Matteo Lava

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Fermentazione lattica e produzione del formaggio
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1. Indice
1.
INDICE .......................................................................................................................................1
2.
PREMESSA................................................................................................................................4
3.
INTRODUZIONE......................................................................................................................6
4.
COMPOSIZIONE DEL LATTE..............................................................................................8
4.1.
Introduzione........................................................................................................................................ 8
4.2.
I lipidi................................................................................................................................................... 8
4.2.1. Differenze strutturali fra grassi e oli ................................................................................................................ 9
4.2.2. I trigliceridi.................................................................................................................................................... 10
4.2.2.1.
Gli acidi grassi ..................................................................................................................................... 10
4.3.
I carboidrati ...................................................................................................................................... 12
4.3.1.
I monosaccaridi.............................................................................................................................................. 12
4.4.
I sali minerali .................................................................................................................................... 16
4.5.
Le vitamine........................................................................................................................................ 16
4.6.
Le proteine ........................................................................................................................................ 16
4.6.1. Gli amminoacidi ............................................................................................................................................ 18
4.6.2. Struttura e grandezza delle proteine............................................................................................................... 20
4.6.2.1.
Legame peptidico................................................................................................................................. 20
4.6.2.2.
Grandezza delle proteine: oligopeptidi, polipeptidi e proteine............................................................. 21
4.6.2.3.
Livelli di organizzazione...................................................................................................................... 22
4.6.2.4.
Legami intra- ed inter-molecolari ........................................................................................................ 22
4.6.3. Denaturazione delle proteine ......................................................................................................................... 24
4.6.4. La parte proteica nel latte .............................................................................................................................. 25
4.6.4.1.
Micelle e submicelle caseiniche........................................................................................................... 26
4.7.
Gli enzimi .......................................................................................................................................... 29
4.7.1. Gli enzimi del latte ........................................................................................................................................ 29
4.7.1.1.
Origine, presenza e attività degli enzimi nativi nel latte ...................................................................... 29
4.7.1.2.
Classi di appartenenza.......................................................................................................................... 29
4.7.2. Nomenclatura degli enzimi............................................................................................................................ 30
4.7.3. Cofattori......................................................................................................................................................... 31
4.7.4. Cinetica enzimatica........................................................................................................................................ 32
4.7.5. Fattori che influenzano l’attività enzimatica.................................................................................................. 34
4.7.5.1.
Influenza del pH nelle reazioni enzimatiche ........................................................................................ 34
4.7.5.2.
Influenza della temperatura nelle razioni enzimatiche......................................................................... 35
4.7.6. Inibizione enzimatica..................................................................................................................................... 36
5.
FERMENTAZIONE LATTICA.............................................................................................37
5.1.
Un po’ di storia ................................................................................................................................. 37
5.2.
Alcune nozioni................................................................................................................................... 37
5.2.1.
5.2.2.
Energia libera di Gibbs .................................................................................................................................. 37
Il complesso ATP-ADP, una fonte di energia ............................................................................................... 38
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5.2.2.1.
Come ricavare energia da una molecola............................................................................................... 39
5.2.3. Il complesso NAD+ - NADH, un trasportatore di elettroni ............................................................................ 40
5.2.3.1.
Struttura e funzionamento del complesso NAD+ - NADH................................................................... 41
5.3.
Fermentazione .................................................................................................................................. 42
5.3.1. Introduzione................................................................................................................................................... 42
5.3.2. La glicolisi ..................................................................................................................................................... 44
5.3.2.1.
Bilancio energetico complessivo.......................................................................................................... 54
5.3.2.2.
Alcuni approfondimenti ....................................................................................................................... 55
5.3.3. Destino del piruvato dopo la glicolisi ............................................................................................................ 56
5.3.4. Scissione del lattosio per utilizzarlo nella glicolisi........................................................................................ 57
5.4.
Microrganismi del latte.................................................................................................................... 59
5.4.1. I batteri........................................................................................................................................................... 59
5.4.1.1.
Nomenclatura e differenze morfologiche dei batteri............................................................................ 61
5.4.2. Altre particolari caratteristiche ...................................................................................................................... 62
5.4.2.1.
Gram-negativi e Gram-positivi ............................................................................................................ 62
5.4.2.2.
Lo stato di endospora ........................................................................................................................... 64
5.4.2.3.
La riproduzione dei batteri ................................................................................................................... 65
5.4.2.4.
Batteri coinvolti nella fermentazione ................................................................................................... 66
5.4.2.5.
Altri batteri........................................................................................................................................... 68
5.4.2.6.
Altri abitanti del latte: i batteriofagi ..................................................................................................... 68
6.
L’ARTE DEL CASARO .........................................................................................................69
6.1.
Il formaggio....................................................................................................................................... 69
6.1.1.
6.1.2.
6.1.3.
6.1.4.
6.1.5.
6.1.6.
6.1.7.
6.1.8.
6.1.9.
6.1.10.
6.1.11.
7.
Stoccaggio del latte........................................................................................................................................ 70
Maturazione del latte ..................................................................................................................................... 71
Coagulazione ................................................................................................................................................. 71
Taglio della cagliata....................................................................................................................................... 75
Riposo della grana ......................................................................................................................................... 76
Riscaldamento della grana............................................................................................................................. 76
Spinatura fuori fuoco ..................................................................................................................................... 77
Estrazione e messa in forme .......................................................................................................................... 77
Pressatura....................................................................................................................................................... 77
Messa in salamoia..................................................................................................................................... 78
Stagionatura .............................................................................................................................................. 78
PRODUZIONI INDUSTRIALI ..............................................................................................79
7.1.
LATI .................................................................................................................................................. 79
7.1.1.
7.2.
Confronto con una produzione di tipo artigianale ........................................................................ 80
7.2.1.
8.
Prodotti e controlli ......................................................................................................................................... 80
Conclusioni.................................................................................................................................................... 80
PARTE SPERIMENTALE .....................................................................................................81
8.1.
Introduzione...................................................................................................................................... 81
8.2.
Esperimenti sul campo ..................................................................................................................... 82
8.2.1.
8.2.2.
8.2.3.
8.3.
8.3.1.
Andamento del pH dall’aggiunta della coltura .............................................................................................. 82
Andamento del pH dall’aggiunta del caglio fino alla coagulazione .............................................................. 83
Andamento del pH nelle ore successive ........................................................................................................ 85
Analisi dei dati ottenuti .................................................................................................................... 86
Analisi critica del grafico dell’andamento del pH ......................................................................................... 87
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8.4.
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Esperimenti di controllo in laboratorio .......................................................................................... 88
8.4.1.
8.4.2.
8.4.3.
8.4.4.
9.
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Procedura e descrizione degli esperimenti..................................................................................................... 89
Risultati ottenuti ............................................................................................................................................ 91
Possibile interpretazione................................................................................................................................ 91
Esperimento di controllo dell’influenza della temperatura sul pH ................................................................ 93
BIBLIOGRAFIA......................................................................................................................95
10.
ALLEGATI ..........................................................................................................................97
10.1.
Lista degli amminoacidi con sigla, abbreviazione e formula........................................................ 97
10.2. Procedura d’analisi per determinare la contaminazione da batteriofagi e interpretazione dei
risultati ........................................................................................................................................................... 99
10.3.
Procedimento colorazione di Gram ................................................................................................ 99
10.4.
Caratteri tipici dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi ........................................................ 100
10.5. Di seguito le schede di descrizione delle colture CMB 291, CM 401 e CM 3008 prodotte
dall’ALP ....................................................................................................................................................... 101
11.
RINGRAZIAMENTI.........................................................................................................104
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2. Premessa
Questo lavoro è il primo risultato di un particolare attaccamento alla vita contadina e al suo ambiente, forse
presente in me già da piccolo, e sicuramente sviluppatosi con gli anni, dapprima con l’avvicinamento alla
montagna e alla natura, fino ad arrivare ad una presenza sempre maggiore nel vero ambito contadino.
Ho cominciato il mio approccio con la natura nell’estate dopo la fine del secondo anno di scuola media. Da
diversi anni veniva organizzato, da un docente della sede di Gordola, un giro in montagna pernottando in
alcune capanne della nostra regione. È così che ho cominciato ad amare la natura e la montagna. Negli anni
successivi ho continuato a partecipare a questa interessante settimana; interessante considerando anche che
fra gli accompagnatori, oltre ad alcuni docenti amanti della montagna, c’era sempre un biologo, che non si
lasciava sfuggire le varie opportunità per poterci insegnare qualcosa! Nell’estate dopo la fine del quarto anno
di scuola media sono riuscito ad organizzare la mia permanenza presso una delle ultime aziende di montagna
presenti sul nostro territorio. Qui, fra montagne, prati, animali e tutto ciò che fa tale un’azienda agricola di
montagna, mi sono pian piano avvicinato all’ambiente contadino, imparando a conoscerne gli aspetti
positivi, e alcuni altri negativi. Trovandosi ad un’altitudine di 1500 m/sm, l’ambiente in cui si trova l’azienda
è molto simile a quello di alcuni alpeggi. Alcune sostanziali differenze che appunto distinguono questa
azienda stanno nelle attività svolte: esse non consistono nel solo pascolo di alcune mucche e nella loro
mungitura, ma anche nella produzione di formaggio, per altro molto simile al formaggio d’alpe, e nella
fienagione. Anche se sono sempre stato maggiormente impiegato nel “far fieno”, piuttosto che nella parte
svolta in caseificio, ho avuto modo di avvicinarmi a quella che definirei “l’arte del casaro”, o meglio “l’arte
del far formaggio”. Grazie all’interesse per la biologia e la chimica trasmessomi dai miei professori delle
rispettive materie, professori Claire Beretta Steiner e Dott. Gianmarco Zenoni, assieme ai professori Egon
Bernasconi e Dott. Christian Ferrari (matematica e fisica), i quali hanno dato la possibilità a degli allievi
interessati e motivati di approfondire un tema scientifico senza limitazioni – intesa come possibilità di
trattare un tema senza doversi preoccupare di restare entro limiti appartenenti ad una sola materia –, ho avuto
modo di svolgere questo lavoro. Ho potuto leggere, studiare e capire di un tema, che può essere definito
globalmente come processo di caseificazione. Al giorno d’oggi il raggio d’azione di una singola materia è
troppo ristretto per poter trattare in modo approfondito e completo un qualsiasi argomento scientifico, come
quello che in questo lavoro mi sono impegnato a descrivere e studiare. È proprio in questo contesto che
interviene l’interdisciplinarietà tra materie, condizione indispensabile nell’ambito scientifico moderno.
Come tutti ben sanno, alcune nozioni di base delle materie fondamentali hanno assunto nel tempo sempre più
importanza, fino a risultare effettivamente “mattoni” sui quali le altre materie, e in particolare si fa
riferimento ai campi d’applicazione delle stesse, devono appoggiarsi.
Il processo da me trattato è suddividibile in numerose parti, scientificamente trattabili separatamente, che ho
qui potuto sviluppare con una visione globale, avvalendomi di alcune nozioni di fisica, introducendo e
parlando di processi bio-chimici, interessanti singolarmente, ma ancora più interessanti se visti nel loro
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insieme, ciò che permette di comprenderne il reale significato, ovvero la ricerca della sopravvivenza. Stiamo
parlando della vita.
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3. Introduzione
Lo scopo che questo lavoro si prefigge è trattare in modo abbastanza completo il processo che il latte subisce
dopo la mungitura fino al momento in cui, dopo esser stato trasformato in formaggio, è pronto per essere
mangiato e soprattutto gustato. Questo lavoro si articola in cinque parti principali, le quali sono in pratica i
capitoli dal 4 all’8, ovvero: 4. Composizione del latte, 5. Fermentazione lattica, 6. L’arte del casaro, 7.
Produzioni industriali, 8. Parte sperimentale. Vediamo di descriverle brevemente, spiegando quali siano
stati i motivi che hanno portato a questa impostazione.
Trattando di un processo che riguarda il latte, una descrizione dello stesso si è chiaramente resa necessaria.
Nel capitolo 4 si descrivono le principali caratteristiche e componenti del latte, soffermandosi in modo
particolare su alcune di esse, le più rilevanti nel processo di caseificazione. Queste sono dunque le proteine,
principali attrici di tutto il processo e la particolare funzione svolta dagli enzimi, che come vedremo si
riveleranno indispensabili. Parte indispensabile sono comunque anche i carboidrati e i lipidi, i quali però
verranno descritti in modo meno approfondito, questo per due ragioni distinte. Per i glucidi il motivo è
semplicemente che la funzione da loro svolta nel processo è una semplice, seppur importantissima, funzione
di nutrizione dei batteri, mentre per i lipidi il motivo è che risulta particolarmente difficile studiarne le
funzioni. I lipidi sono molto importanti nel formaggio perché hanno una grande influenza sul suo gusto,
tuttavia studiarne l’influsso, in particolar modo delle catene di acidi grassi, considerando le numerose
reazioni in cui sono coinvolti, i prodotti e composti a cui danno origine, è complicato, e necessiterebbe, sia di
mezzi da noi non disponibili, sia di una trattazione da svolgersi in un LAM a sé.
Nel capitolo 5 si tratta di un processo metabolico svolto dai batteri: stiamo parlando della fermentazione. Il
processo di fermentazione è forse il più semplice e antico modo tramite il quale i viventi hanno imparato a
procurarsi dell’energia per vivere, alla base del quale sta la glicolisi (trattata in dettaglio nel cap. 5.3.2). I
batteri svolgono una triplice funzione, la prima è una funzione di “aiuto” enzimatico, la quale rende
l’ambiente più favorevole ad un enzima, così che possa lavorare meglio. La seconda è una funzione di
“difesa”, che l’attività batterica svolge nei nostri confronti, rendendo il latte dapprima, e il formaggio poi, un
ambiente troppo inospitale per alcuni batteri patogeni (nocivi per l’essere umano), evitando così ad esempio
la contaminazione della salmonella, o dello Stafilococco aureus. Come terza ed ultima funzione, i batteri
contribuiscono alla maturazione del formaggio in cantina, dando quel particolare gusto di “formaggio
stagionato”.
Nei capitoli 6 e 7 si toccherà con mano la vera e propria produzione del formaggio. Dopo aver parlato dei
processi bio-chimici fondamentali che spiegano il processo di produzione del formaggio, ci soffermeremo
più da vicino sulle sue varie tappe. Troveremo quindi i concetti descritti in precedenza applicati ad un
pezzetto di storia dell’uomo, storia che ha segnato anche quella del Ticino e della Svizzera. Nel capitolo 6
sarà questo il tema principale, mentre nel capitolo 7 sarà “l’evoluzione” del processo di base, svolto agli
albori, che col tempo e con le modernizzazioni si è sviluppato fino a divenire un processo industriale, con
sostanziali differenze. Le sostanziali differenze, sia nell’ambito della produzione, sia in quello del prodotto
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finito, verranno esaminate in questa sede, sperando che ciò possa dar adito ad alcune riflessioni, soprattutto
ai consumatori di formaggio.
L’ultimo di questi cinque capitoli principali, capitolo 8, è per così dire una “conclusione” del mio lavoro di
maturità. Per interesse, curiosità, divertimento e completezza del lavoro ho deciso di svolgere una piccola
parte sperimentale che riguardasse l’argomento. Le pretese non erano elevate, non miravano di certo alla
scoperta di qualche particolarità mai osservata, bensì volevano semplicemente documentare e confermare ciò
che nel resto del lavoro si è presentato. Adattando conoscenze, capacità e mezzi siamo riusciti ad effettuare
esperimenti in più riprese, svoltisi non solo in laboratorio presso il Liceo Cantonale di Locarno, ma anche sul
“campo di battaglia” vero e proprio, grazie anche in particolar modo al Sig. Franco Vanzetti, proprietario
dell’omonima azienda agricola biologica situata sui Monti di Pratodoro (Val di Blenio, ex-comune di
Aquila), presso la quale ho potuto ottenere parte dei dati riportati nel capitolo in questione.
Sono quindi queste le principali sezioni del mio lavoro. Spero con lo stesso di interessare chi voglia
addentrarsi nella sua lettura, e chissà, magari anche di essere utile a chi in futuro vorrà svolgere un LAM che
spazi nello stesso raggio d’azione del mio, o a qualche docente che ritenesse importante introdurre i propri
allievi a questa parte di storia dell’uomo e della vita.
Buona lettura.
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4. Composizione del latte
4.1.
Introduzione
Il latte è un prodotto naturale di enorme importanza per la vita degli esseri viventi. È alla base della vita di
tutti i mammiferi, come per noi, che appena nati e per un periodo di tempo che varia da individuo ad
individuo, ricaviamo tutte le sostanze nutritive necessarie alla vita proprio dal latte materno. In questo lavoro
tratteremo di un particolare prodotto, ottenuto mediante un ancor più particolare procedimento, che vede alla
base proprio il latte. È importante parlare delle caratteristiche di questo latte, e prima ancora chiarire di che
tipo di latte ci si stia occupando, siccome ognuno differisce per componenti e quantità dagli altri: il latte è
definito come prodotto ottenuto dalla mungitura regolare e continua della mucca in buono stato di salute e
nutrizione, privo di colostro.
Il latte è un particolare miscuglio, contenente al suo interno diverse sostanze, ognuna con caratteristiche
proprie. Ha una grossa componente di acqua, e componenti più modeste di proteine, grassi, glucidi e altre
sostanze. Vediamo ora le quantità di queste sostanze:
Componenti
Acqua
Proteine
Grassi
Lattosio
Sali minerali
Vitamine e
altri
Percento %
88
3
3.5
4.5
0.8
0.2
Tabella 1 1
Vedremo ora di trattare separatamente le singole parti in modo un po’ più approfondito.
4.2.
I lipidi
I grassi fanno parte della nostra dieta quotidiana. Sono costituenti di piante ed animali e si presentano
chimicamente sotto forme diverse: alcuni sono esteri, altri idrocarburi; alcuni sono aciclici, altri ciclici o
anche policiclici 2 . Il ruolo dei grassi nel formaggio è molto importante: essi assumono un ruolo
fondamentale nelle caratteristiche organolettiche del prodotto. Lo studio approfondito di queste
caratteristiche è però molto complicato. Ci limiteremo nel darne una breve descrizione, essendo parte
costituente del latte (circa 4 %) e parte ancor più importante nel formaggio (le percentuali hanno
un’escursione molto varia a dipendenza del tipo di formaggio, quello d’alpe ticinese ha un tenore che si
aggira attorno al 45%). Grassi e oli sono chiamati trigliceridi perché hanno lo stesso tipo di struttura base,
ovvero sono composti dal glicerolo e da acidi grassi.
1
Tabella e percentuali tratte da: ALBERTO TAGLIAFERRI, CELESTE GRANDE, Biotecnologie e chimica
delle fermentazioni, Zanichelli 2002, pag. 397.
2
Da: HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica, Zanichelli 2003, Quinta
edizione, pag. 363.
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4.2.1. Differenze strutturali fra grassi e oli
La differenza fra un grasso e un olio è semplicemente che il primo si trova, a temperatura ambiente, allo stato
solido, mentre l’altro è allo stato liquido. Questa differenza è data dalla composizione e quindi diversa
struttura dei due: gli oli contengono una percentuale molto più elevata di acidi grassi insaturi, rispetto ai
grassi 3 . La differenza sta quindi negli acidi grassi: quelli insaturi hanno punti di fusione più bassi, mentre
quelli degli acidi saturi sono più alti. La principale causa del valore del punto di fusione degli acidi grassi è
data dal numero di doppi legami presenti al loro interno, tanti più doppi legami ci saranno, tanto più basso
sarà il punto di fusione. Diventa più facile comprendere questo concetto osservando la struttura molecolare
nei due casi (Figura 1), il primo di un acido grasso saturo (tripalmitato di glicerile) il secondo di un acido
grasso insaturo (dipalmitoleato di gliceride).
Figura 1 4
Nel primo caso è più facile che diversi trigliceridi si dispongano in modo da formare una struttura cristallina,
quindi in modo tale da formare un solido, mentre nel secondo caso, la conformazione dei singoli trigliceridi
impedirà loro di disporsi in modo tale da formare una struttura cristallina, e quindi solida, ma preferiranno
rimanere allo stato liquido.
3
Vedi nota precedente, pag. 366.
HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica, Zanichelli 2003, Quinta
edizione, pag. 366.
4
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4.2.2. I trigliceridi
Come visto, oli e grassi sono dei trigliceridi, formati dal glicerolo e da acidi grassi: il nome trigliceride
deriva dal fatto che grassi e oli sono dei triesteri del glicerolo. Per ottenere queste due parti separatamente si
fa ricorso alla reazione detta di saponificazione, essa avviene quando un grasso o un olio vengono fatti
bollire con alcali e viene acidificata la soluzione.
Di seguito la formula di un trigliceride semplice e relativa saponificazione a glicerolo più tre equivalenti di
acidi grassi.
Figura 2 5
Vengono detti trigliceridi semplici i trigliceridi con tre acidi grassi uguali, vengono chiamati misti se i tre
acidi grassi sono differenti.
4.2.2.1. Gli acidi grassi
Gli acidi grassi sono la seconda componente, assieme al glicerolo, che compongono i trigliceridi. In
precedenza abbiamo detto dell’importanza dei grassi sia nel latte come nel formaggio per le loro
caratteristiche organolettiche. Queste caratteristiche sono date proprio dagli acidi grassi costituenti i lipidi.
Essi hanno gusti che possono essere molto pronunciati, e altra caratteristica molto importante assorbono
facilmente gli odori circostanti.
Tralasciando alcune eccezioni, gli acidi grassi naturali non hanno catene ramificate e contengono un
numero pari di atomi di carbonio 6 . I doppi legami presenti (se esistenti) hanno configurazione cis (o Z) e
non sono tra loro coniugati. 7
I vari grassi e oli sono composti molto spesso da una miscela di trigliceridi di tipo differente. Di seguito
ritroviamo in tabella una lista degli acidi grassi più comunemente presenti negli alimenti.
5
Vedi nota precedente, pag. 364.
Idem.
7
Per ulteriori spiegazioni in merito all’isomeria cis-trans e alla convenzione E-Z per gli isomeri cis-trans ci
si voglia rifare al cap. 2 pag. 47, rispettivamente al cap. 5 pag. 130 del libro Chimica organica citato nelle
note precedenti.
