Cap. 4 - Ateneonline

Biologia molecolare 2/ed
Robert F. Weaver
Copyright © 2009 – The McGraw-Hill Companies srl
CAPITOLO 4: Tecniche di clonaggio molecolare
PER IL RIPASSO
1.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
AluI
BglII
ClaI
KpnI
PvuI
MboI
NotI
estremità piatte.
protrusione di 4 bp al 5’
protrusione di 2 bp al 5’
protrusione di 4 bp al 3’
protrusione di 2 bp al 3’
protrusione di 4 bp al 5’
protrusione di 4 bp al 5’
2. Per generare numerose copie di un frammento di DNA tipicamente lo facciamo replicare in E.
coli. Vettori del tipo dei plasmidi possiedono un’origine di replicazione, e l’inserimento di un
frammento di DNA nel plasmide permetterà la replicazione anche per il DNA esogeno.
3. Il clonaggio di un frammento nel sito PstI di pBR322 richiede che il frammento che intendiamo
clonare possieda estremità protrudenti PstI. Possiamo digerire il DNA purificato del vettore con
l’enzima di restrizione PstI (il sito PstI di pBR322 si trova all’interno del gene di resistenza
all’ampicillina), generando estremità complementari sul vettore. Si può quindi utilizzare la
DNA ligasi per chiudere in maniera covalente il frammento di DNA nel vettore, e questa
miscela di reazione può essere trasformata in cellule di E. coli. Per la presenza di un gene di
resistenza alla tetraciclina nel plasmide, la crescita delle cellule in tetraciclina consentirà
selezionerà le colonie con il plasmide. Delle cellule resistenti alla tetraciclina, quelle resistenti
anche all’ampicillina saranno quelle in cui il gene di resistenza all’ampicillina non è stato
interrotto dal frammento di DNA estraneo. Queste ultime possiedono plasmidi non
ricombinanti. Il secondo gruppo di cellule resistenti alla tetraciclina sarà quello che è risultato
sensibile all’ampicillina. In queste cellule il gene per la resistenza all’ampicillina sarà stato
inattivato dall’inserzione del DNA estraneo. Le colonie corrispondenti saranno quelle
desiserate, e per identificarle possiamo allestire repliche della piastra con l’intera popolazione
di cellule resistenti alla tetraciclina su due terreni, il primo contenente ampicillina, ed il
secondo privo di ampicillina. Le colonie che non cresceranno su ampicillina saranno così
identificate e recuperate dalle piastre senza ampicillina. Le colonie sensibili all’ampicillina e
resistenti alla tetraciclina conterranno il frammento di DNA che intendevamo clonare.
4. Il sito di clonaggio multiplo del vettore pUC18 si trova all’interno del gene lacZ’, che dirige la
sintesi dell’ peptide dell’enzima -galattosidasi. (La cellula ospite è stata modificata affinché
produca il peptide . Insieme, i peptidi  ed  si complementano a vicenda e producono
attività della-galattosidasi). La presenza di un gene lacZ’ intatto nel plasmide può essere
determinata, piastrando i batteri sul substrato X-gal che, quando è idrolizzato dalla galattosidasi fa rilasciare un colorante blu che colora le colonie. L’interruzione del gene lacZ’
da parte di un frammento di DNA risulterà nella perdita di attività -galattosidasica e nella
crescita di colonie bianche, in presenza di X-gal. Il clonaggio di un frammento di DNA nei siti
BamHI e PstI di pUC18 richiede il taglio del DNA plasmidico con BamHI e PstI, e la ligazione
del frammento di DNA, con estremità BamHI e PstI, nel vettore. La successiva reazione di
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trasformazione può essere piastrata su mezzo contenente ampicillina, che farà crescere solo le
colonie che possiedono il plasmide pUC18. I plasmidi ricombinanti, quelli con il frammento di
DNA inserito, potranno essere identificati piastrando su X-gal e ricercando le colonie bianche.
5. Il primo passaggio nel clonaggio di un frammento di DNA nel sito EcoRI di Charon (Caronte)
4 è la digestione del vettore Charon 4 con EcoRI, per rimuovere i frammenti di DNA di
riempimento. I bracci del vettore vengono purificati e mescolati al frammento di DNA da
clonare, che possiederà a sua volta estremità EcoRI. I frammenti di DNA sono ligati e il fago
ricombinante è quindi impacchettato in vitro con un estratto contenente teste e code fagiche,
oltre agli altri componenti necessari per generare particelle fagiche funzionali. Questi fagi
vengono utilizzati per infettare E. coli, e le placche con i fagi ricombinanti saranno isolate e
purificate.
