La tecnologia del DNA ricombinante

INGEGNERIA GENETICA
a.s. 2009-10
Nascita e sviluppo dell'ingegneria genetica
1928 Dimostrazione che il DNA può trasformare geneticamente (Griffith)
1944 Si dimostra che l'informazione genetica è contenuta nel DNA (Avery)
1953 Si pubblica la struttura del DNA (Watson e Crick)
1966 Decifrazione del codice genetico
1970 Isolamento dei primi enzimi di restrizione
1972 Sintesi chimica di un gene (Khorana)
1973 Primi clonaggi in batteri (Boyer e Cohen)
1976 Conferenza di Asilomar sulle ricadute tecniche del DNA ricombinante
1976 Metodo di sequenziamento del DNA (Maxam e GiIbert)
1978 Si commercializza la prima insulina umana
1980 Si brevettano in USA i primi organismi ricombinanti
1983 Si ottengono le prime piante transgeniche
1988 Viene pubblicato il metodo della PCR (Mullis)
1990 Si inizia la sperimentazione sull'uomo della terapia genica
1996 Viene completata la prima sequenza di un gene eucariotico
1997 Viene clonata una pecora (Dolly) da un nucleo di cellula differenziata
2001 Viene pubblicata la sequenza del genoma umano
La tecnologia del DNA ricombinante
Mediante l’introduzione dei plasmidi si possono
modificare i batteri e indurli a svolgere funzioni utili
– La maggior parte dei metodi utilizzati per
studiare e manipolare il DNA utilizza i batteri e
in particolare Escherichia coli.
– Per manipolare i geni in laboratorio i biologi
usano spesso i plasmidi batterici, che possono
portare a duplicare all’interno di un batterio
qualsiasi gene.
– I plasmidi sono gli strumenti chiave della
clonazione genica, ossia la produzione di molte
copie identiche di tratti di DNA.
– I ricercatori possono inserire in un plasmide un
pezzo di DNA contenente un gene dando origine
a DNA ricombinante.
– Il plasmide viene poi introdotto nella cellula
batterica.
– Il batterio geneticamente modificato è messo in
coltura e si riproduce per formare un clone di
cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula
madre da cui derivano).
– Ogni cellula possiede una copia del gene.
CLONAZIONE GENICA
Batterio
1
Si isola un plasmide
2
3
Cromosoma
batterico
Plasmide
Si inserisce
un gene nel
plasmide
DNA ricombinante
(plasmide)
2
Si isola il
DNA
Cellula contenente il
gene prescelto
DNA
Gene prescelto
4
Si introduce il plasmide nella
cellula prescelta
Batterio
ricombinante
Si clona la cellula che possiede il
gene prescelto
5
Copie
di proteine
Copie
di geni
Il gene per la
resistenza
alle malattie
è inserito
nelle piante
Clone della
cellula
Il gene modifica i batteri e li rende in
grado di eliminare i rifiuti tossici
La proteina consente
alla neve
di formarsi anche a
temperature maggiori
La proteina viene usata per sciogliere
i coaguli nella terapia contro gli infarti
Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano
particolari enzimi