6
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Figura 3 8
I grassi di solito vengono descritti con le percentuali degli acidi grassi ottenibili dalla sua saponificazione,
troviamo di seguito la composizione in acidi grassi del burro e del grasso del latte di vacca.
Figura 4 9
8
9
TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag.68.
Vedi nota precedente, pag. 69.
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Figura 5 10
4.3.
I carboidrati
I carboidrati, più comunemente chiamati glucidi (dal greco glykýs = dolce) o zuccheri, sono dei composti del
carbonio, come suggerisce il nome, e sono formati da atomi di carbonio, idrogeno e ossigeno; la loro formula
generale è Cx(H2O)y. Il termine carboidrati è un effetto di questa formula: originariamente infatti, data
appunto la loro formula, potevano esser chiamati idrati di carbonio. Essi sono i composti del carbonio più
abbondanti nelle cellule, svolgono funzioni strutturali e di riserva energetica. Tra i carboidrati più diffusi
troviamo ad esempio la cellulosa, componente principale della parete cellulare delle piante. Altro carboidrato
molto diffuso è l’amido, principale forma nella quale le piante accumulano gli zuccheri più semplici nella
previsione di un utilizzo futuro. Nel sangue troviamo invece il glucosio, anch’esso componente
fondamentale. Il ribosio e il 2-deossiribosio, anch’essi due zuccheri, fanno parte del patrimonio genetico
costituito da RNA e DNA. I carboidrati sono mono- o poli- idrossialdeidi, mono- o poli- idrossichetoni o
composti che per idrolisi danno composti di questo tipo, pertanto i principali gruppi funzionali dei
carboidrati sono il gruppo carbonile (-CO) e il gruppo ossidrile (-OH).
I carboidrati si suddividono in monosaccaridi, oligosaccaridi e polisaccaridi. I monosaccaridi sono una specie
di “unità di base”. Dagli oligo- e poli- saccaridi per idrolisi si ottengono i monosaccaridi.
4.3.1. I monosaccaridi
I monosaccaridi sono la categoria più semplice di carboidrati, sono formati da 3 a 8 atomi di carbonio e
hanno forme non ramificate; nelle cellule si possono trovare come catene lineari e spesso in forma ciclica.
Vengono suddivisi in base al loro numero di atomi di carbonio, noi ci interesseremo dei triosi (3) e degli
esosi(6). I carboni hanno legati a loro dei gruppi alcolici (-OH) e si differenziano per la presenza di un
10
HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica, Zanichelli 2003, Quinta
edizione, pag. 365.
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O
gruppo aldeidico R
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O
H o chetonico R
R . Da queste suddivisioni avremo gli aldo- / cheto- triosi, e gli
aldo-/ cheto- esosi.
Figura 6 11
Il più semplice fra i monosaccaridi è la gliceraldeide (Figura 7), un aldotrioso contenente un centro chirale.
HC O
CHOH
CH2OH
Figura 7
L’enantiomero R- è stato scelto come standard di riferimento per l’attribuzione della configurazione di tutti
gli altri zuccheri, ma ancora oggi è molto più diffusa la vecchia nomenclatura di Fisher, la quale identifica
con la lettera D- l’enantiomero che presenta l’ossidrile (-OH) legato al centro chirale, scritto a destra (nelle
formule di proiezione di Fisher). Gli altri enantiomeri, con l’ossidrile legato a sinistra assumeranno come
prefisso la lettera L- . Questa nomenclatura vale per tutti gli zuccheri, dove quindi saranno chiamati D-,
coloro che a destra dell’ultimo centro chirale (il più lontano dal carbonio maggiormente ossidato (-COH))
avranno legato un ossidrile.
Anche gli zuccheri presentano il fenomeno dell’isomeria ottica, ovvero, avendo degli atomi asimmetrici
(chiamati centri chirali), il piano di polarizzazione di una luce polarizzata passante per una soluzione acquosa
dello zucchero in questione sarà ruotato di un certo angolo in un determinato verso (destra (+), sinistra (-)).
Due zuccheri che differiscono l’uno dall’altro per la configurazione di un solo centro chirale saranno
chiamati epimeri.
11
Immagine tratta da: LAM di chimica 2004, Liceo Cantonale di Mendrisio, svolto da MASSIMO
MALOCCHI, ATHENA REALINI E SEBASTIANO SEMINI, responsabile Professor P.G.Casartelli, pag.
13.
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Di seguito troviamo le formule di struttura di alcuni monosaccaridi molto presenti in natura:
Figura 8 12
Abbiamo accennato prima al fatto che in una cellula si possa trovare sia la forma lineare dello zucchero sia la
forma ciclica; le due infatti sono interconvertibili, si può cioè passare da una all’altra. Vediamo nella
seguente reazione come una molecola di glucosio lineare diventi in forma ciclica.
Figura 9 13
Il passaggio dalla forma lineare a quella ciclica è legato alla reazione che avviene fra il gruppo carbonilico
–C=O e un gruppo ossidrilico –OH; quando si forma una molecola in forma ciclica, l’-OH che si forma dalla
reazione può trovarsi dalla stessa parte o da quella opposta al C-6: le due forme sono chiamate α- (ossidrile
opposto al C-6) o β- (ossidrile dalla stessa parte del C-6). In acqua le due forme hanno un equilibrio di circa
36% per la forma α- e 64% per la forma β-; i due monosaccaridi sono detti anomeri (Figura 10).
12
Immagini tratte da: HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica,
Zanichelli 2003, Quinta edizione, pag. 385.
13
Vedi nota precedente, pag. 387.
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Figura 10 14
I batteri lattici ricavano dal lattosio l’energia necessaria per vivere, trasformandolo in acido lattico tramite la
fermentazione lattica, che approfondiremo in seguito. Il lattosio è lo “zucchero del latte” ed è un disaccaride
formato da due molecole, una di galattosio e una di glucosio, vediamone la formula:
Figura 11 15
Come visto, il lattosio può essere scisso e dare una molecola di galattosio più una di glucosio. Questa
reazione avviene in presenza di acqua (H2O) e grazie ad un enzima, la β-galattossidasi (più comunemente
chiamata lattasi) estratta da Saccharomyces lactis 16 .
14
Immagine tratta da: K. PETER, C. VOLLHARDT E NEIL E. SCHORE, Chimica organica, Zanichelli
2004, Terza edizione, pag. 1065.
15
Immagine presa da: http://www.food-info.net/images/lactase.jpg .
16
La mancanza dell’enzima lattasi in alcune persone provoca l’intolleranza al lattosio. Persone che durante la
crescita hanno una scomparsa di questo enzima saranno intolleranti al lattosio, che, non potendo essere
completamente digerito, i batteri dell’intestino crasso lo trasformano in composti tossici, che danno adito a
crampi addominali e diarrea. L’intolleranza al lattosio è una patologia comune agli adulti di tutto il mondo,
eccetto i Nordeuropei e alcuni popoli africani.(Tratto da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I
PRINCIPI DI BIOCHIMICA di lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag.541).
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4.4.
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I sali minerali
I sali minerali 17 sono presenti in piccole quantità, inferiori all’1%, essi sono rappresentati soprattutto da sali
di calcio (Ca), di fosforo (P), di potassio (K), di cloro (Cl), di magnesio (Mg) e di sodio (Na), in quantità
ridotte si trovano pure sali di rame (Cu), di zinco (Zn) e di ferro (Fe).
4.5.
Le vitamine
Nel latte sono presenti varie vitamine, seppur in minime quantità (circa lo 0.2 %). Le più importanti sono la
A e la D, da non dimenticare anche le vitamine E, B1, B2, PP, B6, B12, e scarsamente la vitamina C.
Una visione generale delle parti più importanti del latte, o almeno quelle che ci interesseranno, è data dalla
seguente figura:
Figura 12 18
4.6.
Le proteine
Le proteine sono dei polimeri naturali, non ripetitivi, costituiti da varie unità diverse, legate da un particolare
legame chimico, il legame peptidico (o ammidico); queste unità sono chiamate amminoacidi. Formando tra
di loro legami peptidici, catene di più amminoacidi sono chiamate catene polipeptidiche, e loro peculiarità è
il fatto di non essere mai ramificate. Questa particolarità fa sì che tutte le loro attività biologiche dipendano
solamente dalla lunghezza della catena, e soprattutto dall’ordine delle varie unità di base. Anche una minima
differenza di posizione di un solo amminoacido può far variare la sua funzione all’interno della cellula. Per
17
Composizione in sali minerali e vitamine tratta da: PAOLA BASTASIN E ROSSELLA ROMANI,
Elementi di biotecnologie generali e agrarie, Franco Lucisano Editore 1998, pag. 157-158.
18
Immagine tratta da: “Corso di approfondimento sul latte”, Liceo Lugano 2.
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dare un’idea della complessità che una singola proteina può avere, vediamo di seguito (Figura 13) la
sequenza degli amminoacidi componenti la αs-caseina. Ogni singola lettera indica un particolare
amminoacido secondo un codice standard (cfr. Allegati, cap. 10.1)
Figura 13 19
Le due estremità hanno un nome particolare, estremità amminica (-NH2) la prima (N-terminale), estremità
carbossilica (-COOH) la seconda (C-terminale), il concetto è illustrato dalla seguente figura:
Figura 14 20
Le proteine sono le molecole organiche più abbondanti nella cellula, 30 – 70 % del peso secco 21 , e vi
svolgono una grande varietà di funzioni biologiche. Sono sostanze essenziali per la struttura, il
funzionamento e la riproduzione della materia vivente.
Le proteine contenute nel latte sono diverse e di genere differente. I due tipi più importanti sono le caseine e
le albumine. Da notare che la presenza di caseina è del 83%, di lattoalbumina del ≈ 10% e di lattoglobulina
del ≈ 3%. La parte proteica nel formaggio è rappresentata dalla caseina, della quale in seguito
approfondiremo tutto il processo di separazione. Come esempio di contenuti proteici di alimenti diversi si
veda la tabella seguente:
19
Immagine tratta da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 113.
Vedi sopra, pag. 116.
21
Percentuali tratte da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO,
Chimica delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 8.
20
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Figura 15 22
4.6.1. Gli amminoacidi
Come abbiamo detto, gli amminoacidi sono l’unità base delle proteine: vediamone la formula generale.
Figura 16 23
Parlando di amminoacidi è necessario introdurre un concetto della chimica organica, chiamato chiralità. La
chiralità prende in esame la simmetria delle molecole; una molecola chirale è una molecola non
sovrapponibile alla sua immagine speculare. Esemplificando la cosa, una mano è chirale, poiché la sua
immagine speculare non è sovrapponibile a se stessa.
22
Tabella tratta da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 114.
Immagina tratta da: HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica,
Zanichelli 2003, Quinta edizione, pag. 409.
23
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Figura 17 24
L’atomo di carbonio centrale dell’amminoacido ha 4 sostituenti diversi, e non ha quindi un piano di
simmetria, come visto dalla Figura 16 questo atomo di carbonio prende la denominazione di carbonio α. La
glicina (rappresentata qui a destra) è l’unico amminoacido a non presentare un atomo
di carbonio asimmetrico. Ne deriva che la struttura degli amminoacidi (tranne quella
della glicina) è chirale; essendo un agente chirale, di ogni amminoacido esistono due
diversi isomeri ottici, chiamati enantiomeri. I due si differenziano per la direzione
H
H
C
COOH
NH2
della deviazione che provocano ad un raggio di luce polarizzata. Se un amminoacido fa ruotare di un angolo
α la luce polarizzata in senso orario (+), segno assunto all’inizio del nome della molecola, è una molecola
destrorotatoria, se una molecola fa ruotarare di un angolo α la luce polarizzata in senso antiorario (-), segno
assunto all’inizio del nome della molecola, è una molecola levorotatoria.
Al giorno d’oggi si possono distinguere due diverse caratterizzazioni degli amminoacidi (caratterizzazioni
che valgono pure per tutte le molecole): una è una misura fisica e viene misurata con un polarimetro, essa è
la direzione della rotazione che subisce un raggio di luce polarizzato, l’altra, nomenclatura R, S si riferisce
invece alla struttura spaziale della molecola, essa non è dunque una misura fisica. Le lettere R, S si
riferiscono alla posizione dei sostituenti dell’atomo di carbonio stereogeno. In origine gli amminoacidi
venivano suddivisi in D-amminoacidi (+) e L-amminoacidi (-); questa nomenclatura (L, D) si riferisce alla
struttura della molecola, in particolare alla posizione del gruppo variabile R.
In natura sono presenti entrambi gli enantiomeri, ma delle proteine fanno parte solo quelli in configurazione
R. Gli enantiomeri in configurazione S si trovano solamente nella parete cellulare di alcuni batteri e in alcuni
antibiotici. Gli amminoacidi totali sono 20, e 8 di essi sono chiamati amminoacidi essenziali, per l’uomo 25 ,
24
25
Vedi nota precedente, pag. 121.
Gli amminoacidi essenziali per una specie non lo sono necessariamente per un’altra.
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poiché non possono essere sintetizzati con le vie biochimiche del corpo umano, e devono quindi essere
assunti tramite la dieta. Tutti hanno un nome, un’abbreviazione di tre lettere utilizzata nella scrittura delle
formule dei peptidi, e una di una sola lettera utilizzata per la descrizione della sequenza in una proteina.
Negli allegati troviamo la lista degli amminoacidi, con, per ciascuno, formula, nome e abbreviazione
(cfr. Allegati 10.1).
4.6.2. Struttura e grandezza delle proteine
4.6.2.1. Legame peptidico
Il legame che unisce due amminoacidi è detto legame peptidico, e si forma tra un gruppo carbossilico Cterminale di un primo amminoacido e il gruppo amminico N-terminale di un secondo amminoacido con la
perdita di una molecola d’acqua (H2O).
Figura 18 26
Una caratteristica del legame peptidico è la delocalizzazione degli elettroni del legame C-N, che conferisce
allo stesso legame particolarità del doppio legame, ovvero l’impossibilità di effettuare una rotazione.
Essendo impossibile la rotazione i 6 atomi giacciono tutti su uno stesso piano, detto piano del legame
ammidico; in una catena polipeptidica i vari piani sono legati fra loro dal carbonio α, come vediamo nella
seguente figura:
Figura 19 27
26
27
Immagine tratta da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 116.
Vedi nota precedente, pag. 117.
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4.6.2.2. Grandezza delle proteine: oligopeptidi, polipeptidi e proteine
Biologicamente parlando, una proteina per essere tale non basta che sia un insieme di amminoacidi, almeno
due, ma richiede qualcosa in più, ovvero una determinata funzione biologica, vediamo di seguito le
principali 28 :
-
funzione strutturale, poiché sono i materiali costitutivi di tessuti e organi: collagene, seta, …;
-
funzione di trasporto, come l’emoglobina dei globuli rossi o le albumine sanguigne;
-
funzione di trasporto attraverso le membrane (canali, pori, trasportatori simporto e antiporto,
pompe sodio/potassio, pompe protoniche);
-
funzione catalitica, per la quale sono specializzati gli enzimi;
-
funzione di riserva di sostanze nutritive: ad esempio l’albumina del bianco dell’uovo;
-
funzione di regolazione: l’insulina, pur essendo considerata un ormone, è una proteina;
-
funzione dell’assicurare il movimento: la contrazione muscolare è resa possibile da due
proteine, l’actina e la miosina;
-
funzione di difesa: anticorpi;
-
funzione di controllo, nel funzionamento dei geni;
-
funzione di ricezione: recettori di neurotrasmettitori, di ormoni, …
Un numero esiguo di amminoacidi (fino a 100), determina una troppo scarsa lunghezza e complessità, e
quindi risulta incapace di inglobare le informazioni necessarie per svolgere un’attività biologica.
Le catene peptidiche comprendenti un numero che va da 2 a 10 amminoacidi viene chiamato oligopeptide.
Una catena con un numero di amminoacidi che spaziano dai 10 ai 100 è invece chiamata polipeptide, e
infine una catena comprendete più di 100 amminoacidi (AA) è chiamata, dal punto di vista chimico
arbitrariamente, proteina. La divisione quindi è:
•
Oligopeptidi: numero di AA ≈ 2-10
•
Polipeptidi: numero di AA ≈ 10-100
•
Proteine: numero di AA > 100
28
Parte dell’elenco delle funzioni principali delle proteine tratto da: LAM di chimica 2004, Liceo Cantonale
di Mendrisio, svolto da MASSIMO MALOCCHI, ATHENA REALINI E SEBASTIANO SEMINI,
responsabile Professor P.G.Casartelli.
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4.6.2.3. Livelli di organizzazione
La struttura di una proteina può essere analizzata a 4 livelli, essi prendono i nomi di “struttura”29 :
•
Struttura primaria: è determinata dalla sequenza degli amminoacidi che costituiscono la catena
polipeptidica;
•
Struttura secondaria: conformazione di una catena peptidica; è determinata dalle interazioni a ponti
idrogeno fra atomi dello scheletro della proteina. Le strutture secondarie più comuni sono l’α-elica e
la “β-sheet” o foglietto ripiegato. Nella prima i vari amminoacidi costituiscono un’elica, mentre nella
seconda gli amminoacidi formano come un piano ripiegato “a fisarmonica”;
•
Struttura terziaria: ordinamento spaziale degli atomi di una proteina; è determinata dalle forze di Van
der Waals (più altre interazioni e legami di cui si parlerà in seguito) 30 ;
•
Struttura quaternaria: è presente in proteine che sono composte da più catene peptidiche unite
unicamente da legami covalenti.
4.6.2.4. Legami intra- ed inter-molecolari
Certe catene polipeptidiche assumono una forma ad elica; questa struttura molto complessa non è formata
solo da legami peptidici, ma necessita fra l’altro di legami ponte-idrogeno, che aiutano a mantenere l’ordine
spaziale della catena. Vediamo la delicata struttura chiamata α-elica:
29
30
Definizione dei 4 livelli di organizzazione delle proteine tratta da: vedi nota precedente.
Ndr.
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Figura 20 31
Vediamo più in dettaglio questi legami 32 che sono responsabili della struttura terziaria:
1. Legami covalenti: legami ammidici (peptidici e isopeptidici) e legami a ponte disolfuro inter- e
intra-molecolari. I primi responsabili della struttura primaria e i secondi soprattutto della terziaria.
2. Legami a idrogeno: più deboli dei precedenti, ma così numerosi da dare un contributo fondamentale
alla stabilizzazione del secondo, terzo e quarto livello strutturale.
3. Interazioni ioniche: possono essere attrattive e repulsive. Evidentemente sono influenzate dal pH
del mezzo in cui la proteina è disciolta. Poiché di solito l’ambiente è acquoso, i gruppi ionizzati sono
ampiamente solvatati e così le loro interazioni sono spesso meno forti di quello che si possa pensare.
4. Interazioni idrofobiche: sono la conseguenza del carattere idrofobo delle catene laterali
idrocarburiche di alcuni amminoacidi e della particolare struttura dell’acqua. Le molecole di
quest’ultima instaurano infatti fra loro dei legami idrogeno, formando attorno ai gruppi R- idrofobi
31
Immagine tratta da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 118.
Descrizione dei tipi di legami che intervengono in una catena polipeptidica tratta da: CARLO
QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica delle fermentazioni e
laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 15.
32
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delle strutture tridimensionali a gabbia dette “clusters” che provocano una diminuzione dell’entropia
del sistema (perché creano un maggior grado di ordine). La proteina tenderà quindi spontaneamente
a ripiegarsi in modo da offrire verso l’ambiente acquoso solo i gruppi R-idrofili e da “nascondere” al
suo interno i gruppi idrofobi, riducendo il numero di “gabbie” e producendo un aumento
dell’entropia. L’intensità di questo effetto dipende evidentemente dai gruppi R-, che possono essere
ordinati nel modo seguente:
Idrofobia: Phe > Ala > Val > Glu > Leu > Cys
Idrofilia: Tyr > Ser > Asp > Glu > Asn > Gln > Arg
Di seguito uno schema riassuntivo delle interazioni che contribuiscono alla realizzazione di una proteina:
Figura 21 33
4.6.3. Denaturazione delle proteine
Le proteine, a condizioni normali di pH, temperatura, … hanno una particolare struttura detta conformazione
nativa, che corrisponde al minimo di energia libera per la molecola in quelle condizioni. Variazioni di queste
condizioni possono influire sulla struttura della proteina, modificandone così l’attività biologica. Proteine
attive biologicamente perdono questa attività se perdono la loro struttura terziaria. Se le variazioni non sono
eccessive, o se la proteina è particolarmente stabile, ristabilendo le condizioni iniziali, la proteina può
ritornare come prima: si parla in questo caso di rinaturazione (Figura 22).
33
Immagine tratta da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO,
Chimica delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 15.
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Figura 22 34
Nella maggior parte dei casi però la rinaturazione non ha luogo. Più frequente invece il caso della
denaturazione di proteine, nome del processo prima descritto, al quale segue il formarsi di nuove interazioni,
che causano precipitazione, solidificazione o formazione di gel.
4.6.4. La parte proteica nel latte
La parte proteica del latte è formata da numerose proteine differenti. Il loro numero totale supera la dozzina,
e molte di esse rappresentano una parte molto piccola della percentuale totale di azoto. Trattare tutte le
diverse proteine, le varie forme, le aggregazioni e quanto altro sarebbe molto interessante, ma purtroppo
troppo lungo, e anche troppo poco inerente il lavoro che vogliamo svolgere. Dovremo accontentarci di
trattare le caseine, proteine che intervengono nel processo della caseificazione. Le caseine infatti sono la
parte proteica che a temperatura di 20°C e a pH 4,6 precipita; la loro percentuale totale di azoto in tutto il
latte equivale circa al 76-78%. La percentuale riportata è suddivisa su 4 tipi principali di caseine, la αs1-, αs2-,
β- e la k- caseina; altre caseine minori derivanti dalle 4 menzionate sono la γ- e la λ- caseina: le loro
percentuali sono 35 : αs1 = 38; β = 36; k = 13; αs2 = 10; γ1 + γ2 + γ3 = 2; λ < 1.
