Genetica batterica - Dipartimento di Farmacia

LABORATORIO DI
MICROBIOLOGIA DFC
Genetica batterica
• Trasformazione : l’ uccisione di una cellula non distrugge il DNA che
mantiene le sue proprietà, nel caso penetri in una nuova cellula
batterica.
• Coniugazione : due cellule batteriche entrano in contatto tramite
una struttura detta sex pilus che permette il trasferimento di materiale
genetico (plasmidi).
• Trasduzione (conversione fagica) : il trasferimento genetico è
mediato da batteriofagi, sono virus capaci di infettare i batteri, può
essere ristretta o generalizzata.
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TRASDUZIONE
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Materiale genetico può essere trasferito da batterio a batterio
mediante batteriofagi o virus.
La trasduzione può essere generalizzata quando il batterio infettato
viene lisato, parti del DNA batterico vengono inglobate dai fagi
neosintetizzati, in una successiva infezione caratteristiche del DNA
del batterio possono comparire in altri batteri infettati.
La trasduzione di tipo ristretto prevede l’inclusione del DNA virale in
quello cromosomico, (ciclo lisogeno), in un secondo tempo si ha la
lisi del batterio, con fuoriuscita dei fagi maturi che conterrano
all’interno del loro Dna materiale genetico batterico.
La conversione fagica è un tipo di particolare trasduzione che
comporta l’acquisizione di nuove caratteristiche da parte di una
specie batterica, C. diphteriae dopo infezione con fago beta produce
tossina difterica. (ce FAGO BETA tossina botulinica in ceppi di C.
botulinum)
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CONIUGAZIONE
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La coniugazione avviene tramite una particolare struttura detta sex
pilus, non si tratta di un mezzo di riproduzione non c’è fertilità ma è
un passaggio di porzioni di DNA.
La differenza tra cellula donatrice e ricevente è nella presenza di un
plasmide (DNA circolare extracromosomiale) che è indipendente
nella replicazione rispetto al DNA cromosomico. Il plasmide
contiene l’informazione genetica per codificare il plasmide.
Il plasmide può anche essere integrato nel DNA cromosomale
(episoma).
Le cellule che hanno una copia del fattore F (plasmide) sono dette F
+ , quelle che non hanno il plasmide F-.
Il donatore fa una copia del fattore F per trasferirlo in batteri che non
l’hanno.
Esistono numerosi plasmidi che possono rimanere all’interno della
cellula batterica in assenza del fattore F.
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CONIUGAZIONE
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Il plasmide può contenere anche geni che inducono l’antibiotico
resistenza.
Donatori HFR: si tratta di batteri che hanno il plasmide integrato (ma
possono revertire), fanno una copia del loro cromosoma che viene
passato al batterio ricevente, comunque in questo passaggio che si
realizza in poco tempo il fattore F non viene trasferito per cui i
riceventi rimangono F-. Comunque le cellule riceventi acquisiscono
altre caratteristiche veicolate dal plasmide.
Il fattore R responsabile di questa trasmissione è trasferibile per tutti
gli enterobatteri. Questo plasmide contiene sia geni che codificano
per la resistenza che geni che codificano per il sex pilus. (fattore R e
fattore TF transfer factor).
I plasmidi sono elementi trasmissibili che possono contenere anche
informazioni che riguardano il metabolismo e l’assunzione delle
sostanze.
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BIOTECNOLOGIE
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Procedure tramite le quali si possono ottenere quantità
commerciali di prodotti utili, mediante l’uso di agenti biologici che
possono essere batteri lieviti, cell. Vegetali, cell. Animali.
Le biotecnologie vengono usate da sempre in agricoltura, per le
attività fermentative dei microrganismi.
•Ingegneria genetica
BIOTECNOLOGIE
•Produzione di anticorpi
•Ingegneria proteica
•Chimica degli oligonucleotidi
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BIOTECNOLOGIE
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Ingegneria genetica : produzione di farmaci, vaccini prodotti a
indirizzo terapeutico. (organismi transgenici, con miglioramento p
della resistenza alle malattie infettive, piante, e alle avverse
condizioni ambientali, migliore resa nella produzione dei cereali).
Ingegneria proteica: modifiche strutturali che modificano l’attività in
vitro o in vivo di proteine ad uso terapeutico.
Chimica degli oligonucleotidi: sintesi di geni
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INGEGNERIA GENETICA
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Procedura di manipolazione del DNA: produzione di nuove
combinazioni di materiale ereditabile, ottenute mediante inserzione
di materiale genico di qualunque provenienza. La tecnica permette
di trasferire materiale genetico da un organismo a un altro in
condizioni non naturali anche se le cognizioni su cui si basa e gli
strumenti impiegati sono tutti derivati dall’osservazione dei fenomeni
naturali.
Tecnica del DNA ricombinante : modifica le caratteristiche genetiche
di piante e animali, in modo da migliorare la produzione agricola e
zootecnica in senso sia qualitativo che quantitativo.
Alterazione artificiale del corredo genetico: sia inserzione che
ablazione di un gene. (GMO).
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STRUMENTI DELL’INGEGNERIA GENETICA
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ENZIMI : consentono di tagliare il DNA in punti specifici, in modo da
separare il tratto di DNA desiderato, di legarlo al vettore prescelto, o
modificato in vitro, in modo conveniente alle proprie necessità.
VETTORI: consentono l’ingresso del gene scelto nella cellula ospite,
provvedono alla replicazione del DNA eterologo ed alla sua
espressione.
ORGANISMI OSPITI: batteri, cellule animali e e vegetali, lieviti.
Sono dotati di caratteristiche altamente specifiche. Le loro
caratteristiche genetiche o biochimiche li rendono più o meno adatti
a detrminate applicazioni pratiche o ad ospitare vettori.
