la crescita, la sopravvivenza nei
loro ambienti, cioe’
l’informazione che determina
l’identità biologica
Il DNA è la molecola che contiene
l’informazione biologica
Acido Desossiribo Nucleico
contenuto nel nucleo delle cellule
Struttura a doppia elica,
identificata da Watson e
Crick nel 1953
Organizzazione strutturale del
DNA
Il DNA è una
doppia elica
costituita da due
catene
polinucleotidiche
avvolte a spirale
e antiparallele.
3’
5’
5’
3’
Successione di
unità costitutive
che si chiamano
nucleotidi
Un nucleotide è
composto da uno zucchero
(il desossiribosio) a cui è
legato un gruppo fosfato e
una delle 4 basi azotate
(Adenina
Timina
Citosina e Guanina)
Doppio filamento di nucleotidi
con coppie di
basi complementari
La complementarietà
delle basi è la
proprietà più
importante e la
chiave per capire
come il DNA si
replica, trasmette e
immagazzina
l’informazione
genetica
Il DNA è una sequenza di parole scritte
con un codice a 4 lettere (le 4 basi)
che fornisce l’informazione
per “costruire” gli organismi
Ogni parola è un
Gene A
gene
Gene B
Il DNA è una sequenza di geni
(e non solo… molto DNA non codifica niente
sembra una sequenza insensata di lettere che puo’
cambiare, ovvero mutare, senza problemi!)
Come si passa dall’ informazione codificata
alla forma cellulare?
Attraverso la sintesi delle proteine (catene di aminoacidi)
Il codice funziona a triplette:
una data sequenza di tre basi = un dato aminoacido
Ogni gene viene letto dall’apparato cellulare come una
sequenza di triplette che permette di
sintetizzare una specifica sequenza di aminoacidi
cioè una proteina
Il trasferimento dell’informazione contenuta nei geni
avviene in due passaggi: trascrizione e traduzione
La trascrizione è il processo con cui l’informazione viene
trasferita dal DNA all’RNA.
La traduzione è il processo con cui l’informazione viene
trasferita dall’RNA alle proteine
Nucleo
Citoplasma
(
(
Trascrizione di un’elica
Traduzione
Come si duplica il DNA?
La struttura stessa del DNA suggerisce come avviene la sua
trasmissione da una generazione all’altra. La complementarietà delle
basi azotate dirige la sintesi di nuovo DNA indicando la sequenza con
cui aggiungere le basi della doppia elica neoformata.
La replicazione del DNA è
semiconservativa
Il complemento di DNA di un organismo:
genoma
Nelle cellule le molecole di DNA che
compongono il genoma sono organizzate nei
cromosomi.
Dal DNA ai
cromosomi 1.
I cromosomi:
DNA impacchettato
con proteine
Uomo: 1 metro di DNA
Cromosoma umano= 1-10 m =
10.000-200.000 m di DNA
Dal DNA ai cromosomi 2.
Ogni cromosoma porta un insieme particolare di
geni.
Ogni specie possiede un numero fisso di
cromosomi distinguibili per forma e grandezza
(cariotipo)
In molti organismi (organismi diploidi), ogni
cromosoma e i geni che lo compongono sono
presenti due volte (cromosomi omologhi)
Il cariotipo
umano
22 coppie di cromosomi
omologhi e 1 coppia di
cromosomi sessuali
(XX nelle femmine;
XY nei maschi)
Totale: 46 cromosomi per
cellula
I geni presenti sui cromosomi omologhi possono
avere sequenze leggermente diverse e codificare
versioni diverse della stessa proteina.
Normalmente una delle due versioni è
dominante sull’altra e determina
la forma visibile (fenotipo).
La versione non visibile (recessiva) può
manifestarsi nelle generazioni successive
I cromosomi sono visibili al microscopio ottico solo al
momento della divisione cellulare perchè si condensano
in modo da facilitare la trasmissione del DNA
Come vengono trasmessi i cromosomi (e quindi i geni)
da una cellula all’altra di un individuo e
da una generazione all’altra?
Due tipi di divisione cellulare
La mitosi è la divisione che avviene nelle cellule
somatiche e nell’uovo fecondato.