Le caseine hanno una scarsa tendenza a organizzarsi in strutture secondarie e terziaria, e vengono pertanto
considerate proteine a struttura aperta (lineari). Questa condizione le rende più suscettibili all’attacco da
parte di enzimi. La k-caseina ha una tendenza maggiore ad avere siti della sua catena senza alcuna rotazione
elicoidale, in particolare in prossimità del legame 105-106 (Phe-Met), sensibile alla chimasi, dove in effetti
avviene l’attacco degli enzimi coagulanti. Vediamo nella formula come in effetti la proteina assuma una
forma relativamente “lineare”:
34
Vedi nota precedente, pag. 14.
Percentuali delle varie caseine tratte da: CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche
Nuove 1995, 78.
35
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Figura 23 36
4.6.4.1. Micelle e submicelle caseiniche
Nel latte le caseine formano delle aggregazioni, chiamate micelle, o più specificamente in questo caso,
micelle caseiniche. Queste micelle sono di forma sferica, e hanno un diametro che di norma si aggira tra i
130 e i 250 nm, anche se possono arrivare ad un diametro di 600 nm. Un litro di latte contiene circa 1015
micelle, e ognuna è formata da circa 2,35 x 1014 molecole caseiniche 37 .
La formazione di queste micelle (Figura 24) è dovuta a una caratteristica peculiare di tutte e 3 i tipi di
caseina (la αs1 e la αs2 sono delle varianti fra loro). Verso le loro rispettive estremità N, hanno tutte una
predominanza di amminoacidi polari, in particolare la αs- e β- caseina sono ricche di fosfoserina, che
permette di legare ioni calcio (Ca2+) e di formare legami tra diverse micelle mediante catene dei cosiddetti
aggregati di fosfato di calcio “colloidale” (colloidal phosphate calcium, CCP, in generale Ca9(PO4)6). La kcaseina invece non ha residui di fosfato ma dei residui di un trisaccaride chiamato α-N-acetilneuraminil(2→6)-α-galattosil-(1→6)-N-acetilgalattosammina, legato alla treonina verso l’estremità C polare, che ne
36
Immagine tratta da: CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995, pag.
85.
37
Informazioni tratte da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 128.
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garantisce il carattere idrofilo. Il legame con gli ioni calcio riduce la carica negativa delle molecole,
rendendo così possibile l’associazione delle caseine. Si pensa che le catene polipeptidiche dei tre tipi di
caseina assumano una struttura terziaria, ripiegandosi cioè su se stesse. Altra particolarità che permette
l’associazione in micelle è il carattere idrofobo e idrofilo delle caseine, che ripiegandosi su se stesse
assumono un carattere anfifilico, e si dispongono fino a formare associazioni simili alle micelle di grasso.
Figura 24 38
Vediamo nella prossima figura una micella caseinica ripresa al microscopio; si nota la struttura submicellare,
e nella zona in ombra si nota una singola submicella.
38
Immagine tratta da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 129.
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Figura 25 39
La composizione totale della materia secca delle micelle caseiniche è mostrata nella tabella seguente:
Figura 26 40
39
Immagine tratta da: CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995, pag.
88.
40
Vedi sopra, pag. 89.
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4.7.
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Gli enzimi
Gli enzimi sono particolari proteine che operano come catalizzatori biologici: regolano la velocità con cui
una determinata reazione avviene. Essi sono prodotti dall’organismo stesso e sono presenti nelle cellule in
quantità minime (0.01 % in peso sulla sostanza secca) 41 .
4.7.1. Gli enzimi del latte
È importante parlare degli enzimi riferendosi al latte per vari motivi. Essi costituiscono una minima parte
della frazione proteica presente nel latte, però svolgono delle funzioni essenziali. Nel latte si possono trovare
due tipi di enzimi, quelli chiamati nativi e quelli chiamati di origine microbica. I primi derivano dall’animale
stesso, essendo secreti nella mammella assieme agli altri componenti del latte. Gli enzimi di origine
microbica si aggiungono al latte dopo la mungitura, essi provengono dallo sviluppo nel latte di batteri. Questi
enzimi spesso possono influire notevolmente sulle qualità organolettiche del latte.
4.7.1.1. Origine, presenza e attività degli enzimi nativi nel latte
Gli enzimi nativi derivano dal plasma o dal citoplasma delle cellule secretorie o dalla membrana dei globuli
di grasso. Alcuni di essi si trovano nel siero del latte, altri invece sono associati alle micelle caseiniche, alla
membrana dei globuli di grasso o alle particelle microcrosomali. L’attività e il tenore di molti di questi
enzimi è maggiore nei periodi terminali di lattazione, o in presenza di fenomeni mastitici. Altri fattori che
influenzano l’attività enzimatica sono ad esempio la stagione, la razza e l’alimentazione.
4.7.1.2. Classi di appartenenza
Nel prossimo capitolo (“4.7.2 Nomenclatura degli enzimi”) troviamo le varie classi in cui gli enzimi sono
suddivisi (si veda la descrizione delle classi per comprenderne le differenti attività). Vediamo di descrivere
brevemente a quali classi appartengono gli enzimi del latte.
Il latte contiene circa 60 enzimi nativi diversi; per la maggior parte di loro non è ancora stata definita la reale
importanza. Probabilmente per la maggior parte le condizioni di reazione sfavorevoli e la mancanza di un
substrato ideale, impediscono loro di esercitare la loro funzione catalitica. Ricordo che alcuni di questi
enzimi sono fondamentali nel processo di maturazione del formaggio.
Di seguito l’elenco degli enzimi nativi presenti nel latte 42 :
41
Tratto da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica delle
fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 55.
42
Tratto da: CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995, pag. 107.
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Figura 27 43
4.7.2. Nomenclatura degli enzimi
La Commissione Internazionale sugli Enzimi ha proposto nel 1961 un metodo generale di nomenclatura
degli enzimi; essi vengono suddivisi in sei gruppi secondo la natura della reazione che catalizzano e
ciascuno è caratterizzato dal seguente numero di codice 44 :
1. Ossido-riduttasi: catalizzano reazioni di ossido-riduzione e includono le ossidasi (ossidazione
diretta con ossigeno), le deidrogenasi (rimozione di idrogeno), …
2. Transferasi: catalizzano il trasferimento di vari gruppi funzionali, per esempio transaminasi, …
3. Idrolisi: catalizzano reazioni di idrolisi, per esempio proteasi, esterasi, …
4. Liasi: sono di due tipi: uno catalizza le addizioni al doppio legame, l’altro le eliminazioni con
formazione di doppi legami.
5. Isomerasi: catalizzano vari tipi di isomerizzazioni, per esempio racemasi, epimerasi, …
6. Ligasi: catalizzano le formazioni di un legame fra due molecole, a spese dell’energia fornita dal
legame pirofosforico di una molecola di ATP.
43
Immagine tratta da: CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995,
pag. 107.
44
Tratto da: CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995, pag. 55.
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Questi gruppi hanno a loro volta dei sotto e sotto-sotto gruppi, i quali hanno una numerazione. Per il nostro
interesse ci fermeremo a questi primi sei gruppi.
4.7.3. Cofattori
Spesso un enzima per svolgere la sua funzione necessita di un cofattore, o attivatore. Questa seconda parte
dell’oloenzima, complesso enzima-cofattore, è formata da una parte non proteica, la quale può essere di
origine organica, chiamata coenzima, o semplicemente uno ione metallico. Vediamo ora uno schema
riassuntivo per dare un’idea del funzionamento e delle interazioni tra apoenzima (parte proteica), coenzima e
substrato.
Figura 28 45
La parte proteica del complesso enzimatico, l’apoenzima, assume una struttura terziaria. Una specifica
regione di questa struttura presenta alcuni amminoacidi che costituiscono il sito attivo o catalitico
dell’enzima. Questo particolare sito è importante perché è proprio qui che avviene l’unione tra enzima e
substrato specifico, tramite interazioni di tipo intermolecolare (legami idrogeno, forze polari, forze di Van
der Waals, forze di contatto apolari) 46 . Di seguito un’illustrazione della struttura di un enzima con sito attivo,
completato dal substrato.
45
Immagine tratta da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO,
Chimica delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 56.
46
Elenco tipi di interazioni intermolecolari tratto da: ALBERTO TAGLIAFERRI, CELESTE GRANDE,
Biotecnologie e chimica delle fermentazioni, Zanichelli 2002, pag. 6.
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Figura 29 47
4.7.4. Cinetica enzimatica
Abbiamo riportato nell’introduzione agli enzimi che essi svolgono una funzione catalitica in una reazione,
regolandone la velocità. Risulta evidente che una parte importante dello studio degli enzimi sta nel
determinare grazie a formule matematiche la loro attività. Queste formule si rendono anche necessarie
siccome spesso gli enzimi vengono estratti dalla cellula loro produttrice e impiegati in mezzi acquosi
“estranei”; frequentemente non sono enzimi “puri”, ma contengono altre parti proteiche inattive. Si viene
dunque a formare “un’unità di attività” dell’enzima, differente dalla più usuale molarità. Questa unità di
attività indica la quantità di enzima che dà una certa attività catalitica in particolari condizioni standard
prescritte per quell’enzima 48 . Questa unità può quindi cambiare per lo stesso enzima a dipendenza delle
condizioni di reazione.
Di seguito un grafico della variazione della velocità di una reazione in funzione della concentrazione del
substrato.
47
Immagine tratta da: ALBERTO TAGLIAFERRI, CELESTE GRANDE, Biotecnologie e chimica delle
fermentazioni, Zanichelli 2002, pag.6.
48
Tratto da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica delle
fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 58.
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Figura 30 49
Possiamo dividere il grafico in tre parti:
1.
La parte iniziale a bassa concentrazione, dove abbiamo un certo tipo di velocità di reazione: la
velocità è fortemente influenzata dalla concentrazione del substrato, al suo aumentare cresce
fortemente.
2.
Nella parte centrale del grafico vediamo come la velocità di reazione continua ad aumentare con
l’aumento della concentrazione del substrato.
3.
Nell’ultima parte, aumentando ancora la concentrazione del substrato la velocità diventa quasi
massima, avvicinandosi lentamente ad un asintoto: in questo punto la velocità di reazione
diventa di ordine zero rispetto alla concentrazione del substrato. In questo momento tutti i siti
attivi dell’enzima sono occupati, si parla di saturazione dell’enzima.
Come si può notare dal grafico, in assenza di un enzima che catalizzi la reazione, la sua velocità aumenta in
modo lineare, ma di poco.
La velocità è proporzionale alla quantità di enzima presente. Questi risultati sono espressi dall’equazione di
Michaelis-Menten 50 :
v=
[E ]0 [S ]K cat
K M + [S ]
Dove: Km (detta costante di Michaelis) e Kcat sono costanti tipiche del sistema, [S] è la concentrazione del
substrato libero e [E]0 è la concentrazione totale dell’enzima, libero e legato.
49
50
Vedi nota precedente.
Vedi nota precedente.
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4.7.5. Fattori che influenzano l’attività enzimatica
Dall’equazioni prima ricavata si può proseguire per trovare altre equazioni semplificate che si adattano a
determinate situazioni. In linea di massima però l’equazioni di Michaelis-Menten (vista prima) è valida per
tutti gli enzimi tranne gli allosteroici che si comportano diversamente. Per l’interesse del lavoro ho
tralasciato la parte appena descritta, più interessante è invece trattare altri fattori che intervengono
nell’attività enzimatica. Con attività enzimatica si intende la velocità di reazione dell’enzima in esame
quando opera nelle condizioni ottimali; cioè quando la velocità assume il massimo valore possibile alle
condizioni sperimentali date 51 . I fattori di cui si parla sono generalmente gli stessi che influenzano la velocità
della reazione, principalmente si parla di:
1.
Concentrazione dell’enzima ([E])
2.
Concentrazione del substrato ([S])
3.
pH del mezzo di reazione
4.
Temperatura del sistema (T)
4.7.5.1. Influenza del pH nelle reazioni enzimatiche
Abbiamo già trattato dell’importanza e dell’influenza delle concentrazioni rispettivamente dell’enzima ([E])
e del substrato ([S]).
Per quanto riguarda l’influenza del pH sono stati condotti degli esperimenti; si è misurata la velocità di
reazione di un particolare enzima mantenendo costanti la concentrazione dell’enzima, la temperatura,
saturando l’enzima con quantità costante di substrato specifico e variando il pH. Dallo studio dei grafici
risulta un valore particolare, chiamato pH ottimale, che equivale al valore di velocità massima, ottenuto in
quel solo punto preciso (troviamo un esempio nella Figura 31).
Figura 31 52
51
Tratto da: ALBERTO TAGLIAFERRI, CELESTE GRANDE, Biotecnologie e chimica delle
fermentazioni, Zanichelli 2002, pag. 11.
52
NEIL A. CAMPBELL, JANE B. REECE, Biologia, Seconda edizione italiana condotta sulla Sesta
edizione americana, Zanichelli 2004, pag. 104.
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Tale risultato è dovuto al fatto che l’enzima e il substrato sono generalmente composti ionizzabili, e ciò
influisce direttamente sulla concentrazione dei due, sia nelle loro strutture, sia nelle interazioni che si
stabiliscono per la formazione del complesso. Esiste un valore massimo di affinità tra le due sostanze, dato
che corrisponde a un preciso grado di dissociazione e che corrisponde ad un massimo di interazione fra i due.
Per certi valori di pH estremi, l’idrolisi dell’enzima influisce su di esso portandolo all’inattivazione o
addirittura alla denaturazione. Vediamo un esempio che ci può far capire a quali cambiamenti può portare
una variazione di pH.
Figura 32 53
4.7.5.2. Influenza della temperatura nelle razioni enzimatiche
Come nelle normali reazioni, anche in quelle enzimatiche la temperatura ha un grosso influsso sull’attività
degli enzimi. Influisce sullo stato di agitazione delle molecole, e quindi sulla quantità di urti efficaci della
reazione e abbassa l’energia di attivazione necessaria alla formazione del complesso enzima-substrato.
L’aumento di temperatura accelera tutte le reazioni chimiche. Come già detto è da tener presente che esiste
un limite: la temperatura di alterazione anche di uno solo dei reagenti. Nelle reazioni enzimatiche molto
spesso esiste un valore di temperatura limite, il quale provoca la denaturazione dell’enzima, che è
relativamente basso se confrontato con la maggior parte delle reazioni organiche. Come per il pH anche per
la temperatura esiste un valore di temperatura ottimale, questa è caratterizzata da:
•
Massima attività enzimatica alle condizioni operative
•
Variazione in base all’enzima
•
Dipende dal particolare sistema cellulare
La maggior parte degli enzima ha come temperatura ottimale l’intervallo fra i 30°C e i 40°C (nella Figura 33
l’esempio di un tipico enzima umano, con rispettiva temperatura ottimale poco inferiore ai 40°C e un’enzima
batterico).
53
Vedi nota precedente, pag. 12
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Figura 33 54
Sia temperatura che pH non sono sempre al livello ottimale nelle condizioni intracellulari, ciò vuol dire che
sono dei fattori regolatori dell’attività enzimatica: lo scopo non è però quello di rendere massimo questo
valore, ma quello di rendere funzionale l’attività della cellula.
4.7.6. Inibizione enzimatica
Essendo di natura proteica, gli enzimi possono essere inattivati in diverse situazioni da diverse sostanze.
Esistono sostanze classificate come inibitori specifici, e altre come inibitori aspecifici. In generale si
distinguono due tipi di inibizione, quella reversibile e quella irreversibile. Gli inibitori specifici hanno una
particolare affinità per un determinato enzima. Essi si legano al sito specifico dell’enzima inattivando lo
stesso: impediscono così la formazione del complesso enzima-substrato. Non tratteremo in modo più
approfondito altri tipi di inibizione a livello enzimatico (si parla di reversibilità o irreversibilità,
competizione, competizione tra substrati, legami non produttivi, …).
54
NEIL A. CAMPBELL, JANE B. REECE, Biologia, Seconda edizione italiana condotta sulla Sesta
edizione americana, Zanichelli 2004, pag. 104.
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5. Fermentazione lattica
5.1.
Un po’ di storia
Sin dalla notte dei tempi, molto prima della comparsa dell’uomo sulla terra, microrganismi batterici si
avvalevano già del processo della fermentazione per vivere. La prima traccia di fermentazione utilizzata
dall’uomo, risale al periodo attorno al 5000 a.C. ed è attribuita ai Sumeri, i quali convertivano lo zucchero in
alcool per la produzione della birra. Altre tracce si hanno presso gli Egiziani, attorno al 4000 a.C. i quali
usavano il lievito per la panificazione. Altre popolazioni sfruttavano invece l’azione dei batteri dell’acido
lattico per conservare il latte, producendo formaggi con muffe e batteri. 55 Lo scopo che questi batteri
avevano, ed hanno ancora oggigiorno, consiste nel ricavare energia da molecole nutrizie, trasformando ciò a
loro disposizione in un qualcos’altro che andremo a conoscere. Il termine fermentazione deriva infatti dal
latino Fermentum ed indica il ribollire o l’agitarsi di una massa. Generalmente nel campo dell’industria con
fermentazione si indica un qualsiasi processo che veda impiegati dei microrganismi (quali funghi, batteri,
lieviti, …) che moltiplicandosi rapidamente provocano la trasformazione della miscela di reazione. In effetti
durante il processo di fermentazione vengono a formarsi dei nuovi prodotti di cui alcuni sono in fase gassosa.
Esistono diversi tipi di fermentazione, la più diffusa è forse quella alcolica (usata per produrre birra, vino,
…). Noi ci occuperemo della fermentazione omolattica o glicolisi o via Embden-Mezerhof-Parnas (via EMP)
più comunemente chiamata fermentazione lattica. È proprio la stessa che usavano le popolazioni primitive
per conservare il latte, dove il prodotto della fermentazione derivante dalla miscela di reazione è un acido.
La fermentazione lattica prende il suo nome proprio dall’ambiente in cui si svolge, o per meglio dire, dal
prodotto che crea, l’acido lattico. Importante sottolineare che, come gli altri tipi di fermentazione, anche
quella omolattica può avvenire in ambiente anaerobico, cioè in ambiente privo di ossigeno. Si ricordi che
questa fermentazione avviene grazie a dei microrganismi, dei batteri, che trovandosi in ambiente anossico
vivono e lavorano in assenza di ossigeno, pur tollerandolo.
5.2.
Alcune nozioni
5.2.1. Energia libera di Gibbs
Nel corso del testo si parlerà più volte dell’energia libera di Gibbs. L’energia libera di Gibbs descrive la
quantità di energia disponibile che esiste in un determinato luogo, quella che è appunto chiamata energia
libera. Essa fa parte delle tre entità fondamentali della termodinamica atte a descrivere le variazioni di
energia che avvengono all’interno di una reazione chimica. Di simbolo G, esprime la quantità di energia in
55
Tratto da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica delle
fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag.1
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grado di produrre un lavoro durante una reazione a temperatura e pressione costanti. 56 Una reazione che
procederà con il rilascio di energia libera, cioè che si modificherà verso uno stato che possiederà un’energia
libera minore, sarà detta esoergonica, e la variazione di energia libera (ΔG) avrà un segno negativo. Al
contrario una reazione che avverrà in senso inverso, procedendo quindi da uno stato con bassa energia libera
verso uno stato con un’energia libera più alta, sarà detta endoergonica, e avrà una variazione di energia libera
(ΔG) di segno positivo. Si avrà un ΔG < 0 quando la reazione sarà spontanea, un ΔG > 0 quando sarà indotta.
Il fatto che una reazione non sia favorita, ossia con ΔG > 0, in termini pratici vuol dire che per avvenire deve
recuperare dell’energia che compensi questo squilibrio positivo in termini di ΔG. In due reazioni sequenziali
come A U B e B U C, B risulta essere presente sia nella prima sia nella seconda reazione, essendo
prodotto della prima e reagente della seconda: in questo caso i rispettivi valori di ΔG si possono sommare.
Da questa caratteristica si ricava una preziosa base dalla quale moltissimi organismi traggono vantaggio. Il
fatto che i valori di ΔG di queste due reazioni di possano sommare fa sì che una reazione potenzialmente
sfavorita (ΔG > 0), se combinata con una reazione spontanea, o meglio esoergonica, possa avvenire
ugualmente. Vedremo in seguito come questa caratteristica sia di fondamentale importanza nella
fermentazione omolattica, che ci interessa.
5.2.2. Il complesso ATP-ADP, una fonte di energia
La reazione della fermentazione lattica che conosceremo più tardi, è chiaramente esoergonica, ovvero è una
reazione che fornisce energia al sistema in cui avviene. Dobbiamo tener conto che la reazione è esoergonica
nel suo complesso, e come approfondiremo in seguito si sviluppa in più tappe. Il fatto che questa reazione sia
formata da più passaggi intermedi, e che fornisca energia al sistema nel suo insieme, ci dovrebbe far pensare
ad un ostacolo da qualche parte: effettivamente è così. La reazione necessita di un’energia iniziale per poter
poi continuare, si parla di energia di attivazione. È compito del microrganismo trovare il sistema, o per
meglio dire trovare l’energia necessaria, per dare l’impulso iniziale, come in un motore a scoppio lo è la
scintilla innescante. Soluzione del problema è l’impiego di una molecola ad alta energia, molecola che sta
alla base di tutti i funzionamenti metabolici degli esseri viventi. Andiamo ora a conoscere le fattezze, le
particolarità e il funzionamento di questa molecola.
La molecola di ATP, o più in generale il complesso ATP-ADP, ha una funzione indispensabile nel
metabolismo delle cellule. Questa molecola, il cui nome è Adenosina trifosfato, generalmente fornisce
l’energia necessaria per svolgere un determinato lavoro all’interno della cellula. Nel caso della
fermentazione, come vedremo in seguito, l’ATP è indispensabile: essa fornisce l’energia necessaria per
innescare la reazione di fermentazione, dalla quale a sua volta il batterio ricaverà l’energia necessaria per
vivere. Vediamo più in dettaglio il reale funzionamento di questo complesso che si rivelerà essere così
importante.
56
DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di lehninger, Zanichelli 2002,
Terza edizione, pag. 479
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5.2.2.1. Come ricavare energia da una molecola
L’ATP, Adenosina Trifosfato, deriva questo nome proprio dalla sua composizione; la parte evidenziata del
nome è quella che ci interesserà maggiormente. La molecola è una catena composta da tre atomi di fosforo
(P) legati a degli ossigeni (O) e due molecole rispettivamente di ribosio e adenina, ne vediamo la formula in
figura 27.
