Diapositiva 1 - Orientamento In Rete

Come si replica il DNA
Replicazione semiconservativa
Un’emielica di DNA funziona
da stampo per la sintesi di un
nuovo filamento
Filamento
parentale
Filamento
parentale
Filamenti figli
L’enzima DNA polimerasi
catalizza la formazione
del
legame
estere
aggiungendo
nucleosidi
trifosfati
all’estremità
3’-OH di una emielica di
DNA;
pertanto
la
direzione di
sempre 5’-3’
sintesi
è
La DNA polimerasi
necessita
di
un
innesco o “primer”:
breve sequenza di
RNA
sintetizzata
dall’enzima primasi
-filamento
anticipato
(“leading”) sintetizzato
in modo continuo
- filamento in ritardo
(“lagging”) sintetizzato
in
modo discontinuo
(frammenti di Okazaki)
sullo stampo 5’-3’.
DNA polimerasi
La formazione del legame fosfodiestere
avviene solo in direzione 5’→3’
In direzione 3’→5’ si svolge l’attività
di “correzione delle bozze”
necessaria per rimuovere nucleotidi
erroneamente inseriti, permettendo
cosi una replicazione fedele del DNA
Sadava, Heller ,
Orians,Purves, Hillis
Biologia Zanichelli
Il complesso di duplicazione : una macchina molecolare
composta da molte proteine che si lega in
corrispondenza delle sequenze ori (origine della
replicazione ) permettendo lo scorrimento del DNA e la
sua replicazione in entrambe le direzioni (due forcelle
di replicazione
La replicazione del DNA
nel cromosoma circolare
procariotico (unica origine di replicazione) e nei
cromosomi
lineari
eucariotici
(diverse
origini
di
replicazione per ogni cromosoma). La replicazione del
DNA è sempre bidirezionale
REPLICAZIONE delle
sequenze telomeriche
La rimozione del primer di
RNA sull’estremità 5’ del
filamento
in
anticipo
neozintetizzato
produce
molecole di DNA con
estremità 5’ più corte rispetto
alla molecola di partenza
Alle due estremità della doppia elica del DNA in
tutti i cromosomi eucariotici sono presenti
sequenze ripetute di eterocromatina costitutiva
con alto numero di copie (nell’uomo TTAGGG
con 100-1500 ripetizioni ) che impediscono
l’erosione dei geni codificanti
Ad ogni ciclo replicativo i telomeri di tutti i cromosomi lineari si
accorciano determinando l’invecchiamento della cellula e la morte per
APOPTOSI
Solo le cellule che possiedono la TELOMERASI (cellule del midollo
osseo, cellule della linea germinale, molti tipi di cellule tumorali) non
presentano accorciamento dei telomeri. La telomerasi (scoperta nel 1989 nel
protozoo Tetrahymena ) è una molecola composta da proteine e RNA
(ribozima) il quale funziona da stampo per la sintesi di DNA ovvero per
l’aggiunta della sequenza telomerica deteminando così l’allungamento
dei telomeri
TRASCRIZIONE : sintesi di RNA
Il flusso
dell’informazione
genetica : dai
geni alle
proteine, dal
genotipo al
fenotipo
tRNA
DNA
mRNA
Amino-acidi
rRNA
Proteine
ribosomali
Aminoacil- tRNA
TRADUZIONE : sintesi di
proteine
ribosomi
Polipeptidi
Assemblaggio
Proteina
Trascrizione e Traduzione
in procarioti ed eucarioti
eucarioti
procarioti
Nei procarioti trascrizione e traduzione sono eventi accoppiati grazie
all’assenza di membrana nucleare.
Negli eucarioti il trascritto primario (pre-mRNA) subisce una serie di
processamenti nel nucleo; l’RNAm maturo viene tradotto nel
citoplasma
campbell
Sintesi dell’RNA
catalizzata
dall’enzima
RNApolimerasi
L’RNA polimerasi ha
direzione di
sintesi 5’- 3’.