La meiosi è la divisione che avviene nelle
cellule germinali
Mitosi
interfase
profase
metafase
anafase
telofase
Cellule figlie
2n
2n
replicazione
segregazione
2n
La mitosi mantiene costante la quantità di materiale genetico
nelle cellule di un organismo
Meiosi
n
n
2n
n
replicazione
appaiamento
n
Segregazione
(degli OMOLOGHI)
segregazione
La meiosi mantiene costante la quantità di materiale genetico
attraverso le generazioni e assicura la formazione di nuove
combinazioni di cromosomi
I cromosomi (quindi i geni) dei genitori si distribuiscono in modo
indipendente nei gameti. Dall’unione di due gameti si forma uno zigote
con una combinazione nuova dei geni dei genitori.
E’ questa combinazione che ne determina
l’individualita’
Meiosi
Mitosi
Mitosi
Meiosi
Riassumendo
Il materiale ereditario consiste nel DNA
Il DNA è una doppia elica composta da due catene nucleotidiche
avvolte l’una sull’altra e orientate in direzioni opposte
Le unità funzionali del DNA sono i geni
Un gene è un segmento di DNA che codifica una proteina
La sequenza nucleotidica del DNA viene trascritta su un RNA e
poi tradotta nella sequenza aminoacidica di una proteina
Durante la duplicazione del DNA le due catene si separano e
funzionano da stampo per la sintesi di due molecole figlie uguali
Riassumendo ancora….
Tutte le cellule di un individuo hanno lo stesso DNA.
Ma non sono tutte uguali!
Combinazione di geni “on” e “off” = identità cellulare
Analisi del DNA:
necessarie sequenze disponibili in gran quantita’
e in forma pura
9
Genoma di mammifero = 3 x 10 bp
1 gene = 3000 bp
1 sequenza su un 1 milione
1. Frammentazione enzimi di restrizione
2. Separazione elettroforesi
3. Identificazione ibridazione con sonda marcata
4. Amplificazione PCR
5. Sequenziamento
Fase 1: digestione
del DNA
Si utilizzano gli enzimi di restrizione.
Sono delle “forbici molecolari” che tagliano
(digeriscono) il DNA su entrambi i filamenti
in corrispondenza di sequenze specifiche.
Si sono evoluti nei batteri come difesa
contro DNA estraneo (es. quello virale).
DNA
Sito di taglio
Per vedere questa immagine
occorre QuickTime™ e un
decompressore GIF.
A
B
Numero e lunghezza dei frammenti
dipendono dalla frequenza della
sequenza sul DNA (sequenze più corte:
statisticamente più frequenti).
C
D
Fase 2:
separazione del DNA
I frammenti di DNA vengono
separati in base alla
loro lunghezza attraverso un
campo
elettrico (elettrofresi).
Per vedere questa immagine
occorre QuickTime™ e un
decompressore GIF.
Successione di bande
Frammento più lungo
Frammento più corto
A
D
B
C
Fase 3:
Identificazione del DNA
Una sequenza di DNA può fungere da sonda per
identificare segmenti di DNA che hanno sequenza
nucleotidica identica o molto simile in base al
principio della complementarità delle basi.
Le sonde: frammenti purificati a singolo filamento
che vengono “marcati”
(isotopi radioattivi o composti fluorescenti) in modo
da poter funzionare come traccianti
Fase 3:
Identificazione
del DNA
DNA denaturati (singola elica) separati per
elettroforesi e trasferiti su una membrana
porosa poi immersa nella soluzione con la sonda
marcata (tracciante)
“Southern blotting”
Il filamento singolo della sonda riconosce
la sequenza complementare sul DNA e vi si lega.
Amplificazione
PCR
Reazione a Catena della
Polimerasi
Metodo per amplificare
rapidamente un singolo
frammento di DNA da una
miscela complessa
Cicli ripetuti di:
1. Denaturazione al calore
2. Primers (oligonucleotidi)
3. Polimerizzazione con
polimerasi Taq
(resistente al calore)
Testi consigliati
(per ricordare e approfondire!)
• D. P. Snustad e M. J. Simmons: Pricipi di Genetica
• (Zanichelli editore)
• Capitoli 1-7, 10-14, 20-22
• L. H. Hartwell, L. Hood, M. L. Goldberg, A. E. Reynolds,
L. M. Silver, R. H. Veres: Genetica dall’analisi formale
alla genomica
• (McGraw-Hill editore)
• Capitoli 1-4, 6-9, 10-13