L’energia ricavata da questa molecola deriva dall’idrolisi dell’ultimo gruppo fosforico della catena, questa
reazione porterà alla formazione di una molecola di ADP e una di Pi (HPO42-). La reazione può ulteriormente
procedere con l’idrolisi di quello che risulterà ora essere l’ultimo gruppo fosforico dell’ADP, formando
quindi, complessivamente, una molecola di AMP (adenosina monofosfato) e due di Pi. Per l’interesse della
fermentazione ci servirà esclusivamente conoscere il funzionamento della fosforilazione del primo gruppo
fosforico.
Il gruppo fosforico (Pi) si stabilizza per risonanza come si vede nella seguente figura:
Figura 34 57
La stabilizzazione per risonanza è semplicemente una forma più stabile del composto, che consiste nell’avere
un doppio legame tra P e O non fisso, bensì mobile, dislocato cioè su tutti i 4 atomi di ossigeno. Ne deriva
che risultano delle cariche parziali identiche su tutti gli atomi di ossigeno. Questa forma permette alla
molecola di avere una carica parziale omogenea, che si trova distribuita uniformemente su tutta la molecola,
evitando quindi il formarsi di una parte polare (caricata negativamente). Ciò porta ad una maggiore stabilità,
condizione che tutte le molecole chimiche cercano di ottenere.
57
DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di lehninger, Zanichelli 2002,
Terza edizione, pag. 489.
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Il processo descritto, ovvero la formazione di Pi e ADP partendo dall’ATP, ha un valore di energia libera di
Gibbs negativo, e relativamente alto, equivalente a -30,5 kJ/mol. Il processo inverso è possibile, necessitando
chiaramente di un apporto di energia, pari a +30,5 kJ/mol. 58
Riassumendo il processo (formazione di una molecola di ADP e una di Pi partendo da una molecola di ATP)
in modo un po’ più generale, ma che sottolinea l’aspetto principale del complesso ATP-ADP, si può dire che
un composto ad alta energia (ATP) andrà a formarne uno con minor energia (ADP + Pi). Interessante può
essere dare un’idea visiva di quello che succede, la seguente immagine illustra le molecole
tridimensionalmente:
Figura 35
Ritornerà in seguito il discorso di composti ad alta energia, e anche in questo caso troveremo la presenza di
un gruppo fosforico. Potrà essere utile per una miglior comprensione globale del testo e del funzionamento di
base che è presente in tutte le reazioni biochimiche ricordare l’importanza del gruppo fosfato, proveniente
dall’ATP in questo caso, e che verrà applicato in altri composti in altre condizioni.
5.2.3. Il complesso NAD+ - NADH, un trasportatore di elettroni
In tutte le reazioni chimiche -dove vengono ad interagire due diverse specie chimiche- come quelle di cui
stiamo parlando, ci sono spostamenti di elettroni, che determinano la riduzione o l’ossidazione delle varie
specie chimiche 59 . Durante queste reazioni gli elettroni (e-) non sono trasferiti sempre istantaneamente, ma
intervengono spesso dei “trasportatori di elettroni”: particolari coenzimi che sono presenti in numerosi
processi biochimici. Il trasferimento di elettroni su un trasportatore necessita di un substrato, dal quale
provengono gli e- (sotto forma di ione idruro, H-) e di un particolare enzima, il quale rimuove una coppia di
idrogeno dal substrato. Il particolare trasportatore di cui ci occuperemo brevemente, il quale interverrà in
58
Da notare che questi valori sono calcolati in condizioni standard, mentre noi ci occuperemo di una
reazione svolta da batteri, quindi in condizioni differenti, e che variano dal tipo di cellula e dall’ambiente in
cui ci troveremo. Il concetto generale di ATP come fonte di energia resta invariato, da notare che le
condizioni in cellule diverse, quindi con possibili concentrazioni e temperature differenti, possono far variare
questo valore di energia libera, molto spesso situato fra i -50 e i -65 kJ/mol. Questo valore viene
comunemente chiamato Potenziale di fosforilazione (ΔGp). Per questione di comodità nel resto del testo
useremo il valore di energia libera standard.
59
Si parla di riduzione quando una specie chimica acquista elettroni, rispettivamente di ossidazione quando
ne perde.
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seguito nel processo della fermentazione è il NAD+ (il suo nome completo ne descrive la sua struttura:
nicotinammide adenin dinucleotide).
5.2.3.1. Struttura e funzionamento del complesso NAD+ - NADH
Abbiamo parlato di un particolare enzima che interviene in questa riduzione del NAD+, esso infatti interviene
sul substrato (uno zucchero) il quale va incontro ad una ossidazione (deidrogenazione) perdendo due protoni
(H+) e due elettroni (e-). Questi enzimi prendono il nome di ossidoreduttasi e sono comunemente anche detti
deidrogenasi. I due elettroni sono trasferiti come ione idruro (H-) al nostro coenzima, mentre il restante
protone (H+) viene liberato nell’ambiente circostante. La forma ridotta NADH mostra questo acquisto di un
atomo di idrogeno; la carica positiva scomparsa è dovuta alla sua neutralizzazione da parte del secondo
elettrone presente nello ione idruro (H-). La carica positiva del NAD+ non si riferisce a tutta la molecola, al
contrario caricata negativamente, bensì unicamente alla carica presente sull’atomo di azoto (N) dell’anello
benzenoico della nicotinammide, la stessa che viene neutralizzata dal secondo e-. Gli enzimi che operano in
questa reazione sono molteplici, e come si vede nella Figura 36 sono possibili due sostituzioni, che portano
a quello che viene chiamato “Tipo A” e “Tipo B”; dette differenti sostituzioni sono opera della specificità
dell’enzima, che verrà così chiamato A o B.
Figura 36 60
60
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di
lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag. 509.
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Nella maggior parte delle cellule la concentrazione del NAD+ è maggiore di quella del NADH, questo
rispecchia il suo particolare ruolo all’interno del metabolismo cellulare 61 ; è presente quindi nelle riduzioni,
più correttamente nei processi di ossidazione catabolica.
5.3.
Fermentazione
5.3.1. Introduzione
Figura 37 62
Come detto, il processo della fermentazione è il modo grazie al quale i batteri coinvolti ricavano energia per
il loro metabolismo e quindi per vivere. Il punto di partenza per ottenere questa energia è il processo
biochimico della glicolisi; questa via è presente in tutti i tipi di cellule. Fondamentalmente noi esseri viventi,
le piante, e persino questi batteri coinvolti nella fermentazione omolattica viviamo grazie ad uno stesso
stratagemma evolutivo (effettivamente sarebbe più corretto girare l’ordine dell’elenco e dire che i batteri, le
piante, e infine noi utilizziamo lo stesso stratagemma per ricavare energia da una molecola). La glicolisi, o
catabolismo del glucosio, consiste nel “degradare” una molecola di glucosio, fino a formare due molecole di
piruvato, composto formato da tre atomi di carbonio. Pur sfruttando lo stesso processo, questa via ha alcune
differenze nelle piante, negli animali, e nei batteri. Le differenze in questione riguardano: in primo luogo la
molecola di partenza, che può essere il glicogeno negli umani, l’amido nelle piante o il lattosio (zucchero del
61
Il complesso NAD+ - NADH non è l’unico presente nelle cellule e quindi nelle reazioni, ce ne sono molti
altri. In particolar modo il suo più stretto parente è il NADPH, che si differenzia dal precedente solo per la
presenza di un gruppo fosforico. Il funzionamento del complesso è identico, rilevante è la diversa
concentrazione delle due forme, ossidata e ridotta. Questo rapporto invertito (più elevata la concentrazione
della forma ridotta NADPH rispetto a quella preponderante ossidata di NAD+) indica anche qui il suo
intervento nei processi metabolici: è favorito il trasferimento di uno ione idruro dalla forma ossidata a quella
ridotta, e opera quindi nei processi di riduzione anabolica. Le deidrogenasi di cui si parlava prima presentano
anche esse delle preferenza per uno dei due coenzimi, e sono quasi sempre specifiche per uno o per l’altro.
62
Immagine tratta da: NEIL A. CAMPBELL, JANE B. REECE, Biologia, Seconda edizione italiana
condotta sulla Sesta edizione americana, Zanichelli 2004, pag. 175.
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latte) nel caso che più ci interessa, e in secondo luogo l’ambiente in cui queste reazioni si svolgono, che
influisce sul destino del piruvato. Queste differenze si possono notare all’inizio del processo e alla fine, la
prima, riguardante la molecola di partenza, è la meno importante: la glicolisi parte con il glucosio, nel caso in
cui fosse presente il lattosio, formato da di glucosio e di galattosio, si procederebbe dapprima separando le
due molecole, e in seguito trasformando quella di galattosio in una di glucosio, per poi continuare la glicolisi.
La seconda, riguardante l’ambiente in cui la reazione si svolge, è più rilevante, e riguarda il destino del
prodotto della glicolisi (il piruvato). Trovandoci nel latte in condizioni anaerobiche e in presenza di batteri
lattici, il suo destino sarà quello di diventare acido lattico (o lattato). Altri possibili prodotti sono l’alcool
(nella fermentazione alcolica, in ambiente anossico e in presenza di lieviti) o semplicemente CO2 in
condizioni aerobiche, come succede nella maggior parte dei casi, nelle piante, negli animali e in altre cellule
microbiche.
Figura 38 63
63
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di
lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag.521.
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5.3.2. La glicolisi
Figura 39 64
64
Vedi nota precedente, pag. 519.
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Il nome glicolisi, dal greco glykýs, dolce, e lýsis, scissione, descrive una reazione nella quale una molecola
di glucosio viene degradata in una serie di dieci reazioni (Figura 39)catalizzate da enzimi per produrre due
molecole di un composto a tre atomi di carbonio, il piruvato. L’energia rilasciata da questa serie di reazioni
viene immagazzinata sotto forma di ATP e NADH. La glicolisi può essere divisa in due fasi, la prima viene
chiamata fase preparatoria o fase di investimento energetico, poiché è in questa prima fase, formata da
cinque reazioni, che il glucosio viene trasformato e scisso in due molecole di gliceraldeide 3-fosfato,
processo che richiede un investimento energetico pari a due molecole di ATP. Avvenuta questa parte
preparatoria, seguono altre cinque fasi successive, dove il gliceraldeide 3-fosfato viene trasformato in
piruvato, con guadagno di 4 molecole di ATP e due di NADH. Facendo i conti, quindi sommando il costo
energetico della prima serie di reazioni al guadagno della seconda serie, otteniamo un guadagno netto di 2
molecole di ATP e due di NADH per ogni molecola di glucosio. Oltre all’ATP, nella seconda fase della
glicolisi si formano 2 nuove molecole di NADH, che serviranno in seguito per far proseguire la glicolisi.
Vediamo ora di approfondire le dieci tappe che portano alla formazione di piruvato partendo dal glucosio.
Tappa 1, fosforilazione del glucosio:
Nella prima fase della glicolisi, il glucosio viene fosforilato sul suo atomo di carbonio 6 (C-6); viene così
prodotto il glucosio 6-fosfato. Il gruppo fosforico (−PO32-) acquistato dalla molecola di glucosio proviene
dall’ATP.
Figura 40 65
La reazione è irreversibile nelle condizioni intracellulari ed è catalizzata dall’enzima esochinasi. Sono
chiamati “chinasi” quegli enzimi che catalizzano il trasferimento del gruppo fosforico terminale dell’ATP a
un accettore nucleofilo 66 . Nella reazione catalizzata dall’esochinasi l’accettore del gruppo fosforico è un
65
66
Vedi nota precedente pag. 522.
Si dice nucleofilo una specie chimica che cerca un nucleo (dal greco filo, amare).
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esosio 67 , normalmente il D-glucosio. Come si può notare nello schema, la reazione avviene in presenza di
Mg2+, questo perché per svolgere la sua funzione di catalizzatore l’esochinasi ha bisogno dello ione
magnesio; il vero substrato è infatti MgATP2-, come si vede nella figura (Figura 41).
Figura 41 68
La variazione di energia libera standard di questa prima reazione è di -16,7 kJ/mol. La variazione reale
dipende però da alcune concentrazioni, per comodità useremo quindi in tutto il testo la variazione di energia
libera standard; può comunque essere interessante vedere quale sarebbe la variazione reale di questa prima
tappa della glicolisi in un batterio quale E. coli, il quale in alcuni sfortunati casi si trova anche nel formaggio.
Indicheremo con ΔG p il potenziale di fosforilazione (potenziale reale in una cellula, tenendo conto quindi
delle concentrazioni). La formula è 69 :
ΔG p = ΔG '° + RT ⋅ ln
[ ADP ] ⋅ [ Pi ]
[ ATP ]
Sostituendo i valori delle concentrazioni, otteniamo:
ΔG p = −16700 Jmol-1 + 8,315 Jmol-1K -1 ⋅ 298 K ⋅ ln
1, 04 ⋅10−3 ⋅ 7,9 ⋅10−3
7,90 ⋅10−3
ΔG p ≈ -33 719 J/mol = -33,719 kJ/mol
La variazione reale di energia libera (potenziale di fosforilazione) in una cellula di E. coli sarà dunque pari a
circa -33,719 kJ/mol, più del doppio del valore standard.
67
Zucchero a 6 atomi di carbonio.
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di
lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag. 489.
69
Formula e valori di concentrazioni all’interno delle cellule di E.coli tratti da : vedi nota precedente pag.
488-490.
68
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Tappa 2, conversione del glucosio 6-fosfato a fruttosio 6-fosfato
Questa reazione è catalizzata dall’enzima fosfoesosio isomerasi (fosfoglucosio isomerasi). Questo enzima
catalizza l’isomerizzazione reversibile del glucosio 6-fosfato (un aldosio) in fruttosio 6-fosfato (un chetosio).
Figura 42 70
La variazione di energia libera standard è relativamente piccola, 1,7 kJ/mol, ed è come detto reversibile.
Anche la fosfoesosio isomerasi richiede Mg2+ per catalizzare la reazione, ed è specifica per il
glucosio 6-fosfato e il fruttosio 6-fosfato.
Tappa 3,fosforilazilazione del fruttosio 6-fosfato a fruttosio 1,6-bisfosfato
Nella terza tappa della glicolisi l’enzima che catalizza la reazione è la fosfofruttosiochinasi-1, che catalizza il
trasferimento del gruppo fosforico dell’ATP, dallo stesso al fruttosio 6-fosfato, trasformandolo al fruttosio
1,6-bisfosfato.
Figura 43 71
70
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di
lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag. 523.
71
Idem.
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Esiste pure l’enzima fosfofruttosiochinasi-2 (PFK-2), che di diverso dall’enzima fosfofruttosiochinasi-1
(PFK-1) ha solamente la posizione di attacco del gruppo fosforico, sul C-2 al posto del C-1; entrambi gli
enzimi hanno come reagente il fruttosio 6-fosfato.
L’attività di questo enzima varia molto, ha un forte compito regolatore. Ci sono vari fattori che lo inibiscono
o attivano, come per esempio il prodotto del PFK-2 (attivatore), la scarsa disponibilità di ATP nella cellula o
un accumulo dei prodotti della degradazione dell’ATP (ADP, AMP). Viene invece inibito quando si trova in
una situazione in cui c’è un’alta concentrazione di ATP.
Tappa 4, scissione del fruttosio 1,6-bisfosfato
Questa reazione è catalizzata dall’enzima fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi, spesso chiamato semplicemente
aldolasi. Partendo dal fruttosio 1,6-bisfosfato vengono a formarsi due triosi fosfato diversi: la
gliceraldeide 3-fosfato (aldosio) e il diidrossiacetone fosfato (chetosio).
Figura 44 72
Questa reazione è reversibile, e nei microrganismi avviene in presenza di ioni Zn2+. Durante il processo della
glicolisi, i due prodotti della scissione del fruttosio 1,6-bisfosfato, i due triosi fosfati, sono rimossi molto
velocemente dalle reazioni sucessive, facendo così proseguire la reazione spostando l’equilibrio nella
direzione della scissione del chetosio formando così i triosi.
Tappa 5, interconversione dei triosi fosfato
Nella reazione successiva, tappa 6, solamente uno dei due prodotti nella precedente può essere utilizzato, la
gliceraldeide 3-fosfato. Il secondo prodotto, il diidrossiacetone fosfato, non è prodotto di scarto, bensì
dev’essere trasformato reversibilmente anche lui un gliceraldeide 3-fosfato, per poi proseguire anche lui
lungo la glicolisi. La triosio fosfato isomerasi è l’enzima che converte il chetosio in questione nello stesso
aldosio gia formatosi prima.
72
Vedi nota precedente, pag. 524.
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Figura 45 73
Con la tappa 5 si conclude la fase preparatoria, dove due molecole di gliceraldeide 3-fosfato si sono formate
tramite una serie di reazione catalizzate da enzimi specifici da una stessa molecola di glucosio. Nelle tappe
precedenti si è assistito all’impiego di due molecole di ATP, dalle quali si è staccato il gruppo fosforico
terminale, servito per fosforilare la molecola di glucosio. Alcune delle reazione appena viste hanno liberato
energia, altre acquistata; nella prossima serie di reazioni vedremo come il sistema sarà in grado di
immagazzinare dell’energia, entrando così nella parte di recupero energetico.
Tappa 6, ossidazione della gliceraldeide 3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato
Catalizzatore
di
questa
prima
tappa
della
fase
di
recupero
energetico
è
l’enzima
gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi. Durante questa reazione viene conservata dell’energia sotto forma di
NADH. Ricordo che la reazione seguente avviene per ogni singola molecola di gliceraldeide 3-fosfato e che
con le reazioni viste fin ora, partendo da una molecola di glucosio, ne abbiamo ottenute due.
Figura 46 74
Vediamo più in dettaglio come si libera la molecola di NADH e da dove proviene.
73
74
Idem.
Vedi nota precedente, pag. 525.
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Figura 47 75
Al punto 1 di questo schema si forma un legame tra il substrato e il gruppo sulfidrilico di un residuo di Cys
(sigla dell’amminoacido chiamato cisteina (cfr. Allegati, cap. 10.1)) del sito attivo dell’enzima. Questo
intermedio enzima-substrato viene ossidato dall’NAD+ anch’esso legato al sito attivo dell’enzima (punto 2).
Il NADH legato all’enzima viene riossidato dall’ NAD+ libero (punto 3). Infine il legame tioestere (S-Cys)
viene fosforilato rilasciando l’enzima libero e il prodotto che proseguirà lungo la glicolisi
(1,3-bisfosfoglicerato).
Tappa 7, trasferimento del gruppo fosforico dall’1,3-bisfosfoglicerato all’ADP
In questa tappa viene trasferito il gruppo fosforico dell’1,3-bisfosfoglicerato all’ADP, per formare così una
molecola di ATP e una di 3-fosfoglicerato. Questa reazione è catalizzata dall’enzima fosfoglicerato chinasi 76 .
75
Vedi nota precedente, pag. 526.
Il nome di questo enzima deriva dalla reazione di fissazione fotosintetica della CO2, che avviene in senso
inverso, si riferisce quindi al trasferimento di un gruppo fosforico dall’ATP, come tutte le chinasi.
76
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Figura 48 77
Le due reazione appena viste, tappa 6 e tappa 7, costituiscono assieme un processo di accoppiamento
energetico, dove avviene una fosforilazione a livello del substrato. Abbiamo come intermedio comune l’
1,3-bisfosfoglicerato che si forma nella tappa 6. Il gruppo fosforico sostituitosi all’enzima grazie alla
fosforolisi del legame tioestere, sempre nella reazione precedente, viene trasferito nella tappa 7 all’ADP,
formando così ATP.
La prima reazione (endoergonica, + 6,3 kJ/mol) accoppiata con la seconda (esoergonica, - 18,5 kJ/mol)
dimostra come ci sia un accoppiamento tramite un intermedio comune, l’1,3-bisfosfoglicerato. La reazione
nel suo insieme è quindi esoergonica.
Abbiamo gia visto in precedenza come la variazione di energia libera reale dipenda dalle concentrazioni e
dai rapporti fra reagenti e prodotti. La variazione reale della reazione 6 sarebbe:
ΔG = ΔG '° + RT ⋅ ln
[1,3 − bisfosfoglicerato ] ⋅ [ NADH ]
[ gliceraldeide 3 − fosfato] ⋅ [ Pi ] ⋅ ⎡⎣ NAD + ⎤⎦
La reazione 7 consuma l’1,3-bisfosfoglicerato prodotto nella reazione 6; con un valore del rapporto inferiore
a 1,0 il valore del logaritmo naturale acquista un segno negativo, e se il rapporto ha un valore molto piccolo
il logaritmo di tale rapporto sarà grande e negativo, influenzando notevolmente il valore di ΔG , cioè la
variazione di energia libera reale. Questo fatto ci dimostra ulteriormente come le due reazioni siano
accoppiate da un intermedio comune, l’1,3-bisfosfoglicerato.
Tappa 8, conversione del 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato
La fosfoglicerato mutasi, un enzima, catalizza la reazione reversibile di spostamento del gruppo fosforico del
fosfoglicerato dal C-3 al C-2. Per avvenire questa reazione necessita di ioni magnesio, Mg2+.
77
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di
lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag. 527.
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Figura 49 78
La reazione è relativamente complessa, e si suddivide in più passaggi. Un gruppo fosforico legato a un
residuo di His (sigla dell’amminoacido chiamato istidina, (cfr. Allegati, cap. 10.1)) del sito attivo
dell’enzima,
viene
trasferito
sul
gruppo
ossidrilico
del
C-2
del
3-fosfoglicerato,
formando
2,3-bisfosfoglicerato (BFG). Il gruppo fosforico legato al C-3 viene poi trasferito allo stesso residuo di His
dell’enzima, producendo quindi il 2-fosfoglicerato e rigenerando l’enzima fosforilato. Il gruppo fosforico
legato al residuo di His dell’enzima proviene da un’altra molecola di 2,3-bisfosfoglicerato, diventato quindi
un cofattore, necessario in piccole quantità per permettere l’inizio del ciclo della reazione, la stessa dalla
quale sarà poi rigenerato.
