LA RICERCA NEL CAMPO DEGLI OGM
Dr. LORENZA DARODA
LE SCOPERTE SCIENTIFICHE DEL
NOSTRO SECOLO NEL CAMPO DELLA
GENETICA
E DELLA
BIOLOGIA MOLECOLARE
HANNO PERMESSO DI SVILUPPARE
TECNOLOGIE IN GRADO DI
MODIFICARE IL PATRIMONIO
GENETICO DI ORGANISMI COME
ANIMALI, PIANTE, BATTERI, VIRUS.
ORGANISMI GENETICAMNETE
MODIFICATI - OGM
Identificazione di un gene
Isolamento del gene
Inserimento in un vettore
Introduzione in un ospite
PRODUZIONE IN ANIMALI TRANSGENICI
La maggior parte delle proteine terapeutiche ricombinanti e’ stata prodotta in
fluidi del corpo dei mammiferi come nel latte permettendo una raccolta
periodica senza rendere necessario l’abbattimento del animale.
Per usi commerciali si sta porgendo attenzione su
conigli, mucche, maiali, pecore, capre che producono grandi quantità di latte.
Altri fluidi come il siero del sangue, urina e fluido seminale sono in via di
sperimentazione.
UOVA DI POLLO: i polli producono 300 uova
l’anno ogni uovo contiene 6g di proteine quindi
una batteria di 5000 polli potrebbe produrre
150kg di proteina ricombinante / anno.
PRODUZIONE IN INSETTI TRANSGENICI
PROTEINE RICOMBINANTI POSSONO ESSERE
PRODOTTE IN CELLULE D’INSETTO MEDIANTE
TRASFORMAZIONE STABILE O TRAMITE INFEZIONE
MEDIANTE VETTORI RICOMBINANTI DI
BACULOVIRUS CHE PERMETTE L’ ESPRESSIONE
TRANSIENTE CON RESA ELEVATA.
I VANTAGGI SONO L’ABBATTIMENTO DEI COSTI
RISPETTO ALLE CELLULE DI MAMMIFERO
Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jul;62(1):1-20.
Insect cell culture for industrial production of recombinant
proteins. Ikonomou L, Schneider YJ, Agathos SN.
RECENTEMENTE SI SONO SPERIMENTATE LA
PRODUZIONE DI COLLAGENE UMANO IN
LARVE DI BACO DA SETA.
Nature Biotechnology 21, 34 - 35 (2003)
Human therapeutic proteins from silkworms
Florian M. Wurm
Centro Ricerche Casaccia - Roma
Unità Tecnico Scientifica
Biotecnologie, Protezione della Salute
e degli Ecosistemi
Sezione Genetica e Genomica Vegetale
•Produzione di piante resistenti a fitopatie virali/fungine
•Produzione in pianta di molecole per uso biomedico
•Studi di impatto ambientale di piante geneticamente modificate
•Genomica e proteomica di specie vegetali di interesse
•Genotipizzazione della biodiversità di specie vegetali e
microbiche di interesse agrario
•Citogenetica e citometria a Flusso
Meccanismo naturale di trasferimento stabile di geni mediata da
Agrobacterium tumefaciens
DNA genomico
cromosoma
plasmide Ti
Galle del
colletto
Cellula vegetale
trasformata
DNA genomico
cromosoma
plasmide Ti
Galle
colle
Cellula vegetale
trasformata
Trasformazione mediata
da Agrobacterium
Trasformazione diretta per
Trasformazione diretta
elettroporazione o chimica tramite cannoncino biolistico
percussore
Il DNA esogeno penetra nella cellula
privata della parete (protoplasto)
proiettile di plastica che
spinge le microparticelle
ricoperte di DNA
DNA esogeno adeso a
microparticelle di
tungsteno
camera da
vuoto
Infezione e
trasferimento del
DNA esogeno
Formazione di callo
in coltura in vitro
Rigenerazione di
piantine in vitro
Cellula vegetale
che ha integrato il
DNA esogeno
nei propri
cromosomi
Pianta
geneticamente
trasformata
Tratti agronomici
Aumento della produttività
Resistenza agli insetti, virus, funghi, nematodi.
Resistenza a stress ambientali siccità, salinità.