Gli strumenti per ottenere DNA ricombinante sono:
enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che
riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le
tagliano in punti precisi;
l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di
DNA catalizzando la formazione di legami covalenti.
Produzione di DNA
ricombinante tramite l’uso di
enzimi di restrizione e
dell’enzima DNA-ligasi:
L’enzima di restrizione riconosce la sequenza
1
GAATTC
CTTAAG
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
2
Estremità coesiva
Aggiunta di un frammento di DNA
di provenienza estranea
3
Due frammenti si attaccano tra
loro appaiando le basi azotate
4
G A AT T C
C T TA A G
G A AT T C
C T TA A G
L’enzima DNA-ligasi
incolla i frammenti
5
DNA ricombinante
I geni dei plasmidi ricombinanti si possono clonare
• I plasmidi entrano nei batteri per trasformazione.
• I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono messi in
condizione di riprodursi, dando origine a un clone di
cellule con molte copie dei plasmidi e dei geni che
trasportano.
Clonazione di un
gene in un plasmide
batterico:
1 Si isola il DNA da due fonti diverse
2 Si tagliano
entrambi i DNA con
un enzima di
restrizione
E.coli
Plasmide
Cellula umana
DNA
Gene V
Estremità coesive
3 Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono
mediante
appaiamento di basi azotate
4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con
legami covalenti
Plasmide con
DNA ricombinante
Gene V
5 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite
trasformazione
Batterio
ricombinante
6
Si clona il batterio
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
Per ottenere molte copie di una specifica
sequenza di DNA si utilizza comunemente la
tecnica PCR
Quando il campione di DNA è
scarso o impuro, la reazione a
catena della polimerasi
(Polymerase Chain Reaction, o
PCR) è un metodo più appropriato
per ottenere un grande
quantitativo
di un particolare gene.
Molecola
iniziale
di DNA
1
2
4
8
Numero di molecole di DNA
I geni clonati possono essere conservati in
«librerie» genomiche
L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun,
derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una
cellula, è chiamata libreria genomica.
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione
Plasmide
ricombinante
DNA fagico
ricombinante
oppure
Clone
batterico
Libreria plasmidica
Clone
fagico
Libreria fagica
Si può produrre DNA da clonare anche mediante
l’enzima trascrittasi inversa
L’enzima trascrittasi inversa
può essere usato per ottenere
librerie di DNA
complementare (cDNA)
contenenti solo i geni espressi
da un particolare tipo di
cellula.
Cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati
per ottenere prodotti genici su larga scala
• Le applicazioni della clonazione genica includono la
produzione di prodotti genici su larga scala per usi
medici e altri usi.
• I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi
migliori per sintetizzare un prodotto proteico.
• Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le
cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.
La tecnologia del DNA sta cambiando l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
• La tecnologia del DNA ha avuto un enorme impatto
sull’industria farmaceutica e sulla medicina umana.
• Le sue tecniche sono ampiamente utilizzate per
produrre farmaci e per la diagnosi delle malattie.
Terapie ormonali
• L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati i
primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della
tecnologia del DNA ricombinante.
• Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i
tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.
Diagnosi e cura delle malattie
• In campo medico la tecnologia del DNA sarà,
probabilmente, sempre più usata per diagnosticare le
malattie.
• Oltre alla sua evidente importanza nell’identificazione
degli alleli associati alle malattie genetiche, si rivela
infatti utile nel localizzare le infezioni.
Vaccini
• Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in
grado si sintetizzare anche nuovi vaccini.
• Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un
agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è
utilizzato per prevenire una malattia infettiva.
L’analisi dei frammenti di restrizione e le
impronte genetiche
Le sonde molecolari identificano i cloni che portano
determinanti geni
– La tecnologia del DNA può essere usata per
identificare specifici frammenti di DNA.
– I metodi utilizzati per individuare direttamente un
gene si basano tutti sull’accoppiamento tra le basi
azotate del gene in questione e quelle di una
sequenza complementare appartenente a un’altra
molecola di acido nucleico (DNA o RNA).
• Per trovare una specifica sequenza nucleotidica
all’interno di un certo quantitativo di DNA si usa una
molecola chiamata sonda.
• Le sonde di acidi nucleici sono brevi filamenti singoli
di DNA o RNA marcati radioattivamente o
fluorescente che possono legarsi a un determinato
gene in una libreria.
Sonda radioattiva
(DNA)
La sonda viene mescolata
col DNA a filamento singolo
prelevato da vari cloni batterici o fagici
DNA a filamento singolo
Mediante l’appaiamento
delle basi azotate
si individua il gene prescelto
I microarray a DNA forniscono
contemporaneamente informazioni
sull’espressione di molti geni
• Per effettuare analisi su larga scala, per determinare
quali geni sono attivi in una particolare cellula in un
dato momento, si può usare la tecnica che impiega i
microarray a DNA.
• Il microarray a DNA è un vetrino rettangolare, non
più grande dell’impronta di un pollice, contenente
uno strato di molecole a filamento singolo di DNA,
che portano migliaia di geni noti e diversi.
L’elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA in
base alle loro dimensioni
Miscela di molecole
di DNA di dimensioni
diverse
-
+
Molecole
più lunghe
Generatore
elettrico
Gel
+
Molecole
più corte
+
Disposizione finale
Il polimorfismo della lunghezza dei frammenti di
restrizione permette di individuare le differenze tra
sequenze di DNA