Figura 50 79
Vediamo nella figura come l’enzima fosforilato prenda il gruppo fosforico da una molecola di
2,3-bisfosfoglicerato, a sua volta prodotta dalla reazione del 3-fosfoglicerato catalizzata da una chinasi
ATP-dipendente, dove quindi il gruppo fosforico proviene da una molecola di ATP.
78
79
Vedi nota precedente, pag. 528.
Vedi nota precedente.
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Tappa 9, deidratazione del 2-fofoglicerato a fosfoenolpiruvato
Penultima reazione per arrivare al prodotto finale della glicolisi, il piruvato. In questa tappa si forma
fosfoenolpiruvato partendo dal prodotto della reazione precedente, il 2-fosfoglicerato. L’enzima che catalizza
la reazione è l’enolasi, enzima che promuove la rimozione di una molecola d’acqua dal 2-fosfoglicerato.
Figura 51 80
Tappa 10, trasferimento del gruppo fosforico dal fosfoenolpiruvato all’ADP
È questa l’ultima tappa delle 10 reazioni della glicolisi, reazione in cui si forma il piruvato, con
immagazzinamento di energia in una molecola di ATP. La reazione è catalizzata dall’enzima piruvato
chinasi, che trasferisce il gruppo fosforico del fosfoenolpiruvato all’ADP, formando così una molecola di
ATP e una di piruvato. L’enzima necessita di ioni magnesio (Mg2+) o potassio (K+) o manganese (Mn2+).
Figura 52 81
80
81
Vedi nota precedente, pag. 529.
Idem.
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Il valore della variazione di energia libera standard molto negativo, è dovuto alla tautomerizzazione
spontanea del piruvato dalla forma enolica a quella chetonica. La forma chetonica è quella prevalente a pH
7,0. Il valore di variazione di energia libera standard della reazione è pari a -61,9 kJ/mol.
Questa energia viene ripartita quasi equamente in due parti tra la conservazione dell’energia nel legame
fosfoanidrico dell’ATP (-30,5 kJ/mol) e forza trainante per la reazione di sintesi dell’ATP stesso
(-31,4 kJ/mol).
Figura 53 82
Nella figura sopra è mostrata l’idrolisi del fosfoenolpiruvato a piruvato in forma enolica, e in seguito la
tautomerizzazione nella forma chetonica.
5.3.2.1. Bilancio energetico complessivo
Finora abbiamo descritto le singole tappe costituenti la glicolisi. Per dimostrare la validità di questa via
metabolica tracciamo ora un rapido bilancio energetico sommando tutte le variazioni di energia delle singole
tappe:
1) -16.7
kJ/mol
2) +1.7
kJ/mol
3) -14.2
kJ/mol
4) +23.8 kJ/mol
5) +7.5
kJ/mol
6) +6.3
kJ/mol
7) -18.5
kJ/mol
8) +4.4
kJ/mol
9) +7.5
kJ/mol
10) -31.4
kJ/mol
Totale 1 - 5: +2.1 kJ/mol
Totale6 - 10: -31.7 kJ/mol
Totale: -29.6 kJ/mol
Osservando i due totali parziali, quello riferito alle prime 5 tappe e quello riferito alle tappe 6-10, risulta che
si può realmente dividere la glicolisi in due fasi. La prima è detta di investimento energetico, dove vengono a
82
Vedi nota precedente, pag. 491.
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formarsi le molecole necessarie allo svolgimento della seconda fase; la seconda è detta di recupero
energetico, dove le due molecole identiche risultanti dal glucosio iniziale proseguono nella via metabolica.
Da notare che il valore di energia rilasciata da una molecola di glucosio durante la glicolisi è due volte quello
trovato come Totale sopra.
5.3.2.2. Alcuni approfondimenti
Abbiamo accennato nella tappa 7 ad una specie di stretta collaborazione fra reazioni, o meglio fra enzimi di
alcune reazioni. Si parlava di accoppiamento energetico e di intermedio comune, vedremo ora come quello
che risultava un accoppiamento energetico è dato da un più scientifico accoppiamento enzimatico e come
l’intermedio comune sia “indirizzato”, o meglio incanalato fra i siti attivi degli enzimi.
Esperimenti hanno dimostrato l’associazione di enzimi all’interno delle cellule, associazione data
dall’elevata concentrazione degli stessi. Vediamo come si presenterebbero gli enzimi in concentrazioni
differenti:
Figura 54 83
L’accoppiamento di enzimi in un processo come la glicolisi permette una maggior velocità e una maggior
efficacia della reazione: il prodotto di una prima reazione catalizzata viene incanalato nel sito attivo
dell’enzima catalizzante quella successiva per essere a sua volta trasformato direttamente, senza passare
attraverso il citosol 84 . Per avere un’idea più chiara di quanto appena spiegato utile può essere la seguente
immagine:
83
84
Vedi nota precedente, pag. 530.
Altro nome per citoplasma, che è il liquido intracellulare.
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Figura 55 85
Nella figura è illustrato proprio l’esempio delle tappe 6-7, dove la gliceraldeide 3-fosfato viene convertita in
1,3-bisfosfoglicerato. L’incanalamento dell’intermedio 1,3-bisfosfoglicerato in questa fase è provato
cineticamente da esperimenti fisici che dimostrano l’esistenza di un’associazione fra i due enzimi. Esistono
altre associazioni provate con incanalamento dell’intermedio come quella tra l’aldolasi e la
gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, con la gliceraldeide 3-fosfato come intermedio.
5.3.3. Destino del piruvato dopo la glicolisi
In condizioni aerobiche, il piruvato prodotto dalla glicolisi, come già accennato, viene ossidato ad acetato, e
in seguito a CO2 e H2O. Il NADH prodotto durante tutto il processo, per “scaricare” i suoi elettroni e
ossidarsi di nuovo a NAD+, cede i suoi elettroni all’ossigeno, che funge così da accettore terminale degli
elettroni. Riformatosi l’NAD+, la serie di reazioni continua. Nel caso della fermentazione, come ricorderete,
l’ambiente è privo di ossigeno, quindi questa via con l’ossigeno come accettore terminale degli elettroni è
impossibile. I batteri che vivevano grazie all’energia prodotta durante la glicolisi non potevano permettersi di
restare senza un agente accettore di elettroni, perché avrebbero così consumato tutto l’NADH, indispensabile
85
Immagine tratta da: DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di
lehninger, Zanichelli 2002, Terza edizione, pag. 531.
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per portare avanti la reazione. Il problema esigeva una soluzione. Lo stesso ruolo che ha l’ossigeno nel
proseguimento della glicolisi in condizioni aerobiche, viene adempito in condizioni anossiche dal piruvato. Il
prodotto della riossidazione dell’NADH da parte del piruvato è il lattato. Questa reazione è catalizzata
dall’enzima lattato deidrogenasi.
Figura 56 86
5.3.4. Scissione del lattosio per utilizzarlo nella glicolisi
Abbiamo visto che la glicolisi ha come punto di partenza il glucosio, e degli intermedi ben precisi che si
formano durante la reazione. Il latte, fra le varie componenti, contiene dello zucchero, il lattosio (cfr. cap. 4,
“Il Latte”). Nel punto 4 dello stesso capitolo abbiamo visto come una molecola di lattosio possa venir scissa
per dar una molecola di glucosio e una di galattosio. La molecola di glucosio risultante va subito ad
alimentare la via della glicolisi, fornendo in principio la base necessaria per la stessa reazione. La via seguita
dal galattosio per poter anche lui alimentare la reazione è invece diversa: entra nella reazione come glucosio
6-fosfato dopo una serie di reazioni (Figura 57).
86
Vedi nota precedente, pag. 532.
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Figura 57 87
Il D-galattosio derivato dall’idrolisi del lattosio viene fosforilato sul C-1, primo passaggio catalizzato
dall’enzima galattochinasi, dove il gruppo fosforico proviene chiaramente dall’ATP. Anche questa reazione
avviene in presenza dello ione magnesio. Prodotto della reazione è il galattosio 1-fosfato, che viene
trasformato in glucosio 1-fosfato. Questo passaggio avviene grazie all’UDP-glucosio. Oltre al
87
Vedi nota precedente, pag. 540.
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glucosio 1-fosfato si forma l’UDP-galattosio, il quale viene nuovamente trasformato in UDP-glucosio
dall’UDP-glucosio 4-epimerasi. Non vi è produzione netta o consumo di UDP-galattosio siccome viene
ritrasformato per essere riciclato e utilizzato in un altro giro delle stesse reazioni. Prima di entrare nella serie
di reazioni della glicolisi il galattosio 1-fosfato formatosi viene trasformato in glucosio 6-fosfato dall’enzima
fosfoglucomutasi.
5.4.
Microrganismi del latte
Il latte appena munto, fresco, non è mai un sistema sterile. Esso contiene infatti organismi di piccole
dimensioni, non visibili ad occhio nudo, variabili per numero e tipo: stiamo parlando di batteri, lieviti e
muffe: sono i microrganismi. Oltre a questi possono essere presenti anche dei virus. Nel processo di
caseificazione i microrganismi più importanti, dei quali parleremo più specificamente in seguito, sono i
batteri. Essi sono presenti quasi ovunque, sono pochissimi i posti dove non si possano trovare, si adattano e
sopravvivono in condizioni estreme. In tutti i processi della vita quotidiana svolgono un’attività
importantissima. Ci sono batteri nel nostro corpo, batteri che aiutano la digestione, ad esempio nel rumine
dei ruminanti, nell’intestino dei conigli, nel cieco dei cavalli, ci sono i batteri responsabili dei cicli
biogeochimici (N, P, K) che vivono nel suolo, ci sono batteri che operano nelle fermentazioni del formaggio,
del vino, di praticamente tutte le sostanze organiche. Si possono dividere i batteri tra utili e dannosi, o
patogeni. Nel latte i batteri sono già presenti alla mungitura, e a questi se ne possono aggiungere degli altri:
se la mungitura avviene in una stalla tradizionale, o in uno stand di mungitura all’aperto, senza che il latte
venga trasportato in caseificio tramite un lattodotto, il latte si arricchirà di batteri presenti nell’ambiente. Nei
caseifici alpestri un ruolo non irrilevante è l’effetto dei batteri del caseificio stesso, che possono influire
positivamente, o negativamente dapprima sul latte, e poi sul formaggio. Abbiamo già accennato in
precedenza ai batteri della fermentazione lattica, in effetti durante la caseificazione vengono aggiunte delle
colture batteriche al latte per acidificarlo, così da far formare la cagliata (coagulazione delle caseine), e così
che rimangano nel formaggio durante la stagionatura, dandogli un particolare gusto.
5.4.1. I batteri
I batteri sono organismi unicellulari, molto piccoli e semplici, hanno dimensioni che vanno dai 0,5 ai 3 μm 88 .
Le cellule di questi batteri sono dette procariote. Esse si distinguono principalmente da quelle eucariote per
dimensioni e per l’assenza di membrane nucleare, di reticolo endoplasmatico e di organelli. I batteri sono
dunque gli organismi viventi più semplici sulla terra, hanno come detto dimensioni molto piccole e un
volume pari circa a 10-12 mL (ossia un volume circa 10 000 volte minore di quello di una cellula eucariota).
Essendo costituite quasi per intero da acqua, la loro massa è circa 10-12 g. Questo tipo di cellule può
raddoppiare di numero, in condizioni ottimali, in 20 minuti, e si adatta quasi ovunque grazie al fatto che
accetta una gran varietà di nutrienti, tra i quali può scegliere inoltre quello che ritiene migliore. Sono protette
88
1 μm equivale a 10-6 metri.
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all’esterno da una parete rigida spessa circa 200 Å 89 formata da peptidoglicano (Figura 58), una complessa e
grande molecola formata da catene parallele polisaccaridiche, l’unità ricorrente è la muropeptide.
Figura 58 90
Figura 59 91
89
1 Å corrisponde a 10-10 metri.
90
Immagine tratta da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO,
Chimica delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 33.
91
Vedi nota precedente, pag. 34.
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Le catene sono legate tra loro da ponti peptidici diversi da un tipo di batterio ad un altro, e la rigidità è
dovuta al numero di legami incrociati. Il legame glicosidico 92 (Figura 59) può essere idrolizzato da vari
enzimi, il più comune è il lisozima, distruggendo così la parete e mettendo la cellula in uno stato chiamato
protoplasto. In condizioni di isotonicità la cellula può sopravvivere in questo stato e, se le condizioni sono
ottimali, riformare la parete. In condizioni, più comuni, di ipotonicità lo stato di protoplasto porterebbe alla
lisi cellulare. La parete impedisce, quindi, alla cellula di scoppiare quando si trova in ambienti ipotonici.
Immediatamente sotto si trova la membrana cellulare, spessa circa 70 Å, chiamata anche membrana
plasmatica. Queste due strutture hanno un ruolo molto importante nella vita della cellula: è infatti loro
compito regolare gli scambi con l’esterno, quali specie chimiche possono entrare, uscire, e con quale
velocità. All’interno si trova una zona nucleare (con del DNA) centro di controllo di tutte le operazioni
cellulari. Si trovano poi i ribosomi, sede della sintesi proteica e il citoplasma (fluido intracellulare che
riempie la cellula).
5.4.1.1. Nomenclatura e differenze morfologiche dei batteri
Il nome dei batteri è formato da due parole latinizzate. La prima parola con maiuscola si riferisce al genere, è
quindi il nome generico, il quale descrive la forma dell’organismo o si riferisce al nome di chi l’ha scoperto:
è spesso scritta solamente l’iniziale. La seconda parola è normalmente un aggettivo, che descrive la specie
con un carattere del batterio. Esistono poi delle varianti, con aggiunte di una parola per differenziare batteri
dello stesso genere. Quando ci si vuole riferire a tutto un intero genere di microrganismi senza specificarne
uno si fa seguire il nome generico dalla sigla sp. Per la corretta identificazione di un determinato batterio si
deve procedere ad un’analisi più accurata. In questo lavoro descriveremo solo le più comuni differenze
morfologiche. Queste differenze si osservano al microscopio, e consistono nelle dimensioni, forma,
disposizione (Figura 60). Di seguito nomenclatura e descrizione di forma e disposizione dei batteri: 93
1. Sferica: sono detti anche cocchi e suddivisi in:
-
Diplococchi: e le cellule formano prevalentemente delle coppie.
-
Streptococchi: se le cellule formano prevalentemente catene lineari.
-
Tetracocchi: se le cellule formano prevalentemente raggruppamenti di 4 cellule (tetradi).
-
Stafilococchi: se le cellule formano prevalentemente raggruppamenti o grappoli
irregolari.
-
Sarcine: se le cellule formano prevalentemente degli aggregati a struttura cubica.
2. Cilindrica: o bastoncellare. Sono detti bacilli. Anche in questo caso si possono talora distinguere
diplobacilli, streptobacilli … . Le dimensioni sono molto variabili.
92
Legame tra l’acido muramico e la glucosammina
Riportato da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica
delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 171.
93
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3. A spirale: sono morfologicamente molto differenziati. In particolare, batteri a forma spirale corta e
incompleta sono detti vibrioni (a virgola), batteri con due curvature sono detti spirilli, batteri con più
curvature sono detti spirochete.
Figura 60 94
5.4.2. Altre particolari caratteristiche
5.4.2.1. Gram-negativi e Gram-positivi
Un’altra caratteristica dei batteri è dovuta alla particolare composizione della parete di peptidoglicano.
Differenze di quantità e tipo di sostanze accessorie al peptidoglicano fanno sì che ci siano pareti di batteri
impermeabili o permeabili all’alcool, dalle quali esso può sottrarre i lipidi. I due tipi di batteri vengono
chiamati rispettivamente Gram-negativi e Gram-positivi (come i Lactobacilli). Il metodo utilizzato per
determinare l’appartenenza ad uno piuttosto che all’altro tipo di batterio (e di conseguenza tipo di parete) è
un semplice procedimento che vede impiegate una serie di soluzioni: in appendice troviamo una tabella
riassuntiva del procedimento corretto e dei cambiamenti cellulari (cfr. cap. 11.3 e cap. 11.4). Quali materiali
accessori i batteri Gram-positivi hanno acidi teicoici 95 e altri polisaccaridi (nella Figura 62 troviamo un
modello del rivestimento cellulare di un batterio Gram-positivo, con un grosso strato di peptidoglicano
esterno). I Gram-negativi invece hanno in aggiunta lipoproteine e lipopolisaccaridi complessi. In Figura 61
troviamo l’acido teicoico poliglicerolo di Lactobacillus sp.
94
Immagine tratta da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO,
Chimica delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 172.
95
Gli acidi teicoici sono dei poliesteri della glicerina o del ribitolo con aggiunta di acido fosforico.
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Figura 61 96
Figura 62 97
Nel caso dei batteri Gram-negativi, che possono avere una membrana esterna abbastanza complessa, l’azione
del lisozima 98 è ostacolata. Se un altro agente danneggia la membrana esterna, il lisozima può attacca la
parete: un batterio Gram-negativo senza lo strato di peptidoglicano intermedio assume la forma detta
sferoplasto.
96
Immagine tratta da: JEROME J. PERRY, JAMES T. STALEY, STEPHEN LORY, MICROBIOLOGIA 1
fisiologia, genetica, virologia, evoluzione e diversità, Zanichelli 2004, pag. 85.
97
Immagine tratta da: vedi sopra pag. 86.
98
Il lisozima è una β-glucosioamidasi che catalizza la lisi dei polisaccaridi, i quali costituiscono la parete
cellulare di numerosi batteri, esercitando così un’azione antibatterica. È un peptide basico a basso peso
molecolare (circa 18000) con condizioni ottimali di reazione a pH 8 e temperatura di 37°C. È relativamente
termostabile a pH 7, ma termolabile a pH alcalino. Nel latte bovino, il lisozima è presente in piccolissime
quantità e il suo contenuto varia in funzione della stagione (più elevato d’inverno che d’estate) e si trova nel
siero. (Tratto da CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995, pag. 111.
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5.4.2.2. Lo stato di endospora
Lo stato di endospora è una struttura che relativamente pochi batteri sono capaci di formare. Tenute presenti
le sue caratteristiche (qui di seguito) risulterà evidente l’importanza dell’igiene in caseificio. Due sono i
batteri principali capaci di formare questa struttura: il genere Clostridium, anaerobio o anaerobio facoltativo,
e il genere Bacillus, aerobio. Questa particolare struttura è attuata da alcuni di questi batteri in condizioni di
vita difficili, in caso di mancanza di nutrimento, o in condizioni di temperatura o pH estremi. Essa si trova
all’interno della cellula, ed è uno stato di quiescenza (forma di sopravvivenza metabolicamente inattiva). Si
potrebbe dire che si tratta di qualcosa di simile alla vita sospesa di un seme. L’endospora è molto resistente e
può sopravvivere per più di 100 anni. Le endospore sono particolarmente povere d’acqua, contengono alti
tenori di ioni calcio e sono ricche di un peculiare composto chiamato acido dipicolinico. Si pensa che siano
questi tre fattori i responsabili della straordinaria resistenza delle spore al calore (da temperature vicine allo
zero assoluto a 220 °C) e alle radiazioni.
La crescita dei batteri capaci di sporulazione ha due fasi, la prima vegetativa, crescita normale, e la seconda
di sporulazione vera e propria. Questo processo formante la spora è regolato da diversi meccanismi, è in
particolare dipendente dalla presenza di nutrienti e dalla densità batterica nell’ambiente. Casi questi in cui il
batterio dapprima reagisce con la liberazione di speciali enzimi extracellulari, i quali dovrebbero procurare
delle fonti secondarie di cibo. Il processo di sporulazione avviene in più tappe, e con particolari cambiamenti
morfologici. Dopo la duplicazione del proprio DNA e la separazione di una copia in una membrana, si forma
la prespora nel batterio che funge da sporangio (spora = seme, angio = contenitore, involucro). A questo
punto lo sporangio si scinde e rilascia l’endospora formatasi. Possiamo riassumere le fasi di sporulazione nel
modo seguente 99 :
•
il citoplasma e il materiale nucleare si concentrano in una zona preferenziale, la cui localizzazione
intracellulare dipende dalla particolare specie batterica;
•
la cellula si disidrata fino al valore minimo consentito per la sopravvivenza;
•
conseguentemente l’attività metabolica della cellula rallenta e il consumo di energia diminuisce;
•
contemporaneamente agli stadi descritti, intorno al materiale cellulare addensato si formano i
cosiddetti involucri o pareti sporali, che hanno funzione coibente, impermeabile e protettiva.
Nella figura seguente vengono illustrati gli stadi di sporulazione.
99
Tratto da ALBERTO TAGLIAFERRI, CELESTE GRANDE, Biotecnologie e chimica delle fermentazioni,
Zanichelli 2002, pag. 30.
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Figura 63 100
In casi particolarmente favorevoli, la spora può “germinare” e ritornare allo stato vegetativo normale,
ripassando cioè ad un metabolismo attivo dopo un periodo di quiescenza o criptobiosi 101 .
5.4.2.3. La riproduzione dei batteri
Esistono diversi tipi di riproduzione dei batteri, il più comune è la scissione binaria trasversale (o
schizogonia). In questo caso la cellula si divide in due, formando una parete trasversale. È un meccanismo
asessuato che però in alcune specie è preceduto da una coniugazione delle cellule. Altri batteri per riprodursi
producono molte spore, altri ancora generano lunghi filamenti che si frammentano in tante piccole nuove
cellule, ci sono poi quelli che si riproducono per gemmazione: dal peduncolo di una cellula si sviluppa una
escrescenza che dopo un certo tempo si separerà, originando un nuovo organismo 102 . Altra caratteristica dei
batteri è l’intensa attività cellulare, che li porta a riprodursi molto velocemente. Abbiamo già visto
nell’introduzione che in condizioni ottimali certi batteri possono riprodursi in 20 minuti: una singola cellula
in 10 ore può moltiplicarsi fino a raggiungere un miliardo di unità. La rapida moltiplicazione, l’alta
100
Immagine tratta da: JEROME J. PERRY, JAMES T. STALEY, STEPHEN LORY, MICROBIOLOGIA 1
fisiologia, genetica, virologia, evoluzione e diversità, Zanichelli 2004, pag. 437.
101
Lo stato di criptobiosi non è vita e non è nemmeno morte.