Tolleranza al alluminio (un fattore limitante di crescita nei suoli acidi)
Modificazione dei componenti nutrizionali
Aumento contenuto vitamine, ferro, proteine,
Rimozione di composti allergenici
Aumento contenuto amido nelle patate
Aumento del contenuto in acido oleico e laurico
Aumento del contenuto di antiossidanti (licopene e
luteina pomodoro, isoflavoni soia)
Biofabbrica di composti per uso biomedico ed industriale
Produzione di vaccini, anticorpi, ormoni e composti
terapeutici.
Produzione di biopolimeri per industria (plastiche,
detergenti), fonti di energia (bio-diesel)
Le prime proteine ricombinanti derivanti da piante,
venivano prodotte in tabacco ed estratte direttamente
dalle foglie raccolte.
Una pianta facilmente trasformabile, che si conosceva
geneticamente affondo, che permetteva grosse rese in
biomassa, ottimale per il molecular farming.
Non appartiene alle specie commestibili, e quindi non
presenta problemi di contaminazione con la catena
alimentare.
Molte società biotecnologiche hanno adottato il tabacco per la
loro produzione come
Mersistem Therapeutics (www.meristem-therapeutics.com)
Planet biotechnology (www.planetbiotechnology.com)
Unico grosso problema del tabacco, la presenza di alcaloidi
che devono essere rimossi completamente durante la
purificazione del composto.
Proteine espresse nei semi dei
cereali sono protette
degradazione proteolitica
possono restare stabili fino a 3
anni a temperatura ambiente, e
più anni in frigorifero senza
perdere la loro attività.
Numerosi cereali riso, grano
orzo, mais, sono in
sperimentazione per la
produzione di farmaceutici.
Il mais scelto dalla Prodigene Inc. (www.prodigene.com) per la sua elevata
biomassa, facilità di trasformazione, manipolazione in vitro, le culture facilmente
estendibili. Prodigene sta sperimentando l’uso del mais per la produzione di:
vaccini
anticorpi ricombinanti
enzimi industriali
Per la produzione in larga scala di biofarmaceutici sono stati utilizzati
organi di piante edibili, come per esempio i tuberi della patata, il primo
importante sistema per la produzione di vaccini.
Center for Infectious Diseases and Vaccinology
ARIZONA STATE UNIVERSITY
Tessuti di patata transgenica esprimente vaccini sono già stati
somministrati in pazienti in 3 diversi trial clinici contro vari patogeni umani:
•Batterio E.Coli enterotossico (tossina B del batterio)
Nat Med. 1998 May;4(5):607-9.
Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato.
Tacket CO, Mason HS, Losonsky G, Clements JD, Levine MM, Arntzen CJ.
•Virus Norwalk (proteina del capside del virus NVCP)
J.INF.DIS 2000, 182: 302-305
Human Immune Responses to a Novel Norwalk Virus Vaccine Delivered in Transgenic Potatoes
Carol O.Tacket, Hugh S.Mason, Genevieve Losonsky, Mary K.Estes,Myron MLevine and
Charles J.Arntzen
•Virus Epatite B (antigene di superficie del virus HBV)
Nat Biotechnol. 2000 Nov;18(11):1167-71.
Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization.
Richter LJ, Thanavala Y, Arntzen CJ, Mason HS.
Tra le altre piante utilizzate come biofabbrica di molecole
terapeutiche, soprattutto vaccini edibili, troviamo
pomodoro, banane e carote.
il pomodoro ha il vantaggio che può essere cresciuto in
serra offrendo un contenimento adeguato;
la banana ha il vantaggio di poter veicolare nei paesi africani
vaccini che altrimenti non avrebbero modo di arrivare ed
essere mantenuti in ambienti refrigerati;
la carota puo’ stoccare naturalmente il composto nella
radice che è anche la sua parte edibile.
Già utilizzata per vaccini contro il Virus del morbillo
Vaccine. 2005 Mar 18;23(17-18):2074-7.
Induction of broadly neutralizing antibodies
against measles virus mutants using a
polyepitope vaccine strategy.
Bouche FB, Steinmetz A, Yanagi Y, Muller CP.