I marcatori genetici comprendono geni, siti di
restrizione e tratti di DNA non codificante.
L’analisi dei frammenti di restrizione è un metodo per
individuare le differenze nelle sequenze nucleotidiche
tra campioni omologhi di DNA.
Il numero dei frammenti di restrizione e la loro
lunghezza riflettono la sequenza specifica di nucleotidi
nel DNA di partenza.
In che modo i frammenti di restrizione riflettono la
sequenza del DNA

Le differenze tra i frammenti di restrizione che vengono
prodotte sono dette poliformismi della lunghezza dei
frammenti di restrizione
(Restriction Fragment Length
Polymorphisms o RFLP) e
riflettono le differenze nelle
sequenze del DNA di partenza.

Allele I
(scena del crimine)
Allele II
(indiziato)
w
Taglio
C
C
G
G
G
G
C
C
z
A
C
G
G
T
G
C
C
x
Taglio
y
C
C
G
G
G
G
C
C
Taglio C G
y
C G
G C
G C
DNA prelevato dai cromosomi
Dopo il taglio con gli enzimi di restrizione, i frammenti
vengono separati su un gel:
1
–
2
Frammenti
più lunghi
z
x
w
Frammenti
più corti
+
y
y
Per individuare gli alleli difettosi si possono usare le
sonde a DNA


Un’importante applicazione dell’analisi dei frammenti
di restrizione consiste nell’individuare alleli con
alterazioni correlabili a patologie genetiche non
manifeste.
Le sonde radioattive possono rivelare bande di DNA
d’interesse su un gel.

Utilizzo dell’analisi dei frammenti di restrizione per
individuare un allele dannoso:
1
Preparazione dei
frammenti di restrizione
I
II
III
Frammenti
di restrizione
2
Elettroforesi su gel
3
Assorbimento
4
Sonda radioattiva
I II III
Carta da filtro
Filamento singolo
di DNA radioattivo (sonda)
Sonda
5
Rilevamento della
radioattività
(autoradiografia)
I
II
III
Pellicola
I
II
III
Impieghi della tecnologia del DNA in campo legale


La tecnologia del DNA viene ampiamente utilizzata in
medicina legale per analizzare le prove rinvenute sulla
scena di un crimine.
Il test del DNA può consentire di individuare il
responsabile con una certa sicurezza poiché la
sequenza di basi azotate del DNA di ogni persona è
unica (tranne nel caso dei gemelli identici).

Un’impronta genetica (DNA fingerprint) può
aiutare a risolvere in crimine:
Sangue
dell’imputato
Sangue rinvenuto
sui vestiti dell’imputato
Sangue
della vittima
Un giorno la terapia genica potrebbe fornire la
cura per molte malattie
La terapia genica può correggere le malattie
imputabili a un singolo gene difettoso, sostituendolo o
integrandolo con un allele normale.
Gene clonato
(allele normale) 1 Inserimento del gene normale nel virus
Acido nucleico virale
Retrovirus
2 Le cellule del midollo osseo vengono infettate con il virus
3 Il DNA virale si inserisce nei cromosomi
Cellule di midollo osseo del paziente
Midollo osseo
4 Le cellule
vengono iniettate nel paziente




La terapia genica potrebbe un giorno essere usata per
curare sia le malattie genetiche, sia le malattie non
genetiche.
Anche se è uno strumento molto promettente,
esistono ancora poche prove scientifiche evidenti
della sua efficacia.
La ricerca continua seguendo linee guida nuove e più
sicure.
La terapia genica sull’uomo solleva problemi sia
tecnici sia etici.
La genomica e gli OGM
Il Progetto Genoma Umano

Lo scopo primario del Progetto Genoma Umano
(PGU) è mappare l’intero genoma dell’uomo e
determinare la sequenza nucleotidica completa del
DNA umano.