102
Tratto da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica delle
fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 179.
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resistenza a condizioni difficili sono fattori che devono rendere attento il casaro durante la produzione.
Infatti, durante tutto il processo di caseificazione c’è il rischio di sviluppo di ceppi patogeni per il
consumatore (ad esempio lo Streptococcus aureus). Si deve quindi cercare di creare delle condizioni il più
inadatte possibili alla loro sopravvivenza: per esempio la moltiplicazione della salmonella si arresta a pH
5,5 103 , raggiungendo questo valore in poco tempo potremmo essere quindi sicuri di avere un prodotto privo
di salmonella.
5.4.2.4. Batteri coinvolti nella fermentazione
I batteri importanti nella fermentazione lattica sono di due tipi, i bacilli (dal latino bacillus = bastoncino) e i
cocchi (micrococcus = granello). Essendo la fermentazione un processo anaerobio, anche i batteri implicati
sono anaerobi o anaerobi facoltativi. Come già visto la loro funzione è quella di trasformare il lattosio in
acido lattico, facendo così abbassare il pH. L’importanza della coltura batterica non è legata solamente alla
fermentazione, cioè all’abbassamento del pH, ma ha anche un compito di “occupazione del terreno”,
rendendolo inospitale per altri batteri indesiderati. Alcuni batteri producono delle sostanze inibenti i processi
vitali di altri batteri, ad esempio Streptococcus lactis produce una sostanza attiva contro Staphylococcus
aureus. Normalmente le culture sono formate da streptococchi e lattobacilli: gli streptococchi si sviluppano
rapidamente e creano poca acidità, i lattobacilli invece preferiscono un ambiente con pH più basso e si
moltiplicano più lentamente. Il lattosio catabolizzato dai due fermenti è circa 1/3 per gli Streptococchi e 2/3
per i Lattobacilli. La prossima tabella mostra le loro caratteristiche 104 .
Streptococcus lactis
Lactobacillus lactis
Riproduzione (min.)
15 – 20
35 – 45
Temperatura ottimale (°C)
28 – 30
42 – 45
6.0
5.1 – 5.3
maturazione, coagulazione
cottura, pressa
pH ottimale
Fase ottimale:
Tabella 2
5.4.2.4.1. Coltura batterica prodotta dal SICL
In Svizzera la Stazione di ricerca Agroscope Liebefeld-Posieux (ALP) produce e fornisce le colture
batteriche per la produzione di formaggio. In Ticino è ancora attivo il SICL, centro che riceve queste colture
dall’ALP e con queste prepara una coltura vegetativa che viene distribuita a tutti i produttori di formaggio.
Chiaramente non è un servizio gratuito e nemmeno “obbligatorio”, ogni produttore è libero di preparare la
propria coltura, da notare però che questo servizio è molto apprezzato e molto utilizzato. ALP produce
numerose colture, che, assemblate, permettono di elaborare la coltura mista poi utilizzata nella produzione.
103
Tratto da: L.PILLONEL, Manuale per la trasformazione del latte sulle alpi ticinesi, per conto di
Agroscope Liebefeld-Posieux, 2006, pag. 34.
104
Vedi nota precedente, pag. 43
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Alcuni grandi produttori ricevono le singole colture desiderate direttamente dall’ALP, e con queste
producono la propria coltura mista. Il SICL distribuisce in Ticino il suo preparato in diversi settori di
produzione casearia che spaziano dai singoli produttori, agli alpeggi, fino ad arrivare alla LATI. Il preparato
in questione è frutto di molti anni di prove e adattamenti. Già molti anni fa è iniziata una collaborazione fra il
SICL e alcuni casari; lavorando a contatto gli uni con gli altri sono riusciti a creare una coltura che si
adattasse bene alle condizioni della nostra regione e che desse un risultato sempre migliore, fino ad arrivare
alle produzioni del giorno d’oggi. Cercando di migliorare sempre più i difetti di cui il formaggio soffriva, si è
arrivati ad ottenere una coltura vegetativa che soddisfacesse produttori e consumatori. La coltura ancora oggi
utilizzata risale al 1998 ed è formata da tre principali colture fornite dall’ALP. Vediamo di seguito una breve
descrizione delle stesse tre 105 :
•
CM 401: lo scopo principale è di effettuare una rapida acidificazione iniziale (contiene circa l’80%
di streptococchi i quali sono responsabili dell’acidificazione);
•
CMB 291: è stata introdotta nel 1997 con lo scopo di migliorare la finezza della pasta grazie
all’effetto dei lattobacilli; questa finezza si nota comunque solo sui formaggi maturi o molto maturi;
•
CM 3008: Lactobacillus Casei, ha il potere di prevenire la formazione della sfoglia e favorire
l’occhiatura 106 , inibendo o perlomeno frenando le flore indesiderate come i germi estranei tolleranti
il sale.
Figura 64 107
Tutte le colture dell’ALP sono classificate e hanno una scheda di presentazione che si può trovare sul sito
della stessa Stazione di ricerca 108 . La coltura CM 401 è una coltura starter, mentre la CM 3008 è composta
da batteri eterofermentativi. Negli allegati riportiamo le schede delle singole colture sopra citate
(cfr. cap. 11.5).
105
Informazioni tratte da un documento dello stesso SICL.
Sfoglia e occhiatura sono termini che si riferiscono alla pasta del formaggio. Viene chiamata “occhiatura”
l’insieme dei piccoli o grandi “buchi” all’interno del formaggio. Si può pensare alla principale caratteristica
dell’Emmental, il quale ha grandi “buchi” al suo interno (l’occhiatura, appunto). Con questa coltura si vuole
invece prevenire la formazione di una pasta che assuma una “stratificazione, come fosse una sfoglia
(cfr. Figura 64).
107
L.PILLONEL, Manuale per la trasformazione del latte sulle alpi ticinesi, per conto di Agroscope
Liebefeld-Posieux, 2006, pag. 67.
108
http://www.db-alp.admin.ch .
106
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5.4.2.5. Altri batteri
Altri batteri che si possono trovare nel latte e nei suoi derivati sono per esempio Eschierichia coli, il quale si
nutre pure di lattosio e produce acido acetico, acido formico, acido lattico, diossido di carbonio (CO2) e
idrogeno. È responsabile del gonfiore del formaggio durante le prime ore. È pure responsabile di disturbi
intestinali nell’uomo e di mastiti nelle mucche.
Batterio anche molto conosciuto in Ticino è lo Staphylococcus aureus, il quale negli anni passati ha avuto
una presenza elevata. Pure lo S. aureus è responsabile di disturbi nel tratto intestinale dell’uomo. Si sviluppa
a temperature tra i 15 e i 45 °C ed ha come temperatura ottimale 35 - 37 °C, ideale per svilupparsi in un
caseificio. La sua patogenesi è la produzione di tossine denominate enterotossine perché attive a livello
dell’intestino umano. Sperimentalmente è stato dimostrato che la secrezione di queste tossine avviene
quando raggiunge la concentrazione di 100 000 – 500 000 cellule / mL di latte. È quindi molto importante
limitarne la riproduzione prima che raggiunga questo livello. Infatti la riproduzione e la secrezione si
arrestano a pH compreso tra 5 e 5.5: è quindi molto importante raggiungere un pH ≈ 5.0 il più velocemente
possibile. Alcune regole per combattere lo S. aureus sono riportate qui di seguito 109 .
•
Un bestiame sano, prova di Schalm (controllo delle cellule 110 )
•
Igiene personale, della mungitura, della raccolta e della conservazione del latte
•
Raffreddamento immediato del latte (minimo sotto 15 °C, idealmente sotto 10 °C)
•
Acidificazione rapida all’inizio della fabbricazione
(In aggiunta c’è la termizzazione del latte per i formaggi freschi).
5.4.2.6. Altri abitanti del latte: i batteriofagi
I batteriofagi sono i virus dei batteri. Essi sono 100 volte più piccoli e si riproducono all’interno della cellula,
provocandone la morte. Sono organismi “inanimati”, poiché non hanno un metabolismo proprio e al loro
interno contengono le proprie informazioni genetiche. Causando la morte delle cellule batteriche, rallentano
tutto il processo di acidificazione, aumentando il pericolo di contaminazione di altri batteri nocivi, quali S.
aureus. Attraverso una semplice analisi si può determinare se il latte è contaminato o meno. Riportiamo in
appendice procedura e interpretazione dell’analisi e dei suoi risultati (cfr. cap. 10.2).
109
Tratto da: L.PILLONEL, Manuale per la trasformazione del latte sulle alpi ticinesi, per conto di
Agroscope Liebefeld-Posieux, 2006, pag. 36.
110
Ndr.
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6. L’arte del casaro
In questo capitolo presenteremo il processo completo della caseificazione. Fino ad ora abbiamo visto alcuni
aspetti inerenti la produzione del formaggio. Sarebbe forse più corretto dire che gli aspetti visti fino ad ora
stanno alla base della caseificazione. Ci siamo soffermati in particolar modo sulle proteine e gli enzimi, sulla
fermentazione e sui microrganismi. Sono questi in effetti i principali attori che subentrano in tutto il processo
di caseificazione.
Il formaggio ha un’origine antichissima, e sicuramente molto precedente allo studio approfondito dal punto
di vista biologico-chimico-fisico di tutte le sue tappe intermedie. Non si hanno informazioni certe riguardo al
suo sviluppo, ciò che si sa è a quando risale il primo processo di fermentazione, che come visto nel capitolo
dedicato alla stessa abbiamo detto risalire all’incirca al 5000 a.C. (ci si riferisce in questo caso alla
fermentazione alcolica). La fermentazione lattica è un fenomeno che è stato osservato per primo da delle
popolazioni nomadi che trasportavano il latte in sacche fatte con l’intestino dei vitelli. Fu così che si
osservarono i primi effetti della fermentazione lattica. Di particolare importanza però è la presenza di un
preciso enzima, la chimosina, anche conosciuta col nome di rennina, presente appunto nel quarto stomaco
del vitello (l’abomaso). Nel corso dei secoli e dei millenni questo processo si è evoluto, ed è stato migliorato
pian piano, procedendo per tentativi. Il vantaggio di questo processo, con alla base la coagulazione, sta nella
conservabilità del prodotto. Infatti tutti sappiamo che il latte fresco non si può conservare a lungo, mentre
come ben sanno i buoni intenditori di formaggio, in una cantina adatta una forma di formaggio può
conservarsi in buono stato per parecchi anni. Questo risultato è oggi possibile grazie al processo evolutivo
che ha avuto la lavorazione dapprima del latte, e poi del formaggio quale prodotto finito (penso alla cura in
cantina, …). Parte fondamentale di questo processo che ci permette oggi di mangiare e degustare prodotti di
alta qualità (mi riferisco in particolare ai formaggi svizzeri, ticinesi, e tutti quelli che non sono soggetti a
norme troppo severe che ne rovinano le caratteristiche e il gusto) è stato fatto a partire all’incirca dalla
seconda metà dell’Ottocento, con Louis Pasteur, il quale dimostrò che la fermentazione era dovuta all’azione
di microrganismi. Lo studio sempre più approfondito ha permesso di migliorare sempre maggiormente i
prodotti, andando ad influire con piccole modifiche su una determinata caratteristica. È questo per esempio il
caso delle colture batteriche, costituite da ceppi diversi di batteri, i quali hanno determinati compiti: chi
indirizzato verso il gusto, chi verso la consistenza, chi verso la struttura,… .
Non esiste una ricetta unica per produrre formaggio, infatti ne esistono a centinaia, anzi a migliaia, ognuna
diversa dall’altra. Di seguito mi impegnerò a riportare quella che può essere considerata come la ricetta
“standard” del formaggio d’alpe ticinese.
6.1.
Il formaggio
Il formaggio è costituito, chiaramente, dagli elementi che si possono riscontrare nel latte anche se in
concentrazioni diverse per numerose componenti quali: l’acqua, il calcio, i fosfati, le vitamine, gli zuccheri e,
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principalmente, i grassi e le proteine. Durante la produzione del formaggio si influisce infatti direttamente
sulle proteine, “spaccando” la k-caseina in due frazioni distinte. La prima rimarrà nel siero mentre la seconda
andrà a costituire il formaggio. Il formaggio è l’insieme di più componenti del latte che durante il processo di
fabbricazione si separano in una fase densa e solida detta cagliata. Nel latte si aggiungono dei fermenti
(batteri) che attuano la fermentazione, processo trattato nel capitolo 5. La loro attività abbassa il pH e
favorisce l’azione di un enzima, la chimosina, o rennina, di cui sopra si è già accennato. È questo particolare
enzima che lavora sulla k-caseina denaturandola, ovvero separandola in due frazioni. Una volta formatasi la
cagliata essa viene lavorata con un procedimento ben preciso, opera di cui si prende cura il casaro, per
formare la pasta del formaggio. Essa viene estratta, messa all’interno di forme e pressata. Segue nei giorni
successivi la salatura in salamoia e la cura in cantina che, a dipendenza del formaggio e del lavoro del casaro
nel periodo successivo, varia dalle 2-3 settimane fino a diversi mesi. Tratteremo di seguito le singole fasi più
dettagliatamente.
6.1.1. Stoccaggio del latte
Sugli alpeggi ticinesi generalmente si caseifica una volta al giorno, o una volta ogni due giorni.
Considerando che la mungitura avviene due volte al giorno, mattina e sera, è chiaro che il latte necessita una
conservazione adeguata. L’ideale sarebbe riuscire a raffreddare il latte della sera attorno ai 10°C. Il metodo
più semplice per raffreddarlo (sugli alpeggi) considerato che spesso l’elettricità non è disponibile come lo è
in città, è quello di far passare il latte attraverso un sistema di raffreddamento (termoscambiatore). Il latte
viene prima filtrato (Figura 66) e poi fatto defluire in una struttura in metallo (Figura 65) a contatto con
l’acqua (Figura 67). Lo scambio di calore raffredda il latte, che da una temperatura attorno ai 32°C, viene
portato ad una temperatura di circa 1°C superiore a quella dell’acqua di raffreddamento. Il latte raffreddato
viene in seguito immagazzinato in vasche o contenitori appositi.
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Figura 66
Figura 65
Figura 67
6.1.2. Maturazione del latte
I batteri che si aggiungono al latte necessitano di un periodo di ambientazione, nel quale si riproducono, che
varia tra 45 minuti e 1 ora. L’aggiunta della coltura batterica può in alcuni casi, se ad esempio il latte è
raffreddato ad una temperatura inferiore ai 10°C, essere aggiunta già la sera, così da avere un “terreno”
favorevole già alla mattina. Normalmente la coltura è aggiunta di mattina al latte appena munto, il quale è ad
una temperatura di ca. 32°C, ideale per la riproduzione batterica. Il quantitativo di coltura da aggiungere
varia a dipendenza del quantitativo di latte che arriverà in caldaia; le proporzioni consigliate sono 20 – 30
mL di coltura ogni 100 L di latte. I batteri, chiaramente, per moltiplicarsi necessitano di un ambiente dal
quale ricavare tutto il nutrimento necessario. Oltre al semplice nutrimento i batteri lattici in particolare,
necessitano di molte altre sostanze aggiuntive, quali minerali, vitamine, acidi nucleici, … Essendo il latte alla
temperatura ottimale di 32°C, viene lasciato riposare per circa 1 ora mentre in caldaia si scalda il latte della
sera aggiunto al resto del latte munto la mattina.
6.1.3. Coagulazione
Dopo aver lasciato il tempo necessario per la moltiplicazione ai batteri, viene aggiunto il caglio, con un
rapporto che varia da 13 a 17 mL di caglio ogni 100 L di latte. Il caglio è un preparato enzimatico a base di
chimosina: ne esistono numerosi tipi differenti. Tipi diversi possono essere il caglio liquido e quello in
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polvere. Un’altra differenza consiste nella forza del preparato; il più comunemente usato è quello liquido di
forza 1:9000 111 .
Per la preparazioni di questi tipi di caglio, l’enzima attivo viene estratto dai vitelli, come pure dai capretti o
dagli agnelli. Nel corso degli anni, con l’aumento della produzione lattiera, e la maggior quantità di latte
destinata ad essere trasformata in formaggio, si è constata una carenza di vitelli dai quali estrarre l’enzima.
Dapprima si è tentato di utilizzare altri enzimi, quali proteasi fungine e pepsina suina, i quali si rivelarono
però troppo attivi, provocando un’eccessiva idrolisi delle altre proteine. Per risolvere questa situazione,
dunque, si è in seguito fatto ricorso all’ingegneria genetica. Individuando le sequenze esatte di DNA che
codificano la produzione della rennina, e inserendole nel patrimonio genetico di altri microrganismi, si è
riusciti a trovare una soluzione. I microrganismi in questione, il lievito Kluyeromyces lactis, il fungo
Aspergillus niger e il batterio Escherichia coli, possono essere indotti a produrre grandi quantità di enzima
identico in tutto e per tutto a quello del vitello 112 . (Questi enzimi ottenuti da microrganismi modificati
geneticamente sono però vietati in Svizzera. I produttori di formaggio tengono particolarmente all’immagine
di genuinità dei loro prodotti.)
Il caglio è “il responsabile” della formazione del formaggio. In effetti è proprio questo preparato che agisce
in modo da far formare la fase solida - detta cagliata - all’interno del latte. La chimosina (alla base del caglio)
agisce sul legame 105 – 106 della k-caseina, tra gli amminoacidi Phe – Met (fenilalanina e metionina),
spezzandolo, denaturando la proteina. Nella seguente immagine è proposta una rappresentazione della
chimosina:
Figura 68 113
111
Una forza di 1:9000 vuol dire che 1 parte (mL o g) di caglio coagula 9000 parti (mL o g) di latte
(definizione secondo l’unità Soxhlet SU).
112
Informazioni tratte da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag 132.
113
Immagine tratta da: http://160.114.99.91/astrojan/protein/pictures/rennin3.jpg il 12.01.2007 il 12.01.2007.
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Nel capitolo dedicato alle proteine (capitolo 4.2.4) abbiamo visto la struttura (le aggregazioni) che le caseine
assumono. Parliamo in questo caso delle caseine perché sono proprio queste che costituiscono il formaggio
(chiaramente non è costituito esclusivamente da questa componente del latte, ma è la parte caratterizzante).
Come visto, le caseine si aggregano in strutture submicellari e micellari, con le estremitâ idrofile all’esterno
e quelle idrofobe all’interno. Queste proteine hanno verso l’estremità N un numero maggiore di amminoacidi
polari, che ne garantiscono il carattere idrofilo. La k-caseina, invece, la principale protagonista della
coagulazione, ha un trisaccaride legato alla treonina (133) verso l’estremità C che garantisce il carattere
idrofilo. Altra differenza fra la k-caseine e le altre caseine sta nella presenza (in queste ultime) di fosfoserina,
capace di legare ioni calcio (Ca2+) che permette le associazioni fra le micelle caseiniche. Le micelle si legano
fra di loro grazie ad un particolare composto chiamato “fosfato di calcio colloidale”, la cui la formula è
Ca9(PO4)6, il quale a sua volta è legato agli ioni calcio legati alla fosfoserina. Risulta quindi evidente che la
k-caseina non può intervenire a formare legami con altre caseine, perciò le micelle con grandi quantità di kcaseina tenderanno a situarsi alle estremità di un’aggregazione di micelle caseiniche. Nella seguente
immagine presento uno schema delle aggregazioni micellari e dei legami fra micelle.
Figura 69 114
In alto a sinistra i puntini neri sono le molecole di k-caseina.
Dopo aver visto la disposizione delle caseine nel latte vorrei passare all’attacco dell’enzima e al risultato
ottenuto.
Come già detto la chimosina agisce su un particolare legame della k-caseina, separandola in due frazioni, la
prima, chiamata k-paracaseina, resta attaccata alla micella (è la parte idrofoba), la seconda invece, chiamata
glicomacropeptide della k-caseina, legata al trisaccaride di cui sopra accennato, si stacca e resta nel latte, o
114
Immagine tratta da: http://www.landfood.ubc.ca/courses/fnh/301/protein/protq3.htm il 12.01.2007.
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meglio nel siero dopo l’estrazione del formaggio (è la parte idrofila). Nella prossima figura ecco uno schema
della reazione:
Figura 70 115
Il
trisaccaride
legato
verso
l’estremità
C
della
k-caseina
è
chiamato
α-N-acetilneuraminil-(2→6)-α-galattosil-(1→6)-N-acetilgalattosammina, ne vediamo la formula di struttura
nella seguente immagine:
Figura 71 116
La denaturazione di questa proteina, con la formazione delle due parti proteiche (para k-caseina e
glicomacropeptide), porta alla formazione di una parte solida nel latte. Questa parte solida chiamata cagliata
non è costituita solo dalle micelle caseiniche prive della parte glicopeptidica della k-caseina, bensì anche da
115
Immagine tratta da:
http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.fst.rdg.ac.uk/courses/fs560/topic1/t1g/t1g.htm il
12.01.2007.
116
Immagine tratta da: TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004, pag. 128.
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altre componenti presenti nel latte, quali i grassi, il lattosio, e altro. Resta comunque attribuita a questa
denaturazione la formazione della parte solida che sarà in seguito lavorata ed estratta, il formaggio.
6.1.4. Taglio della cagliata
Dopo aver testato la consistenza della cagliata e aver deciso che la cagliata è pronta, si può effettuare il taglio
della cagliata, che servirà a formare la grana. Si inizia col rivoltarla piano con una “spannarola” (Figura 72).
Figura 72
Figura 73
Si procede poi con la lira (Figura 73). Il taglio della cagliata con la lira è forse la parte più delicata di tutto il
processo. Procedendo delicatamente e in modo regolare, si deve cercare di formare una massa omogenea di
grandezza pari a dei “chicchi di mais”, cercando di renderli tutti della medesima grandezza, né troppo fini, né
troppo grossi: sarà questo che determinerà in parte la consistenza della pasta. L’unico modo per imparare a
svolgere bene questa operazione è quello di osservare qualcuno di esperto, e magari di provare sotto la sua
guida. L’operazione di taglio della cagliata consente ai grani di spurgare il contenuto di siero. Vediamo
nell’illustrazione seguente un metodo di taglio della cagliata (taglio in croce) 117 :
117
L.PILLONEL, Manuale per la trasformazione del latte sulle alpi ticinesi, per conto di Agroscope
Liebefeld-Posieux, 2006, pag. 52.