Nome
Formato
Specificità
Pianta
Proprietà
Avicidin
IgG
Molecola epiteliale di adesione
cellulare (EpCAM) correlata al colon
rettale
mais
NeoRx e Monsanto
CaroRx
Iga/IgG chimerica
secretoria
tabacco
St. George’s Hospital
Medical School,
Londra
T84.66
Anti-HSV
IgG
ScFv
ScFv + interleukin-2
IgG1
Principale proteina di adesione dello
Streptococcus mutants agente della
carie
Carcinoembryonic antigen (CEA),
marcatore di carcinomi epiteliali
soia
Anti-RSV
IgG
Glicoproteina B dell’herpes simplex
(HSV)-2
Proteina R9 del virus respiratorio
sinciziale (RSV)
38C13
scFv
Idiotipo di linfociti B maligni (da
cellule di linfoma linea 38C13)
PIPP
IgG
Gonadotropina corionica umana
(hCG)
Per terapia e diagnosi di tumori che
producono h CG, test di gravidanza e
contraccezione.
piante
infettate con
virus
tabacco
diverse
Stato di
sperimentazione
Trial clinico fase II
Trial clinico fase II
Trial clinico fase II
soia
Epicyte
Pharmaceuticals
Epicyte
Pharmaceuticals
Trial clinico fase II
Large Scale Biology
Trial clinico fase I
Trial clinico fase II
Trial clinico fase I
IN CLINICAL TRIALS
Vaccini ricombinanti
Epatite B
Tipo di pianta
tabacco foglie
patata tubero
lattuga
Enterotossina E.Coli
mais semi
patata tubero
Rabbia
pomodoro
Colera (subunità dellaTossina B)
tabacco foglie
patata tubero
Tetano
tabacco foglie
Stafiloccocco aureus
tabacco
Twyman RM et al 2005
Misure di contenimento
IL CONTENIMENTO
Bisogna garantire un CONTENIMENTO a queste piante per
ridurre al minimo il rischio di dispersione del transgene
sugli organismi non-target e sull’ambiente in generale
Il contenimento può essere
un confinamento di tipo fisico
oppure di tipo biologico.
IL CONTENIMENTO
DI TIPO FISICO
LABORATORIO
Le Good Laboratory Practices (GLP) sono le pratiche di laboratorio che
garantiscono l’uso appropriato del materiale biologico all’interno dei
laboratori e quindi assicurano una corretta gestione.
¾ Utilizzo dei reagenti
¾ Utilizzo degli strumenti
¾ Addestramento del personale
Le piante transgeniche, sono numerate e
monitorate durante tutte le fasi della loro
produzione, dalla trasformazione alla
rigenerazione.
Le piante dopo la trasformazione vengono
cresciute in vitro in appropriate camere
di crescita in condizioni estremamente
controllate.
Durante il loro sviluppo, alcune piante
vengono selezionate per delle specifiche
caratteristiche, mentre gli scarti vengono
invece trattati ed inattivati tramite i
metodi tradizionali (autoclavatura,
sterilizazione… etc) in modo che
il materiale biologico non possa
sopravvivere fuori dalle strutture del
laboratorio.
Serra a Contenimento
L’obiettivo del contenimento è quello di
prevenire il trasferimento del DNA
ricombinante dagli organismi transgenici che
sono collocati all’interno della serra alle
popolazioni che si trovano all’esterno.
Vi sono quattro livelli di contenimento, ed è il livello di contenimento
adeguato a garantire la sicurezza della classe dell’impiego confinato.
livello P1: esperimenti con piante transgeniche che non presentano evidenti
rischi per l’ambiente e che non possono sopravvivere o diffondere nell’ambiente.
livello P2: esperimenti con piante transgeniche ed organismi associati patogeni o
microrganismi esogeni potenzialmente dannosi ma che correttamente gestiti non
pongono grossi rischi per gli ecosistemi circostanti.
livello P3: esperimenti con piante transgeniche e patogeni che di per sé sono
considerati dannosi perché in grado di provocare seri problemi all’ambiente
circostante.
livello P4: esperimenti con
piante transgeniche e patogeni
che sono in grado di trasmettere
malattie molto dannose alle
coltivazioni dell’ambiente
circostante, eseguiti in presenza
dei vettori di trasmissione di
questi patogeni.
Il CONTENIMENTO DI TIPO BIOLOGICO
Ridurre al minimo il rischio di dispersione del transgene e di limitare
l’impatto delle proteine ricombinanti sugli organismi non-target e
sull’ambiente in generale.
Sviluppo di metodologie che prevedono l’isolamento riproduttivo,
spaziale e temporale, controllo della fioritura e della fertilità della
piante transgeniche :
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Barriere per l’ibridazione
Inibizione della fioritura
Apomissia
Maschio sterilità
Cleistogamia
Eliminazione manuale dell’infiorescenza
Tempi di fioritura sfalsati
Semi sterili
Sviluppo di metodologie che prevedono la localizzazione
dell’espressione della proteina d’interesse unicamente in specifici
compartimenti cellulari, tessuti o organi :
¾Induzione controllata
¾Cloroplasto
¾Organi di riserva
¾Radici
Il nostro interesse :
Produrre molecole terapeutiche attraverso la RIZOSECREZIONE in
ambiente controllato (culture idroponiche).