6. I vettori pBR322, pUC e pBluescript sono adatti al clonaggio di un cDNA di 1 kb. I vettori
plasmidici possono replicarsi efficientemente con frammenti fino a circa 10 kb. pUC o
pBluescript sarebbero delle eccellenti scelte, perché essi offrono la possibilità di selezione dei
plasmidi ricombinanti secondo il colore bianco/blu delle colonie. Un vettore fagico del tipo di
Charon 4 non sarebbe una buona scelta, in quanto i limiti dell’impacchettamento non
consentono di ottenere particelle fagiche con frammenti di DNA estraneo più piccoli di 12 kb.
7. Un vettore cosmidico sarà la scelta appropriata per generare una collezione genomica di DNA
dalle dimensioni di 45 kb. I vettori cosmidici sono derivati dei vettori fagici con estremità
fagiche cos e un’origine di replicazione plasmidica di E. coli. La rimozione di tutte le sequenze
richieste per la replicazione fagica comporta che i vettori ricombinanti non eccedano i limiti di
impacchettamento anche quando portano grossi inserti, di 40-50 kb.
8. Un cromosoma artificiale batterico (BAC) è un vettore adatto per ottenere una collezione di
frammenti genomici di 100 kb. I BAC sono basati su plasmidi F normalmente presenti in E.
coli. Versioni F’ del plasmide F possono mobilizzare un intero cromosoma da una cellula di E.
coli ad un’altra, e perciò possono ospitare grossi frammenti di DNA (fino a 300 kb). Questi
vettori sono stabili in cellule di E. coli, e nonostante le loro grosse dimensioni sono resistenti
alle rotture meccaniche perché sono superavvolti.
9. Lo screening di una collezione “ phagemid” per la selezione di un gene di interesse comporta
che la genoteca sia piastrata per generare piastre contenenti colonie disposte in maniera
uniforme e ad una densità tale da consentire di distinguere singolarmente le colonie. Il DNA e
le proteine presenti in queste colonie sono copiate su un filtro di nitrocellulosa o di nylon carico
positivamente, semplicemente appoggiando le membrane sulle piastre. I filtri hanno forte
affinità per il DNA e le proteine, ed il trattamento con soluzioni alcaline comporta la lisi delle
cellule e la denaturazione del DNA. Nella fase di saturazione le regioni del filtro prive di DNA
e proteine sono ricoperte con DNA o proteine irrilevanti. Ciò garantisce che la sonda non si
leghi ai siti vuoti del filtro, e che il suo legame dipenda dal riconoscimento specifico delle
sequenze complementari depositate sul filtro. Infatti, la rivelazione di n dato gene di interesse
può essere ottenuta con una sonda di DNA radioattivo a singolo filamento, complementare al
gene di interesse. I filtri sono esposti alla sonda ed il successivo lavaggio rimuove la sonda non
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stabilmente associata ad una determinata placca. L’autoradiografia mostrerà punti neri
corrispondenti alle regioni del filtro su cui si è legata la sonda di DNA. La colonia
corrispondente a quella posizione sul filtro può essere identificata, e questa colonia conterrà il
gene che intendiamo selezionare.
Siccome i “phagemid” possono anche esprimere la proteina codificata dal gene che
contengono, il gene di interesse può essere identificato con una sonda anticorpale. Si utilizza un
anticorpo primario, diretto contro la proteina di interesse, per identificare il clone
corrispondente. La localizzazione dell’anticorpo primario sul filtro può essere visualizzata con
il legame di un anticorpo secondario, legato covalentemente ad un enzima che reagisce con un
substrato per generare un prodotto colorato.
10. I vettori fagici M13 esistono in una forma a doppio filamento all’interno di cellule di E. coli,
ma le particelle fagiche nelle placche esistono in una forma a singolo filamento. Per ottenere
DNA clonato a singolo filamento, il fago ricombinante M13 si genera da DNA fagico a doppio
filamento isolato da E. coli. Le placche generate dalla trasfezione di cellule ospiti con il fago
ricombinante conterranno DNA ricombinante a singolo filamento. Infatti, siccome la progenie
di particelle fagiche è secreta attraverso la membrana cellulare dell’ospite, i fagi potranno
essere semplicemente raccolti dal mezzo di coltura. I “phagemid” come pBluescript possiedono
un’origine di replicazione del fago a singolo filamento f1. Se una cellula con DNA clonato in
pBluescript è infettato con un fago “helper” f1, quest’ultimo fornirà il macchinario della
replicazione del DNA a singolo filamento, e il DNA del “phagemid” a singolo filamento sarà
presente nelle placche (e nel mezzo) di questa infezione.