I precursori sono
nucleosidi
trifosfati
L’ RNA sintetizzato è
antiparallelo al
filamento di DNA
stampo
Per la trascrizione di un gene/regione un solo dei due filamenti di DNA è letto :
il filamento stampo. Il filamento di DNA non utilizzato come stampo viene
definito filamento codificante, perché ha la stessa sequenza dell’RNA trascritto
Le tre fasi della
Trascrizione
Promotore
sequenza nucleotidica
di un gene a cui si lega
l’RNA polimerasi per
iniziare la trascrizione .
Procarioti
- promotori con sequenze
consenso
- unico promotore per geni
contigui (p.e. operone lac )
- un unico tipo di RNA pol.
Eucarioti
-promotori con sequenze
consenso (TATA box)
- tre tipi di RNA pol.
-necessità di fattori di
trascrizione
1 : Inizio
(terminatore)
2 : Allungamento
3 : Terminazione
La maturazione del
trascritto primario
(pre-mRNA) in
eucarioti
Nelle cellule eucariotiche :
-Sono presenti tre tipi di RNA polimerasi (I per rRNA, II per
mRNA, III per tRNA)
- i geni sono discontinui (esoni intervallati da introni)
- l’RNA trascritto primario viene modificato (maturato)
attraverso i seguenti processi :
 rimozione delle sequenze introniche : splicing dell’RNA
ad opera dello spliceosoma composto da proteine e snRNA
(ribozima )
 aggiunta di una guanina modificata all’estremità 5’ :
cappuccio al 5’
 aggiunta di una sequenza di 50-250 adenine all’estremità
3’ : coda di poli-A
L’importanza funzionale ed evolutiva degli introni
Una delle funzioni degli introni è quella di permettere la
codificazione di proteine diverse a partire da un unico gene
attraverso il meccanismo di splicing alternativo . Infatti i siti di
splicing possono essere attivi o disattivati a seconda del tipo di
cellula o tessuto . Questo è uno dei motivi per cui il genoma
umano in cui sono presenti circa 25.000 geni è in grado di
codificare circa 100.000 polipeptidi
Il codice genetico è l’insieme di regole che
permettono la corrispondenza tra sequenze
nucleotidiche e aminoacidiche
Il codice genetico :
* strutturato a
triplette/codoni
(tre nucleotidi un
aminoacido )
* ridondante/degenerato
(codoni diversi ma
sinonimi → stesso
aminoacido)
* non ambiguo
(un codone → un unico
aminoacido)
* continuo e senza
sovrapposizioni
* codoni di inizio e di fine
traduzione
* è universale
Il codice genetico e le conseguenze dei vari tipi di
mutazioni geniche puntiformi
Mutazioni per
sostituzione
nucleotidica
effetto sulla sequenza aminoacidica
silente
Nessuno (conseguenza della degenerazione o ridondanza
del codice )
neutra
cambia un aminoacido e viene mantenuta la
funzione
missenso o di
senso
non senso
cambia un aminoacido e viene perduta la
funzione
sequenza incompleta : proteina tronca e non
funzionante
MUTAZIONE per inserzione/delezione di 1-2 nucleotidi frame-shift
(scorrimento della cornice di lettura ) : cambiamento di molti
aminoacidi
Inserzione di 3 nucleotidi/ Delezione di 3 nucleotidi : Inserzione di un
aminoacido - Delezione di un aminoacido
N.B.Negli eucarioti mutazioni negli introni possono avere conseguenze : p.e. comparsa di
un nuovo sito di splicing in seguito a mutazione per sostituzione o delezione/inserzione
TRADUZIONE :
dalla sequenza di RNAm alla sequenza polipeptidica
Struttura dei tRNA (RNA
transfer)
OH estremità 3’
Reazione di attivazione
dell’aminoacido
tRNA
Aminoacido
Aminoacido
(fenilalanina)
aminoacido
estremità 5’
+
AminoaciltRNA
Anticodone
Aminoacil-tRNA
SINTETASI
I ribosomi sono composti da proteine e da RNA
ribosomale e sono formati da due subunità
Sadava Zanichelli
Amminoacido
polipeptide
“exit”
Le due subunità ribosomali sono separate quando il ribosoma non è
impegnato nella sintesi proteica
Inizio
traduzione
Allungamento della catena polipeptidica
Sadava
Terminazione della
traduzione e rilascio
della catena
polipeptidica completa
Smistamento delle proteine e modificazioni
post-traduzionali nelle cellule eucariotiche
In relazione alla destinazione della proteina codificata I ribosomi
impegnati nella sintesi proteica rimangono liberi nel citoplasma o si
legano al Reticolo Endoplasmatico (ribosomi legati al RE )
I ribosomi liberi sintetizzano le proteine destinate al nucleo, ai
mitocondri, ai perossisomi e ai cloroplasti
I ribosomi legati al RE sintetizzano le proteine secrete dalla cellula, le
proteine della membrana plasmatica, dell’apparato di Golgi e dei
lisosomi
Le nuove frontiere della genetica: DNA ricombinante e
sue possibili applicazioni biotecnologiche.