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STRUMENTI DELL’INGEGNERIA GENETICA
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Enzimi di restrizione: prodotti da diverse specie batteriche per le
quali rappresentano un mezzo di difesa, contro l’invasione dei
batteriofagi, in quanto degradano ogni DNA riconosciuto come
stampo.
Questi enzimi tagliano la doppia elica del DNA in punti precisi
caratteristici per ognuno di essi. Le dimensioni delle sequenze
vanno da 4 a 8 paia di basi. Le sequenze riconosciute sono dette
palindromi, sono sequenze con simmetria binaria in direzione di
lettura 5’ 3’ sono praticamente identiche.
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Modalità di taglio da enzimi di restrizione
AA TT
TT AA
Blunt – end: le due eliche sono uguali
G AA TT C
C TT AA G
Sticky – end: eliche a lunghezza differente
estremamente adesive, produzione di molecole
chimeriche in notevole quantità.
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Vettore
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VETTORI: trasferiscono il DNA esogeno nella cell. ospite in modo
da farlo replicare e trasmetterlo alle cellule figlie, mediante il vettore
è possibile introdurre un frammento di DNA qualsiasi in una cellula
eucariota o procariota, sia mediante microinieizione che ricorrendo a
metodi chimico fisici adeguati per rendere permeabile la membrana.
Il frammento deve esser stabile si deve replicare insieme con il DNA
ad ogni replicazione cellulare, eventualmente il DNA può essere
anche fornito di segnali appropriati che lo rendono un’informazione
genetica comprensibile.
Le funzioni di espressione, stabilità sono caratteristiche del vettore
prescelto.
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Tipi di vettore
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Elemento genetico extracromosomico (cosmide o plasmide)
VIRUS ANIMALI
FAGI
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Tipi di vettore
Vettori di clonaggio
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Plasmidi di piccole dimensioni facili da isolare e purificare, con
capacità di replicazione autonoma, conferita anche da un’origine di
replicazione autonoma. Esitono vettori sintetici in forma plasmidiale
che sono atti a varie operazioni clonaggio, espressione, trascrizione.
pBR322.
Fagi : fago lambda con genoma completamente sequenziato e
fornito di appropriate mutazioni, in modo da adattarlo alle necessità
del clonaggio, vengono eliminati alcuni geni del fago che sono
sostituiti dal DNA esogeno.
I fagi presentano il vantaggio di ospitare frammenti di DNA più
lunghi.
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Vettori virus animali
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I vettori considerati consentono trasferimento di geni nelle cellule
batteriche e di lievito.
Per introdurre DNA esogeno nelle cellule superiori si adottano come
vettori i virus animali in grado di infettare cellule in vitro o in vivo di
replicarsi e in alcuni casi di integrarsi nel genoma.
Papovirus scimmia (SV$0), papilloma virus bovino, virus herpes,,
possono infettare e in alcuni casi trasformare una varietà di linee
cellulari.
Efficienza di introdurre il proprio DNA nella cellula ospite.
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Clonaggio
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Significa fare una copia identica; un frammento di DNA inserito in un
vettore che viene replicato un numero elevato di volte una volta che
il vettroe raggiunge la cellula ospite, si può anche riferire ad un
organismo che produce una popolazione di cellule o individui
identici a se stesso (clone)
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Biotecnologie innovative
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Prima dello sviluppo delle biotecnologie del DNA ricombinante la
maggior parte dei farmaci umani, di natura proteica era disponibile
in quantità limitata, a questo va aggiunto la trasmissione di malattie
infettive in seguito alle trasfusioni di sangue o la comparsa di serie
manifestazione di ipersensibilità.
Sfruttando la tecnologia del DNA ricombinante è stato possibile
produrre un’ampia serie di farmaci in quantità sufficiente molto
efficaci e soprattutto sicuri.
Attualmente 300 proteine con attività terapeutica vengono prodotte
dai microrganismi, contenenti lo specifico gene codificante.
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INSULINA DA DNA
RICOMBINANTE
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Formata da due catene A e B, difficile ricavare il gene proinsulinico
(forma immatura della proteine che viene poi trasformata in insulina)
direttamente dalle cellule umane.
Di provenienza bovina o suina presentava notevoli problemi di
allergia, di costi, di produzione, di minore efficacia dovute ai mezzi
di estrazione e purificazione.
Estrazione del RNAm dalle cellule beta del pancreas
retrotrascrizione in DNA, sintesi chimica in laboratorio il gene della
proinsulina o delle singole catene A e B.
Dopo avere ottenuto il gene si ha l’ immissione nel batterio E. coli
(ospite) che sarà commissionato alla produzione di insulina umana.
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Prodotti da ricombinazione genetica
 Ormoni
peptidici
 Proteine del sangue fattori di coagulazione
 Peptidi atriali e neuropeptidi
 antibiotici
 Vaccini ricombinanti
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Vaccini ricombinanti
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In una cellula eucariota o procariota viene clonato il gene del
microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena
che induce nell’ospite la produzione di anticorpi protettivi.
Vaccini virali, capside o envelope, vaccini batterici fimbrie, pili etc.
L’applicazione maggiormente conosciuta è quella del vaccino
contro l’epatite B , in genere per la produzione vaccinica si usano
sempre cellule eucariote per mantenere inalterate tutte le forme di
modificazioni postraduzionale.
Si isola il gene per l’antigene HbsAg detto antigene australia, vien
espresso in una cellula di S. cerevisiae. Purezza del 98%. Nessuna
rischio di ipersensibilità o intolleranza rispetto a vaccini ottenuti con
raccolta di sangue umano.
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