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11. Un metodo per allestire una collezione di cDNA
Si isola l’mRNA da un tessuto che esprime il gene di interesse.
Il cDNA sintetizzato è ligato in un vettore plasmidico secondo lo schema seguente:
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12.
Si genera una popolazione di plasmidi ricombinanti, ciascuno contenente un cDNA
sintetizzato da una serie di diversi mRNA presenti nel campione originario.
I plasmidi ricombinanti sono trasformati in cellule di
E. coli
Una collezione di plasmidi ricombinanti in cellule di E. coli
è una collezione di cDNA
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12. Il processo della “nick translation”
13. L’amplificazione di un frammento di DNA con la reazione a catena della polimerasi richiede:
inneschi oligonucleotidici (primer) alle estremità della sequenza “target”, i quattro dNTP e Taq
DNA polimerasi. Gli inneschi oligonucleotidici vengono progettati in modo da essere
complementari ai filamenti opposti del DNA stampo con le rispettive estremità 3’ che si
fronteggiano. Ciascun ciclo della PCR richiede tre passaggi: denaturazione, appaiamento dei
primer, ed estensione dei primer. Lo stampo è denaturato a 95 °C. Quindi, la temperatura si
abbassa per consentire l’appaiamento (annealing) dei primer alle regioni complementari sul
DNA stampo. La temperatura di annealing tipicamente è compresa tra 50 e 60°C. La Taq
polimerasi replica il DNA a 72°C. La chiave per l’intero processo è la stabilità termica
dell’enzima Taq, che consente la denaturazione dei filamenti di DNA neosintetizzati in cicli
successivi, senza che l’attività dell’enzima ne risulti compromessa. Ad ogni ciclo il numero di
molecole di DNA replicate si raddoppia, il che comporta l’aumento esponenziale nella quantità
di DNA target.
14. La PCR preceduta da retrotrascrizione (RT-PCR) differisce dalla PCR standard in quanto una
specifica molecola di mRNA, e non una molecola di DNA, diviene il bersaglio
dell’amplificazione. Una RT-PCR richiede la formazione di uno stampo di DNA a doppio
filamento con trascrittasi inversa e DNA polimerasi. Quindi, la RT-PCR può essere usata per
generare un clone di cDNA di uno specifico gene, individuato dai primer.
15. Un vettore di espressione che produce proteine di fusione con oligoistidine possiede una
regione codificante per sei istidine (His)6 subito dopo un codone di inizio ATG. Questa regione
è seguita da un tratto codificante per il sito di riconoscimento di una proteasi, come
l’enterochinasi. Il sito di clonaggio multiplo è a valle di questa regione, e consente il clonaggio
del gene di interesse nella stessa cornice di lettuta delle oligoistidine. Ciò comporta la
produzione di una proteina di fusione con il tag di oligoistidine all’estremità ammino terminale.
La proteina ricombinante può essere purificata mediante cromatografia di affinità da un lisato
di batteri esprimenti la proteina. La cromatografia di affinità sfrutta ioni nichel per legare
specificamente il tag di oligoistidine. Le proteine non legate possono essere lavate dalla
colonna, e quindi la proteina ricombinante può essere rilasciata dalla colonna con istina libera o
imidazolo, che competono con il tag di oligoistidine per il legame al nickel. Il tag può essere
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tagliato via dalla proteina di fusione con enterochinasi, e passando ancora una volta la miscela
attraverso la colonna si otterrà il legame del tag isolato alla colonna, e il rilascio della proteina
ricombinante purificata.
16. I vettori  a sostituzione sono quelli in cui sono stati rimossi i geni fagici non richiesti per la
replicazione fagica. Possiamo quindi rimpiazzare questa regione con un grosso inserto di DNA
estraneo senza compromettere l’impacchettamento del fago ricombinante. Questi vettori sono
utili per costruire collezioni di DNA genomico. Vettori di inserzione come gt11 possono
ospitare frammenti di DNA più piccoli, poiché non sono stati rimossi frammenti di DNA
fagico. In questo modo tali vettori di inserzione si prestano al clonaggio di cDNA o di piccoli
frammenti genomici. Questi vettori possono anche essere sfruttati come vettori di espressione.