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6.1.5. Riposo della grana
Per consentire ai grani di spurgare al meglio il siero si lascia riposare la cagliata per 5-10 minuti senza
riscaldare. La massa va continuamente tenuta in movimento. Il tempo di riposo può chiaramente variare ogni
volta; si deve attendere finché la grana è sufficientemente asciutta.
Come procedere per determinare lo stato della grana: inserendo una mano nella caldaia, e trattenendo un
po’di grani sul palmo, rivoltare la mano verso il basso. La grana sarà pronta per essere riscaldata quando i
grani rimarranno appesi al palmo della mano.
6.1.6. Riscaldamento della grana
L’operazione seguente è quella di riscaldamento della grana. Si deve portare il contenuto della caldaia ad una
temperatura che varia dai 44°C ai 48°C (si parla di formaggio a pasta dura o semi-dura). La temperatura da
raggiungere dipende dalle abitudine del casaro e in particolare dalle condizioni climatiche. Normalmente si
tende a raggiungere una temperatura più alta verso la fine della stagione alpestre, quando cioè il tempo
comincia ad essere più autunnale. In vecchi caseifici aperti, si attua lo stesso principio in giornate
particolarmente fredde o piovose, anche se ci si trova in piena stagione (giugno-luglio). Ciò a cui bisogna
prestare particolare attenzione durante il riscaldamento è a non far formare una specie di “pellicina” sui
singoli grani provocata da un eccessivo riscaldamento iniziale. L’ideale anche qui è procedere lentamente e
per gradi: scaldando pian piano all’inizio e accelerando in seguito 118 . La massa riscaldata deve essere
continuamente tenuta in agitazione. Questa operazione è svolta, al giorno d’oggi, da un semplice motorino
elettrico (Figura 74), mentre una volta era svolta esclusivamente a mano con l’ausilio di un “trüscghin”
(Figura 75).
118
Consiglio: raggiungere il primo grado (°C) in cinque minuti, il secondo in 2 minuti e 30 secondi e così
via. Si deve cercare di avere un riscaldamento lento all’inizio e graduale in seguito. Un repentino aumento
non giova al prodotto.
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Figura 74
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Figura 75
6.1.7. Spinatura fuori fuoco
Una volta raggiunta la temperatura desiderata togliere la caldaia dal fuoco. Anche qui bisogna lasciar
riposare la cagliata mantenendola sempre in movimento. Questa operazione richiede di solito circa 5-10
minuti.
Le operazioni da fare sono due: (1) prendere un po’di grana e pressarla con la mano. Dando un colpo di
polso, tenendo fra le dita la grana pressata, essa dovrebbe spezzarsi di netto. Provare a smuovere la grana
pressata, sempre sul palmo della mano, con un gesto rotatorio dell’altra mano: è pronta per l’estrazione se si
disfa bene. (2) Altra prova da fare consiste nel masticare un po’di grana pressata, è pronta quando scricchiola
sotto i denti come fosse “sagex” (nome comune del polistirolo espanso).
6.1.8. Estrazione e messa in forme
Una volta determinato che la grana sia pronta per l’estrazione, smettere di rimestare (eventualmente togliere
il rimestatore elettrico) e lasciar depositare la massa sul fondo. I modi di estrazione variano a dipendenza
delle abitudine e delle attrezzature. Nei caseifici più moderni viene estratta tutta la massa con una grossa tela
attaccata ad un braccio meccanico. In caseifici più piccoli si estrae parte della massa in una tela che viene poi
messa in forme apposite, circa 7,5 – 8 cm di altezza e di un diametro di circa 30 cm. La grandezza delle
forme è a discrezione del casaro o dell’aiuto casaro.
6.1.9. Pressatura
Dopo l’estrazione e la messa in forme le stesse vengono strette con l’apposito sistema di “fasciere”
(Figura 76). Viene poi posto un asse di legno con dei pesi sopra (il quantitativo dipende dalle diverse
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attrezzature). Le forme tenute al caldo vengono ricoperte con delle coperte 119 . Girare le forme dopo 20
minuti e lasciarle così per circa 4 ore, a questo punto
rigirarle sostituendo la tela (bagnata) con una nuova
asciutta. Dopo circa altre 4 ore rivoltarle nuovamente,
questa volta togliendo le singole tele e mettendone una
più grande che sia a contatto con la pasta sopra e sotto.
Caricare più peso delle precedenti volte. Dopo 24 ore
dall’estrazione togliere dalla pressa e sistemare in un
luogo a circa 12°C e con 80% di umidità relativa.
Figura 76
6.1.10.
Messa in salamoia
Dopo 48 ore dall’estrazione sistemare le forme di formaggio in salamoia. La salamoia è una soluzione
acquosa salata, il tenore di sale può anche in questo caso variare secondo le ricette, si consiglia un tasso di
circa 10 – 15 %. Lasciar anche qui riposare per 24 ore.
6.1.11.
Stagionatura
È questa forse la parte che richiede più impegno e costanza. Le varie ricette, a volte dettate dalla disponibilità
di tempo, sono numerose. Si consiglia di spazzolare con acqua salata per i primi 15-20 giorni, rivoltando le
forme con la parte bagnata verso l’alto. Il legno consigliato per le tavole sulle quali appoggiare il formaggio
è l’abete rosso. Continuare a girare e spazzolare con acqua salata per i successivi 15-20 giorni una volta ogni
due giorni. Fare attenzione a non bagnare troppo la crosta, se risulta essere troppo umida, quasi
appiccicaticcia, asciugare con uno straccio. Successivamente, anche qui per i 15-20 giorni seguenti,
continuare a spazzolare con acqua salata le forme ogni 3 giorni. Ricordarsi sempre di non bagnare troppo, è
quasi d’obbligo asciugare con uno straccio. Si può aggiungere all’acqua salata un po’di mosto (succo di
mele), questo conferirà col tempo un bel colore rossiccio alla crosta. Dopo 2 mesi in cantina, si ricorda che
l’ideale è una temperatura attorno ai 12°C con un’umidità relativa di circa 80%, il formaggio è pronto per
essere consumato e gustato. Per gli amanti dei formaggi forti si consiglia di protrarre la stagionatura ancora
per qualche mese. Dopo i primi due mesi di cura del formaggio, lo si può lasciare stagionare semplicemente
ricordandosi di girarlo ogni tanto (quando fa eccessivamente fatica a staccarsi dalla tavola). Se la tavola
dovesse risultare troppo bagnata, bisogna sostituirla. Un’alternativa è sistemare il formaggio in sacchi di
nylon (quelli delle patate per esempio) e appenderlo in cantina. Così facendo prenderà sufficiente aria da
entrambe le facce, evitando di doverlo voltare periodicamente.
119
Consiglio: ricoprire prima con una tela di plastica, applicare poi sopra ad essa una coperta tipo militare.
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7. Produzioni industriali
Fino ad ora ho descritto la produzione di formaggio focalizzandomi sui tipi di produzione artigianale: ho
infatti descritto il processo di caseificazione di un formaggio d’alpe, e quasi tutte le informazioni e accenni
alla produzione che ho fatto sono frutto della mia esperienza personale in questo ambito, esclusivamente
artigianale. Questo tipo di formaggio, anche se sempre presente, è il meno rilevante su scala globale. Sempre
più i piccoli caseifici artigianali vanno scomparendo per lasciar spazio a quelli più grandi: essi comprano il
latte dai vari contadini per dar vita ad un prodotto abbastanza diverso, il quale si può certamente definire di
altro genere e ancor più certamente con caratteristiche molto diverse. Queste sono ad esempio:
•
la quantità di prodotto, che spazia su una scala molto diversa da quella proponibile dai singoli
contadini o alpigiani;
•
lo standard dello stesso, inteso sia come rigidità e controlli nei procedimenti, sia come finalità da
raggiungere;
•
l’omogeneità del prodotto che da essa ne deriva. Quali prodotti di questo tipo possiamo per esempio
pensare al Tilsitter, all’Appenzeller, all’Emmental, al Gruyère (tutti formaggi svizzeri) o anche al
Grana Padano (formaggio italiano).
La finalità di queste grandi produzioni è certamente il massimo rendimento, mantenendo sempre chiaramente
un prodotto di qualità. Relativamente diversa è invece la situazione dei piccoli produttori, i quali mirano
certamente ad una qualità 120 differente. Queste grandi produzioni sono per lo più meccanizzate, sono
soggette a controlli e norme severe, e sottostanno molto spesso a parametri dettati da vari certificati di valore
nazionale e internazionale, quali ad esempio la certificazione ISO 9001. Anche se l’obiettivo del lavoro non
è quello di trattare in dettaglio i processi industriali di fermentazione e produzione, ritengo utile e
interessante dare un’idea delle principali caratteristiche, somiglianze e soprattutto differenze rispetto alla
produzione su scala ridotta..
7.1.
LATI
Per farmi un’idea del funzionamento e delle principali differenze presenti in una struttura dedita alla
produzione su vasta scala, ho pensato di rivolgermi alla LATI, azienda ticinese attiva nel settore.
Originariamente il progetto era quello di fare una visita completa mentre era in atto il processo produttivo,
cosa però che per varie ragioni non è stata possibile. Sono comunque riuscito ad ottenere informazioni
dapprima parlando con la responsabile del controllo qualità Sig.ra Margherita Marchesi, e in seguito avendo
ricevuto dei documenti riguardanti procedimenti e controlli svolti nella loro sede.
120
La qualità alla quale puntano i piccoli produttori non si basa sulle caratteristiche tecniche o parametri
misurabili, ma esclusivamente sul verdetto del palato. Tengo a precisare che si sta parlando di palati capaci
di apprezzare un prodotto artigianale, il quale avrà un carattere più marcato, che potrebbe magari irritare chi
è da troppo tempo abituato a consumare prodotti molto diffusi e sempre più unidirezionali.
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7.1.1. Prodotti e controlli
La LATI non da vita ad un solo prodotto, bensì a diversi. Ci sono per esempio i formaggi freschi a pasta
molle, le formagelle, e altri. Tutte le procedure sono registrare in manuali di controllo, con norme igieniche,
tempi di lavorazione precisi, controlli regolari di vari parametri, … Come parametri di controllo troviamo ad
esempio il tenore delle varie componenti del latte, quali proteine, lattosio, grasso, …, per i quali ci sono
chiaramente valori ottimali e valori limite entro i quali è obbligatorio restare. Altri parametri misurati sono il
pH, o per l’ambito microbiologico la quantità di alcuni batteri e germi, anch’essi con valori limite, presenti
nel latte. Tutti questi controlli sono svolti regolarmente; questo permette di fornire un prodotto omogeneo e
controllato, dando così al consumatore una garanzia di affidabilità.
7.2.
Confronto con una produzione di tipo artigianale
Abbiamo già trovato fin qui diverse differenze fra una produzione artigianale, maggiormente descritta, e una
di tipo industriale come quella della LATI. Credo che alcune cifre possano esser significative per far capire
da dove provengono tutte le differenze di cui abbiamo parlato. I litri di latte che la LATI lavora ogni giorno
sono all’incirca 50 000. Nell’azienda sulla quale ho trascorso le mie ultime estati i litri giornalieri di latte in
caldaia erano inferiori ai 200, nel periodo tra la fine di giugno e l’inizio di luglio si aggiravano attorno ai
160-180. Nei caseifici d’alpe il quantitativo è di norma maggiore, ciò vuol dire qualche centinaio di litri,
possono essere 300 o 400, come anche il doppio, fino a raggiungere l’ordine delle migliaia di litri in alcuni
grossi alpeggi con caldaie da 4000 litri (alpe Piora, in Leventina, caricato con ca. 260 vacche) o più litri di
capacità (Caseificio del Gottardo di Airolo 4600 litri). Anche prendendo in esame questi pochi casi di caldaie
così capienti, vediamo che questo tipo di produzione non ha assolutamente niente a che fare con una
produzione basata su una quantità di materia prima almeno 100 volte maggiore.
Il latte utilizzato, proveniente dai vari contadini, è sottoposto a numerosi controlli, alcuni di essi effettuati
giornalmente, altri invece periodicamente ogni settimana o ogni mese. Questi sono ad esempio analisi di
contenuto, di contaminazione, del punto di congelamento, … Questo ultimo valore permette di determinare
se al latte è stata aggiunta dell’acqua.
7.2.1. Conclusioni
Dopo aver visto, anche se non in dettaglio, i diversi principi coi quali i due produttori, l’uno industriale e
l’altro artigianale operano, e tenendo presente le cifre riportate sopra risulta chiaro che una produzione
industriale non potrà mai basarsi su delle abitudini, come quelle che ha il casaro d’alpe, o sulla “stima”. Una
vasta produzione necessita invece di processi chiari e precisi e l’unico modo per gestire tutto ciò è
automatizzare le varie parti del processo, e naturalmente controllarne l’efficienza. Abbiamo qui preso in
esame la LATI, coi suoi 50 000 litri giornalieri, dobbiamo però considerare che pur essendo enormemente
più grande di un qualsiasi altro singolo produttore, resta pur sempre più piccola di molte altre aziende, sia
svizzere sia europee e statunitensi.
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8. Parte sperimentale
Per rendere più completo il mio lavoro ho pensato di realizzare anche una piccola parte sperimentale.
Durante il lavoro ho avuto modo di pormi molti interrogativi su dettagli del processo di caseificazione, ho
scoperto molte cose a cui non sono riuscito a dare una risposta. Essendo il latte un sistema costituito da molte
componenti, alcune delle quali vive, come i batteri, e essendo fortemente influenzato dalle condizioni
esterne, risulta molto difficile studiare precisamente tutto ciò che accade al suo interno. In accordo con i
mezzi a nostra disposizione, abbiamo deciso di registrare l’andamento del pH, e della relativa temperatura
durante la caseificazione. Questi dati si riferiscono a quella che è l’attività dei batteri; infatti anche se non
completamente, l’andamento del pH è per la maggior parte dovuto all’attività dei batteri che come abbiamo
gia visto consiste nel “sopravvivere”, fine che gli stessi raggiungono tramite il processo di fermentazione. Il
prodotto di questa fermentazione è l’acido lattico (Figura 77) prodotto dalla glicolisi, ad esso è dovuto
l’innalzamento dell’acidità (abbassamento del pH).
Figura 77 121
8.1.
Introduzione
L’estate 2006, l’ho trascorsa sullo stesso pre-alpe degli anni precedenti. Ho pensato che non potesse esserci
occasione migliore per ricavare dei dati sulla fermentazione. Di solito si parla di dati sperimentali, in questo
caso però, i dati ricavati risultano provenire non da un esperimento fine a sé stesso, ma da un processo
produttivo reale. Cercando di non infastidire chi lavorava in caseificio, ho raccolto i dati inerenti il pH e la
relativa temperatura. Trovandosi in un ambiente molto differente da quello di un laboratorio, e anche molto
diverso da quello che può essere un caseificio industriale moderno, i dati sono sicuramente stati influenzati
dalle condizioni esterne. Queste possono essere ad esempio la temperatura, l’intrusione di qualche batterio
indesiderato, o anche semplicemente un pezzetto di cenere proveniente dal fuoco vivo. Per giudicarne
l’attendibilità abbiamo provveduto con la ripetizione dello stesso “esperimento” in laboratorio presso i
laboratori del Liceo Cantonale di Locarno. Ricordo che i dati non pretendono la precisione di quelli che si
potrebbero ottenere in un laboratorio specializzato, tuttavia credo si possano ritenere attendibili, e
sicuramente indicativi.
121
Immagine tratta da: http://www.chemtek.it/newsletter/applicazioni/111.htm il 17.01.2007.
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8.2.
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Esperimenti sul campo
Come già detto i dati sono stati registrati in un caseificio “artigianale”, definendolo un po’nostalgicamente
potremmo dire: “come quelli di una volta”. Ho dovuto sistemare al meglio le apparecchiature cercando di
non occupare troppo spazio, di arrecare il minor fastidio possibile a chi doveva lavorare, di non danneggiare
le apparecchiature e di sistemare le sonde in modo da ottenere dati attendibili e non compromessi da fattori
esterni. Le apparecchiature usate sono state le seguenti:
-
Sonda Pasco per il pH PS-2102
-
Sonda Pasco per la temperatura PS-2125
-
2 registratori Pasco Xplorer, per registrare i dati rilevati dalle sonde PS-2000
8.2.1. Andamento del pH dall’aggiunta della coltura
Ho realizzato più registrazioni e di tipo differente. Principalmente, ciò che si voleva dimostrare coi dati
ottenuti, era il graduale abbassamento del pH dovuto all’attività batterica. Come descritto nel capitolo
dedicato al formaggio (cap. 6.1.2.), spesso si aggiunge la mattina, al primo latte munto, la coltura batterica
guadagnando tempo. Così mentre si finisce la mungitura e si porta il latte alla temperatura di 32°C per
aggiungerci il caglio, i batteri cominciano la loro moltiplicazione. Essendo questa abitudine seguita anche
presso il caseificio dove ho effettuato le registrazioni dei dati, ho cominciato a registrare l’attività batterica in
un secchio contenente latte appena munto (alla temperatura di circa 32°C).
Di seguito vediamo l’andamento del pH in funzione del tempo.
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Grafico 1
Possiamo tralasciare i dati marcati in giallo (circa fino a 250 secondi), considerandoli come periodo di
adattamento della sonda. I dati seguenti mostrano l’abbassamento del pH. Questo primo abbassamento è
dovuto principalmente ai cocchi (in particolare stiamo parlando di Streptococchi lactis) presenti nella coltura
batterica. Nel capitolo dedicato alla fermentazione (cap. 5.4.2.4) troviamo maggiori informazioni sugli stessi
batteri, in particolare sulle condizioni ottimali e sul “lavoro combinato” fra cocchi e bacilli.
8.2.2. Andamento del pH dall’aggiunta del caglio fino alla coagulazione
Dopo aver sistemato artigianalmente i due registratori collegati alle sonde, posti sul braccio in legno che
sosteneva la caldaia, ho poi inserito le due sonde relativamente di pH e
temperatura nel latte presente in caldaia, pronto per essere lavorato. Qui ho
misurato i dati relativi durante il periodo di coagulazione del latte. Questo
periodo va dall’aggiunta del latte contenente la coltura, con conseguente
aggiunta del caglio, fino al momento della completa coagulazione del latte.
A questo punto ho dovuto togliere le sonde per permettere il taglio della
cagliata per formare la grana. Abbiamo visto in precedenza che la fase
successiva il taglio della grana consiste nel riscaldamento, mantenendo sempre in movimento tutta la massa.
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Le due operazioni, dapprima il taglio, e poi il mantenimento in movimento durante il riscaldamento, non
hanno permesso di tenere le sonde all’interno della caldaia. Ho quindi interrotto l’acquisizione dati
dall’inizio del taglio della grana fino a quando la stessa non fosse praticamente pronta per l’estrazione.
Di seguito vediamo l’andamento del pH dall’immissione del caglio nel latte maturo fino alla sua
coagulazione.
Grafico 2
Si può notare che l’ultimo valore di pH del grafico precedente, quello riguardante l’aggiunta dei batteri al
latte, e il primo valore di quest’ultimo grafico non corrispondono perfettamente. Abbiamo infatti un ultimo
dato del Grafico 1 di circa 6.855, mentre il primo dato significativo nel Grafico 2 (primo dato rosso senza
marcatura in giallo, corrisponde a circa 6.895. Questa piccola differenza è dovuta al fatto che i due grafici
corrispondono a registrazioni fatte in giorni diversi. In mancanza di dati corrispondenti all’andamento del pH
dall’aggiunta dei batteri al latte presi lo stesso giorno dei dati nei Grafici 2 e 3, ho riportato nel Grafico 1 i
dati di un altro giorno. Ricordo comunque che una variazione simile potrebbe essere dovuta ad un errore di
lettura della sonda, come pure al cambiamento delle condizioni. Non è quindi particolarmente rilevante; si
tralascino in seguito, se riscontrate, differenze dello stesso tipo (si provvederà comunque a far presente se si
tratta di un errore trascurabile).
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8.2.3. Andamento del pH nelle ore successive
L’ultima tappa delle registrazioni concerne il periodo che va dall’estrazione del formaggio dalla caldaia, fino
al mattino seguente. Abbiamo già detto che il taglio della cagliata e il mantenimento in movimento del latte
hanno reso impossibile rilevare dati durante il riscaldamento.
Dalla fine del grafico precedente, il quale arriva fino a qualche
istante prima del taglio della grana, fino all’inizio del prossimo,
il quale parte dall’estrazione del formaggio dalla caldaia, non
abbiamo riscontri numerici del pH: supponiamo, come poi si
dimostrerà con ulteriori esperimenti, che il pH continua a
scendere. In mancanza di una sonda adatta alla registrazione del
pH in un solido, quale è il formaggio, e considerato il fatto che il
formaggio estratto dalla caldaia va messo in forma e pressato,
con conseguenti rivoltamenti, e che in queste condizioni sarebbe
stato abbastanza difficile ottenere delle misurazioni precise, oltre
alle difficoltà prettamente tecniche, ho agito diversamente. Prima
dell’estrazione del formaggio dalla caldaia ho preso un po’di
grana e siero e li ho sistemati in una “thermos” (Figura 78), in
modo tale da ottenere un abbassamento della temperatura un
po’più simile
122
Figura 78
a quello che dovrebbe verificarsi nel formaggio sotto pressa.
Di seguito il Grafico 3 mostra l’andamento del pH dall’estrazione del formaggio dalla caldaia fino al giorno
seguente (più di 24 ore dopo l’estrazione).
122
Il formaggio estratto viene avvolto in tele, pressato e coperto. Lo scopo, oltre a dargli forma e consistenza
voluti, è quello di mantenerlo “caldo”, o per meglio dire, “di non fargli prendere freddo”, questo è legato
all’attività dei batteri. Sistemando il siero contenente della grana in una thermos, si ottiene una discesa delle
temperatura più lenta di quanto si avrebbe lasciando il tutto all’aria aperta in un qualsiasi recipiente: questa
diminuzione della temperatura sarà più simile a quella che avverrà nel formaggio sotto pressa.