Biotecnologie : utilizzazione di cellule e di organismi viventi per
produrre o per modificare materiali e processi utili agli esseri umani .
Le biotecnologie comprendono
le TECNOLOGIE DEL DNA
RICOMBINANTE che hanno vaste applicazioni in molti campi
compreso quello biomedico
Esempi di obiettivi rilevanti delle tecnologie del DNA ricombinante :
- individuare, isolare, analizzare , sequenziare, amplificare (“clonare”
ovvero ottenere molte copie ) sequenze di DNA di interesse p.e.
sequenze geniche mutate in malattie ereditarie o altri tipi di patologie
caratterizzate da mutazioni somatiche (come i tumori);
-trasferire sequenze di DNA da un organismo a un altro della stessa
specie o di specie anche molto diverse (organismi transgenici o
Organismi Geneticamente Modificati) allo scopo di far acquisire agli
individui riceventi proprietà e comportamenti che prima non aveva.
ENZIMI di RESTRIZIONE : sono i principali strumenti delle tecnologie
del DNA ricombinante in quanto in provetta tagliano qualunque tipo di
DNA in specifiche sequenze palindromi* producendo frammenti di
restrizione di lunghezza variabile
Esempio di sequenza palindrome :
5’….AACGTT….3’
3’…TTGCAA…..5’
I frammenti di restrizione
possono essere separati in
base al loro p.m. utilizzando
la tecnica dell’elettroforesi
su gel
Un gel contenente frammenti di DNA separati. Ogni “corsia” è relativa
a un campione di DNA (p.e. ottenuto da cellule di diversi individui) Si
ottiene così il profilo genetico (DNA fingerprinting ovvero “impronte”
del DNA ) che è specifico per ogni individuo in quanto c’è variabilità
interindivuale per le sequenze di DNA . P.e. variazioni ai siti di
restrizione generano frammenti di restrizione con lunghezza diversa
da individuo a individuo
Dei 7 individui sospettati del crimine, quale è il colpevole ?
Sequenze di DNA umano
possono essere inserite
in un plasmide ovvero un
vettore e trasferite in
cellule batteriche
Cellule
transgeniche
Plasmide
ricombinante
sintetizzano
grandi quantità
del prodotto di
un transgene
Cellula transgenica
Il risultato di questo tipo di tecnologie è la produzione di proteine
umane di interesse : “farmaci ricombinanti” come insulina,
interferoni, alcuni vaccini (p.e. vaccino per epatite B, per papilloma
virus ,responsabile del tumore al collo dell’utero ecc.)
La reazione a catena della polimerasi (PCR) :
clonaggio del DNA in vitro
Permette di amplificare in vitro una
sequenza di DNA presente anche in
piccolissime quantità all’interno di
un insieme eterogeneo di molecole
di DNA (applicazioni in medicina
legale e in numerosi altri campi
della medicina)
La tecnica è basata su :
- cicli di denaturazione ad alta
temperatura della molecola di DNA di
interesse,
- uso di “primer”, sequenze di RNA
oligonucleotidiche complementari alle
sequenze
fiancheggianti
della
sequenza
da
amplificare,
- sintesi di DNA catalizzata dall’enzima
termostabile Taq polimerasi ottenuto
da un procariote Archaea