17. L’espressione di una proteina ricombinante da un gene clonato con il sistema di espressione di
baculovirus richiede che venga generato DNA di baculovirus con il gene di interesse
controllato dal forte promotore del gene della poliedrina virale. Ciò può essere ottenuto con un
vettore di trasferimento per generare, in E. coli, un plasmide ricombinante privo del gene della
poliedrina, ma con il gene di interesse sotto il controllo del promotore della poliedrina. Questo
vettore contiene anche un gene essenziale per la replicazione virale in cellule di insetto. Il
vettore è co-trasfettato in cellule di insetto con DNA virale inattivato per la mancanza di un
gene fondamentale per la replicazione. La replicazione del virus nelle cellule di insetto dipende
da un evento di ricombinazione tra il vettore di trasferimento e il DNA virale. Ciò genera un
virus ricombinante che possiede il gene per la replicazione. Queste cellule di insetto possono
essere coltivate, ed il prodotto proteico del gene clonato può essere purificato. Il vantaggio di
questo sistema rispetto ad un sistema batterico è che le cellule di insetto possiedono la maggior
parte dei sistemi di modifiche post-traduzionali e di trasporto delle cellule degli eucarioti
superiori. Ciò comporta che è probabile che una proteina eucariotica prodotta in questo sistema
sia correttamente maturata e modificata. Un altro vantaggio è che le proteine eucariotiche
prodotte in cellule di insetto tendono ad essere ripiegate correttamente, rispetto a quelle
prodotte in batteri, che tendono a formare corpi di inclusione insolubili.
18. Un metodo di elezione per inserire un transgene in una pianta è la trasformazione mediata da
Agrobacterium. Nella trasformazione mediata da Agrobacterium, una porzione di DNA, il TDNA, derivante da un plasmide induttore di tumori, Ti, è trasferito nel genoma di una pianta.
Sostituendo geni del T-DNA con il nostro gene di interesse, possiamo usare questo sistema per
trasformare le piante.In questo processo si sfruttano vettori modificati, basati sul plasmide Ti.
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PER L’APPROFONDIMENTO:
Pro-Arg-Tyr-Met-Cys-Trp-Ile-Leu-Met-Ser
4
6
2 1 2
1 3 6 1 6
1.
a. La sequenza Tyr-Met-Cys-Trp-Ile genererà una sonda 14-mer con il minor grado di
degenerazione.
b. Il grado di degenerazione sarà 2 X 1 X 2 X 1 = 4. Saranno usate solo le prime due basi
del codone Ile e queste non comporteranno ulteriore degenerazione. In questo modo si
sintetizzeranno 4 diversi 14-mer per assicurarsi che la sonda contenga una sequenza
perfettamente corrispondente alla sequenza nel gene clonato.
c. Spostandoci di un amminoacido alla sinistra si otterrà la sequenza peptidica Arg-TyrMet-Cys-Trp. La degenerazione di questa sequenza sarà 6 X 2 X 1 X 2 X 1 = 24. Ciò
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richiederà la sintesi di 24 diversi 14-mer per assicurarsi che la sonda contenga una
sequenza perfettamente corrispondente alla sequenza nel gene clonato. Una sonda 15mer avrà infatti la stessa degenerazione del 14-mer, poiché Ile è specificata da tre
codoni che iniziano tutti con la stessa base.
2. Clonando in pUC18 e piastrando i trasformanti su X-gal, ci aspettiamo che quelli con
plasmidi privi di inserto siano blu e quelli con l’inserto bianchi. Ciò perché l’inserzione di
un frammento di DNA clonato nel gene lacZ’ porta ad inattivazione inserzionale del gene
senza trasformazione dell’X-gal nel suo prodotto colorato. Una colonia blu, infatti, conterrà
un piccolo inserto di 60 bp che, essendo un multiplo di 3, non porterà a scivolamento del
codice nella regione codificante di lacZ’; la corta sequenza amminoacidica che ne deriva
non influenzerà l’attività catalitica della -galattosidasi. Una colonia bianca, che non
contiene frammenti di DNA clonati può essere meglio giustificata dalla rimozione di un
nucleotide durante la restrizione del vettore che, richiudendosi durante la reazione di
ligazione, risulterà in uno scivolamento del codice all’interno del gene lacZ’.
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