Iniziato nel 1990, è oggi largamente completato: nel
2001 sono stati pubblicati i risultati del
sequenziamento di oltre il 90% del genoma umano.

I dati ottenuti stanno fornendo informazioni su
sviluppo, evoluzione e molte malattie.

I benefici che possono derivare dalla conoscenza del
genoma umano riguardano essenzialmente la ricerca
di base.

L’enorme numero di dati raccolti è depositati in un
archivio accessibile in rete ai ricercatori di tutto il
mondo.
La maggior parte del genoma umano non è costituito da geni

Il genoma umano comprende circa 35 000 geni che codificano per varie
proteine, nonché per i tRNA e gli rRNA.

Oltre a questi geni, come quello della maggior parte degli eucarioti
complessi, il genoma umano include un’enorme quantità di DNA non
codificante (circa il 97% del totale).

Nella porzione di DNA non codificante sono comprese le sequenze
regolatrici, come i promotori e gli enhancer.

Il restante DNA, che comprende gli introni, e il DNA non codificante
localizzato tra i geni, è stato chiamato junk DNA, ossia «DNA spazzatura».
Grazie alla scienza della genomica sono stati
sequenziati interni genomi



Oltre a mappare il DNA umano, ricercatori di tutto il
mondo stanno lavorando anche sui genomi di altre
specie.
Alcuni genomi sono stati completamente sequenziati.
La maggior parte dei genomi in corso di studio
riguarda i procarioti, il gruppo include però anche una
ventina di specie eucariotiche (tra cui vertebrati,
invertebrati e piante).
Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma
è utile in particolare ai fini dell’analisi comparativa
con il genoma umano, che gli scienziati stanno
tentando di interpretare.


La proteomica è lo studio sistematico degli insiemi
completi di proteine (proteomi) codificati dai genomi.
Il numero delle proteine presenti negli organismi
umani supera di gran lunga quello dei geni.
Gli organismi geneticamente modificati stanno
trasformando l’agricoltura



Gli scienziati che si occupano del fabbisogno
alimentare mondiale hanno cominciato a usare la
tecnologia del DNA per produrre organismi
geneticamente modificati (OGM), piante e animali,
da utilizzare in agricoltura.
Un organismo geneticamente modificato è un
organismo ottenuto grazie alla modificazione o
all’aggiunta di uno o più geni.
Un OGM si può ottenere anche con i normali metodi
di incrocio.

Utilizzo del plasmide Ti (un plasmide che proviene
dal batterio del suolo Agrobacterium tumefaciens)
come vettore per modificare geneticamente le
piante:
Agrobacterium tumefaciens
DNA contenente il gene prescelto
Plasmide
Ti
T DNA
Sito di restrizione
1
Inserimento del
gene di un plasmide
mediante l’enzima
di restrizione e la
DNA-ligasi
Plasmide Ti
ricombinante
Cellula vegetale
2
3
Inserimento
in cellule
vegetali
in coltura
Crescita
della pianta
Il T DNA inserito
porta il nuovo gene
Pianta con
caratteristiche nuove


I genetisti molecolari sono in grado di produrre
animali transgenici che hanno, inseriti nel proprio
genoma, geni provenienti da altri organismi.
Anche molte colture e piante sono geneticamente
modificate.
Gli organismi GM possono danneggiare
l’ambiente o la salute umana?
Lo sviluppo di organismi GM richiede severe misure
di sicurezza.


Gli organismi GM possono rappresentare un rischio per
l’ambiente o la salute.
Il maggior pericolo per l’ambiente potrebbe essere
rappresentato dal trasferimento di geni modificati dalle
colture GM alle colture vicine.