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Grafico 3
Vediamo che la tendenza registrata nei primi due grafici si osserva anche qui. La parte iniziale del grafico,
marcata in giallo, vogliamo per il momento tralasciarla; sarà argomento dei prossimi capitoli analizzare
questa porzione di grafico.
8.3.
Analisi dei dati ottenuti
Parte importante di un esperimento sta nel confronto fra risultati attesi e risultati ottenuti. Prendendo in
considerazione gli aspetti teorici trattati fino ad ora, in particolare pensando al lavoro svolto dai batteri, il
risultato atteso era quello di avere un progressivo aumento del grado di acidità. La forte presenza di enzimi e
batteri, oltre alle numerose componenti presenti nel sistema dai noi studiato rendono molto probabile la
presenza di reazioni influenzanti il pH. Non possiamo quindi sapere con estrema certezza e precisione in che
parte l’abbassamento del pH sia dovuto a chi o a cosa (ad esempio un batterio o una reazione). Possiamo
comunque ritenere che la parte più importante di questo abbassamento sia dovuta all’attività batterica. In
precedenza, nel capitolo dedicato ai microrganismi (cap. 5.4.2.4) abbiamo discusso della convivenza tra i
batteri presenti nella coltura. È stato detto dell’attività differente di un tipo di batterio, il quale lavora a
temperatura più bassa e pH più alto rispetto ad un secondo che preferisce condizioni diverse, ossia
temperatura più elevata e pH più basso. Principalmente questo fattore e l’andamento della temperatura sono
da tenere presenti durante la lettura del grafico ottenuto nell’esperimento. Nel capitolo precedente non
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abbiamo analizzato il primo tratto del Grafico 3, quello che abbiamo marcato in giallo e che abbiamo detto
avremmo trattato meglio in seguito. Nel capitolo seguente ci occuperemo proprio dell’analisi di questa parte
del grafico, e quindi di ciò che è successo al sistema analizzato.
8.3.1. Analisi critica del grafico dell’andamento del pH
Più volte fin qui abbiamo detto che l’andamento aspettato era quello di un abbassamento graduale del pH,
ciò che in effetti si è verificato. La curva che ci saremmo aspettati era però una curva che al tempo t = 0 si
trovasse ad un valore di pH attorno al 7, che scendesse all’inizio dolcemente, poi in modo più marcato e
infine che si stabilizzasse attorno ad un valore prossimo a pH 5. Osservando il Grafico 3 vediamo invece che
il pH scende inizialmente, si assesta per un breve periodo, e poi comincia a risalire, seguito quindi dalla
ripresa dell’abbassamento del pH in accordo con quanto atteso. Il periodo interessato da questo andamento
un po’anomalo, arriva circa al tempo t = 10 000 s 123 . Questo risultato inatteso, ci ha chiaramente fatti
interrogare sulle cause del fenomeno. Siamo partiti dal ragionamento seguente: il valore di pH è indice della
concentrazione 124 dello ione idronio (H3O+), la formula è:
pH = −log a H O + ≈ −log[H 3 O + ]
3
Esso può anche esser calcolato con l’ausilio di un’altra formula, la quale invece di prendere in
considerazione la concentrazione dello ione idronio prende quella dello ione idrossido (OH-). La scala di pH
va dal grado 1 al 14; utilizzando la concentrazione di OH- nella formula del pH otteniamo il valore di
pOH 125 , il quale ha anche una scala che va da 1 a 14, dove il grado 1 indica una forte basicità, in luogo di una
forte acidità nella scala di pH. Da questo nuovo valore (valore di pOH) possiamo ricavare il pH
semplicemente seguendo la formula:
pH = 14 − pOH
L’innalzamento del pH può quindi essere dovuto ad una reazione che consumi H+, la quale farebbe di
conseguenza diminuire la concentrazione di H3O+ e alzare il pH; altra possibilità è quella di una reazione che
123
Ci si riferisce qui alla scala temporale riportata nel grafico 3. È stato detto in precedenza che la scala
temporale di questo grafico comincia con l’estrazione della grana dalla caldaia, il tempo t = 0 equivale quindi
all’inizio della ripresa dati del siero + grana messi in una thermos, come spiegato nel capitolo 8.2.3. Il
processo riferito a questo grafico è preceduto dallo sviluppo dei batteri ad una temperatura di 32°C per circa
un’ora, in seguito dall’aggiunta del caglio al latte, lasciato riposare per 45 minuti circa, e infine dal taglio
della grana e dal riscaldamento. Per situare quindi correttamente nel tempo (riferendosi al processo di
produzione) il momento dell’andamento del pH che stiamo studiando dobbiamo tener conto di circa 7000 –
8000 secondi precedenti il grafico.
124
Le concentrazioni sono sempre espresse in molari (molari = moli/litro = M).
125
pOH = −log a OH − ≈ −log[OH - ] .
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liberi OH-, la quale farebbe chiaramente aumentare la concentrazione dello stesso ione idrossido, quindi il
valore di pOH, per quindi far aumentare il valore di pH. Queste due possibilità sono state prese in
considerazione, cercando possibili reazioni simili conosciute nel sistema analizzato.
Oltre alle ricerche su libri di testo ho contattato un agronomo 126 che ha lavorato alcuni anni all’Agroscope
Liebefeld-Posieux Stazione Federale di Ricerca per la Produzione animale e lattiera (ALP) e il Servizio
ispezione Consulenza Lattiera (SICL) di Bellinzona. Anche con la loro consulenza non siamo riusciti a
trovare una spiegazione certa che si rifacesse ad una particolare reazione, in particolare i consigli non
andavano nella direzione di un possibile consumo di H+ o rilascio di OH-, ma piuttosto in direzione di un
problema di misurazioni da parte delle sonde, o del sistema stesso, trovandoci confrontati con la misurazione
in un solido (anche se comunque era presente una soluzione). Diverse sono state quindi le ipotesi alle quali ci
siamo rifatti per cercare di spiegare questa situazione. Prima di avanzare qualunque ipotesi, abbiamo
comunque ritenuto opportuno ripetere le misurazioni in laboratorio, in un ambiente quindi più controllato. Di
seguito la descrizione e i risultati degli esperimenti condotti in laboratorio.
8.4.
Esperimenti di controllo in laboratorio
Gli esperimenti condotti in laboratorio sono stati fatti con lo scopo di controllare e verificare l’attendibilità
dei dati ottenuti dalle misurazioni da me effettuate durante l’estate, per ricavare dati che potessero meglio
spiegare quelli ottenuti precedentemente, e per ricavare i dati di pH e temperatura relativi alla fase di taglio e
riscaldamento della grana. Gli esperimenti sono stati svolti in tre differenti parti: il primo esperimento era
finalizzato alla raccolta di dati da poter confrontare direttamente con quelli gia in nostro possesso, avendo
adottato la stessa tipologia di procedimento, ovvero il processo di caseificazione seguito dall’estrazione del
siero + grana sistemato in una thermos. Il secondo esperimento era identico per la prima parte al precedente,
fino all’estrazione, e si distingueva in seguito per la sistemazione della grana senza presenza di siero. Il terzo
esperimento invece è stato semplicemente la misurazione dell’andamento del pH del latte portato a 32°C al
quale è stata aggiunta della coltura batterica. Per gli esperimenti, svolti nei laboratori del Liceo Cantonale di
Locarno, è stato utilizzato il seguente materiale:
-
3 volte 0.5 L di latte
-
coltura batterica fornita dal Servizio Ispezione e Controllo Lattiero (SICL) di Bellinzona
-
caglio
-
3 placche con cavo elettrico
-
3 magneti
-
3 Becher da 650 mL
-
3 stativi
126
La persona interessata è il Sig. Laurent Pillonel, il quale ha redatto il testo “MANUALE PER LA
TRASFORMAZIONE DEL LATTE SULLE ALPI TICINESI, Un sostegno per il casaro, il pastore e il
gestore”. È questo uno dei testi ai quali mi sono affidato per redigere il mio lavoro.
Matteo Lava
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Matteo Lava
Fermentazione lattica e produzione del formaggio
-
6 morsetti
-
6 pinze
-
1 sonda Metrohm 713 per pH
-
2 sonde Pasco per pH, PS-2102
-
3 sonde Pasco per temperatura, PS-2125
-
3 collegamenti USB link per collegare le sonde al PC, PS-2100
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8.4.1. Procedura e descrizione degli esperimenti
Come prima cosa abbiamo provveduto a preparare delle soluzioni tampone, rispettivamente di pH 4, pH 7 e
pH 10, per calibrare le sonde. Dopo la calibrazione delle sonde e la preparazione del materiale necessario,
abbiamo proceduto con l’avvio dell’esperimento. Di seguito troviamo il procedimento seguito:
-
Sistemare 3 volte 0.5 L di latte crudo in 3 Becher da 650 mL posti sopra una placca con
possibilità di regolare la temperatura e il numero di giri per il magnete. Il latte crudo non ha
subito alcun trattamento all’infuori di una prima scrematura della panna affiorata
naturalmente;
-
sistemare stativi, pinze e morsetti per inserire 2 sonde in ogni Becher, una di temperatura e
una di pH;
-
collegare tutte le sonde al PC (Figure 79 e 81). Inserire in 2 Becher una sonda Pasco per il
pH e una sonda Pasco per la temperatura. Nel terzo Becher utilizzare una sonda di
temperatura uguale alle precedenti e la sonda di pH Metrohm 713 (Figura 80);
Figura 79
-
Figura 80
inserire il magnete nel Becher. Riscaldare fino a 32-34°C mantenendo il latte in leggero
movimento;
-
127
una volta raggiunta la temperatura indicata inserire 0.16 mL di coltura per ogni Becher 127 ;
La registrazione dati parte in questo istante: al tempo t = 0 corrisponde l’aggiunta della coltura.
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Figura 81
Da questo momento un Becher verrà “dimenticato”, lasciando decorrere le reazioni al suo interno. Si
provvederà solamente a mantenere la temperatura.
-
nei due Becher rimanenti mantenere la temperatura costante a 32-34°C. Al tempo t = 45 min
aggiungere 0.8 mL di caglio;
-
quando il latte è coagulato, indicativamente attorno al tempo t = 1 h 30 min, procedere col
taglio della cagliata;
-
dopo aver formato la grana e averla lasciata riposare iniziare col riscaldamento. Nel nostro
esperimento questo momento equivaleva al tempo t = 1 h 37 min;
-
dopo aver raggiunto la temperatura di 45°C in ca. 45 minuti abbiamo sistemato il contenuto
del secondo Becher in una “thermos” (Figura 82) e continuato la registrazione dati. Dal
primo invece abbiamo estratto solamente quello che è a questo punto il formaggio. È stato
sistemato artigianalmente in modo da poter perdere pian piano il siero ancora contenuto al
suo interno, continuando sempre con l’acquisizione dei dati (Figura 83).
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Figura 82
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Figura 83
8.4.2. Risultati ottenuti
Dal procedimento descritto sopra abbiamo ottenuto risultati molto simili a quelli misurati in estate (dati dei
Grafici 1-3). Questo ci permette di escludere quasi certamente grossi errori sperimentali nel risultato
particolare di cui sopra discusso. Vedremo nei seguenti grafici i dati ottenuti in estate confrontati con quelli
ottenuti in laboratorio. Non pretendono di essere estremamente attendibili dal punto di vista quantitativo,
possono però essere considerati per un’analisi qualitativa.
8.4.3. Possibile interpretazione
Gli esperimenti condotti in laboratorio ci hanno permesso di verificare i risultati ottenuti in precedenza, ci
hanno pure confermato l’attività batterica nel periodo di tempo in cui non è stato possibile effettuare delle
misurazioni in estate. Per continuare una discussione sui risultati ottenuti è chiaramente indispensabile poter
lavorare con dati se non esatti, almeno indicativi. Gli esperimenti svolti in laboratorio ci permettono appunto
questo proseguimento, di avanzare nel lavoro di analisi e di formulazione di un’ipotesi.
Vediamo di seguito di confrontare i due grafici, rispettivamente dei dati presi d’estate (Grafico 4) e quelli
registrati in laboratorio (Grafico 5).
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Grafico 4
Grafico 5
L’andamento nei due grafici è molto simile, se non identico, ciò che ci permette di ritenere attendibili e
riproducibili i dati registrati e quindi di utilizzarli per descrivere il processo. Se pur verificata l’attendibilità
dei dati, non siamo ancora però riusciti a giustificare l’andamento particolare riportato nel grafico del pH
(Grafico 3 e seguenti).
Un’ipotesi che potrebbe spiegare l’innalzamento del pH è l’influsso della temperatura sullo stesso valore. Di
seguito vedremo e procederemo alle dimostrazioni della validità di quest’ipotsi.
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8.4.4. Esperimento di controllo dell’influenza della temperatura sul pH
Per verificare se l’ipotesi dell’influenza della temperatura sul pH, tenuta presente l’importante presenza di
variabili sconosciute, abbiamo proceduto con la ripetizione dell’esperimento leggermente modificato.
Abbiamo ripetuto l’esperimento in laboratorio, nelle stesse condizioni, senza aggiungere però né coltura né
caglio. La certezza assoluta che si tratti dell’influenza della temperatura è chiaramente impossibile da avere,
per poterne esser completamente certi, dovremmo conoscere esattamente tutte le reazioni che avvengono,
con tanto di equilibri, concentrazioni, … Avendo però escluso l’azione dei batteri, e quella del caglio,
entrambi assenti, possiamo supporre con una certa sicurezza che l’influsso della temperatura sia l’ipotesi
corretta.
Sono stati rispettati tempi e temperature al meglio. Per i primi 45 minuti si è mantenuta la temperatura di
32°C, corrispondente alla maturazione del latte, ovvero alla moltiplicazione dei batteri, per i 45 minuti
seguenti si è ancora mantenuta la temperatura, corrispondente al periodo di coagulazione del latte, e poi si è
provveduto al riscaldamento fino a 45°C, temperatura raggiunta all’incirca in 50 minuti. A questo punto il
latte è stato travasato in una thermos e lasciato raffreddare. I dati registrati riguardano l’intero processo. Di
seguito vediamo il grafico ottenuto (valori di pH).
Grafico 6
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Ritroviamo in questo grafico lo stesso andamento riscontrato nella parte iniziale (cfr. dati in giallo
Grafico 3) dei precedenti. Il pH scende, raggiunge un valore minimo, nel Grafico 6 da considerarsi attorno a
pH = 6.69, e poi risale. Questo minimo relativo è leggermente più basso nel Grafico 5, si situa a circa 6.64,
nel Grafico 3 è ancora più basso, addirittura attorno a 6.45. Queste differenze credo possano essere attribuite
all’attività dei batteri.
Possiamo quindi concludere dicendo che l’effetto particolare osservato nella prima parte del grafico è dovuta
semplicemente alla temperatura, che influenzando le singole reazioni all’interno del sistema, ne sposta
l’equilibrio dapprima liberando maggiori quantità di H+, durante la fase di riscaldamento, e in seguito (dopo
l’estrazione,con conseguente raffreddamento) nel verso opposto, con consumo di H+.
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9. Bibliografia
Documenti cartacei:
•
NEIL A. CAMPBELL, JANE B. REECE, Biologia, Seconda edizione italiana condotta sulla
Sesta edizione americana, Zanichelli 2004
•
ALBERTO TAGLIAFERRI, CELESTE GRANDE, Biotecnologie e chimica delle
fermentazioni, Zanichelli 2002
•
CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO, Chimica delle
fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995
•
CESARE CORRADINI, Chimica e tecnologie del latte, Tecniche Nuove 1995
•
K. PETER, C. VOLLHARDT E NEIL E. SCHORE, Chimica organica, Zanichelli 2004, Terza
edizione
•
HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica, Zanichelli 2003,
Quinta edizione
•
PAOLA BASTASIN E ROSSELLA ROMANI, Elementi di biotecnologie generali e agrarie,
Franco Lucisano Editore 1998
•
DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA di lehninger,
Zanichelli 2002, Terza edizione
•
TOM P. COULTATE, La chimica degli alimenti, Zanichelli 2004
•
LAM di chimica 2004, Liceo Cantonale di Mendrisio, svolto da MASSIMO MALOCCHI,
ATHENA REALINI E SEBASTIANO SEMINI, responsabile Professor P.G.Casartelli
•
L.PILLONEL, Manuale per la trasformazione del latte sulle alpi ticinesi, per conto di
Agroscope Liebefeld-Posieux, 2006
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Matteo Lava
•
Fermentazione lattica e produzione del formaggio
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JEROME J. PERRY, JAMES T. STALEY, STEPHEN LORY, MICROBIOLOGIA 1 fisiologia,
genetica, virologia, evoluzione e diversità, Zanichelli 2004
Siti internet:
•
http://www.alp.admin.ch
•
http://www.food-info.net/images/lactase.jpg
•
http://160.114.99.91/astrojan/protein/pictures/rennin3.jpg il 12.01.2007
•
http://www.landfood.ubc.ca/courses/fnh/301/protein/protq3.htm
•
http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.fst.rdg.ac.uk/courses/fs560/topic1/t1g/t1g
.htm
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10.Allegati
10.1. Lista degli amminoacidi con sigla, abbreviazione e formula
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Figura 84 128
128
Lista tratta da: HAROLD HART, LESILE E. CRAINE, DAVID J. HART, Chimica organica, Zanichelli
2003, Quinta edizione, pag. 410-411.
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10.2. Procedura d’analisi per determinare la contaminazione da
batteriofagi e interpretazione dei risultati129
Procedura di analisi
Introdurre 100 mL di latte sterilizzato in due provette sterili (A e B). In esse si innestano i fermenti abituali in
percentuale nota e determinata. Nella provetta B si aggiunge inoltre l’1% del siero della lavorazione che si
sospetta inquinata dal fago. Le provette vengono poste in incubazione per 5 ore a 30 °C.
Interpretazione
Se il latte della provetta B risulta essere più acido di quello della provetta A, i fermenti hanno lavorato
correttamente e si può escludere la presenza di batteriofagi. Se l’acidità misurata nella provetta A è almeno
del 10 % superiore a quella della provetta B, è probabile la presenza di fagi nel siero.
In questo caso occorre cambiare il ceppo di fermenti e disinfettare tutto il materiale e gli strumenti utilizzati
nel caseificio.
10.3. Procedimento colorazione di Gram
Figura 85 130
129
Tratto da: L.PILLONEL, Manuale per la trasformazione del latte sulle alpi ticinesi, per conto di
Agroscope Liebefeld-Posieux, 2006, pag. 35.
130
Procedura tratta da: CARLO QUAGLIERINI, MARCO TANNINI E ENRICHETTA PALADINO,
Chimica delle fermentazioni e laboratorio, Zanichelli 1995, pag. 177.
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10.4. Caratteri tipici dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi
Figura 86 131
131
Vedi nota precedente.
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10.5. Di seguito le schede di descrizione delle colture CMB 291, CM
401 e CM 3008 prodotte dall’ALP
Figura 87 132
132
Documento tratto da:
http://www.alp.admin.ch/dienstleistungen/00638/00809/00910/00911/index.html?lang=it il 18.11.2006.
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Figura 88 133
133
Vedi nota precedente.
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Figura 89 134
134
Documento tratto da:
http://www.alp.admin.ch/dienstleistungen/00638/00809/00821/00822/index.html?lang=it il 18.11.2006
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11.Ringraziamenti
Ringrazio tutti i quali in un modo o nell’altro mi hanno seguito, aiutato, consigliato, fornito attrezzature o
altro, insomma, tutte le persone con le quali ho preso contatto per realizzare questo lavoro.
Comincio ringraziando i professori delle materie interessate dal mio lavoro, ovvero la prof.ssa Claire Beretta
Steiner (biologia) e prof. Dott. ing. ETH Gianmarco Zenoni (chimica). Ringrazio entrambi per l’interesse
dimostrato e per le ore fuori corso, in particolare il mio docente responsabile Gianmarco Zenoni. Ringrazio
poi il Sig. Franco Vanzetti, proprietario dell’azienda agricola sulla quale ho sviluppato il mio interesse per
l’agricoltura e in questo caso particolare per la produzione lattiera e conseguente trasformazione in
formaggio. Lo ringrazio per i momenti passati assieme, per tutto ciò che mi ha insegnato, per la passione e
l’attaccamento alla terra e alla natura. Oltre a questo lo ringrazio per avermi permesso di effettuare alcune
registrazioni dati di cui si è discusso precedentemente. Insieme a lui ringrazio pure chi ha reso i momenti
trascorsi a lavorare più divertenti, chi anno dopo anno ho sempre ritrovato sui prati, sui pascoli, in caseificio
o in stalla.
Ringrazio tutti coloro che hanno contribuito in un modo o nell’altro alla realizzazione degli esperimenti in
laboratorio. Ricordo per questo il SILC di Bellinzona, e in particolare il Sig. Renato Bontognali e il Sig.
Enrico Rezzonico, per avermi fornito la coltura vegetativa, per i primi consigli riferiti agli esperimenti, e per
l’aiuto e interesse nel trovare una risposta ad alcuni dubbi. Ringrazio poi la LATI per le informazioni
fornitemi sulla loro produzione, in particolare ricordo la Sig.a Margherita Marchesi, responsabile qualità, e
per avermi fornito il latte utilizzato negli esperimenti. Ringrazio Johanna Favre, una mia compagna di
scuola, e la sua famiglia per avermi fornito il caglio necessario per far avvenire la coagulazione del latte.
Ringrazio il prof. Valerio Sala per avermi prestato una sonda di pH per la misurazione in ambienti con scarsa
presenza di solventi (acqua). Ringrazio mio fratello Sebastiano per avermi dato una mano in laboratorio
durante gli esperimenti, e il resto della mia famiglia per avermi aiutato quando necessario.
Ringrazio infine, ma non da ultimi, quegli amici che forse si sono sentiti trascurati alcune volte, sentendosi
dire: “Scusa ma adesso devo andare a fare il LAM”.
Come ultimissimo ringraziamento mi rivolgo a coloro i quali decideranno di leggere questo lavoro, sperando
che possa essere utile e di loro gradimento.
Sperando di non aver dimenticato nessuno - solo nella parte scritta, non nella mia testa - ringrazio
nuovamente tutti i quali hanno collaborato, avuto a che fare o semplicemente influito su questo lavoro.
Grazie a tutti!
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