Alte rese di espressione proteica, misure di contenimento fisico e
biologico.
Drake PM, Chargelegue DM, Vine ND, van Dolleweerd CJ, Obregon P, MaJK.
Rhizosecretion of a monoclonal antibody protein complex from transgenic
tobacco roots.
Plant Mol Biol. 2003 May;52(1):233-41.
Gaume A, Komarnytsky S, Borisjuk N, Raskin I.
Rhizosecretion of recombinant proteins from plant hairy roots.
Plant Cell Rep. 2003 Aug;21(12):1188-93. Epub 2003 Jun 18.
Menkhaus TJ, Bai Y, Zhang C, Nikolov ZL, Glatz CE.
Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.
Biotechnol Prog. 2004 Jul-Aug;20(4):1001-14.
Drake PM, Chargelegue D, Vine ND, Van Dolleweerd CJ, Obregon P, Ma Jk
Transgenic plants expressing antibodies: a model for phytoremediation.
FASEB J. 2002 Dec;16(14):1855-60.
Borisjuk NV, Borisjuk LG, Logendra S, Petersen F, Gleba Y, Raskin I.
Production of recombinant proteins in plant root exudates.
Nat Biotechnol. 1999 May;17(5):466-9.
Komarnytsky S, Gaume A, Garvey A, Borisjuk N, Raskin I.
A quick and efficient system for antibiotic-free expression of heterologous genes in
tobacco roots.
Plant Cell Rep. 2004 May;22(10):765-73. Epub 2004 Feb 10.
Medina-Bolivar F, Cramer C.
Production of recombinant proteins by hairy roots cultured in plastic sleeve
bioreactors.
Methods Mol Biol. 2004;267:351-63.
Christey MC, Braun RH.
Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenesmediated transformation.
Methods Mol Biol. 2005;286:47-60.
Finer JJ.
Plant protein secretion on tap.
Nat Biotechnol. 1999 May;17(5):427. No abstract available.
Gleba D, Borisjuk NV, Borisjuk LG, Kneer R, Poulev A, Skarzhinskaya M,
Dushenkov S, Logendra S, Gleba YY, Raskin
Use of plant roots for phytoremediation and molecular farming.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 May 25;96(11):5973-7. Review.
Rizosecrezione
Strumenti internazionali
di regolamentazione
• Protocollo di Cartagena
http://www.biodiv.org/biosafety
Organizzazioni internazionali di
sostegno ai paesi in via di sviluppo
•
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED
NATIONS
http://www.fao.org/
United Nations Environment Programme
http://www.unep.org/
http://www.who.int/
UNITED NATIONS INDUSTRIAL DEVELOPMENT
ORGANIZATION
http://www.unido.org/
The International Centre for Genetic
Engineering and Biotechnology
http://www.icgeb.trieste.it
AUTORITA’ COMPETENTI
U.S. Coordinated Framework
http://usbiotechreg.nbii.gov/roles.asp
Department of Agriculture USDA
http://www.aphis.usda.gov/.
Food and Drug Administration FDA
http://www.cfsan.fda.gov/~lrd/biotechm.html
Environmental Protection Agency EPA
http://www.epa.gov/oppt/biotech/
Europa
Italia
European Food Safety Authority EFSA
http://www.efsa.eu.int/
Joint Research Center JRC
http://europa.eu.int/
Commissione Interministeriale di Valutazione CIV
http://www.minambiente.it/
OGM immessi in commercio conformemente alla
direttiva
2001/18/CE
Decisione 2005/772/CE - granturco 1507
Decisione 2005/635/CE - colza GT73
Decisione 2005/608/CE - granturco MON 863
Decisione 2005/465/CE - colza GT73
Decisione 2004/643/CE - granturco NK 603
2001/18/CE
http://europa.eu.int/
http://gmoinfo.jrc.it/
http://www.minambiente.it/
LABORATORI
•Le nuove frontiere della genetica e della biologia molecolare.
•Tecnologie in uso
per la manipolazione
genetica.
•Biotecnologie per la cura
delle malattie dell’uomo
•Il limone geneticamente modificato può dare dei vantaggi all’agricoltura
in Sicilia?
