REPLICAZIONE DEL DNA

REPLICAZIONE DEL DNA
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La replicazione del DNA è semiconservativa: ciascuno dei due filamenti
parentali serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove
doppie eliche sono costituite ognuna da un filamento vecchio e da un
filamento nuovo.
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Complesso multi-proteico per le replicazione del DNA
• DNA elicasi
• DNA primasi
• Proteina SSB (Single Strand-Binding Protein)
• DNA polimerasi
• DNA topoisomerasi
• DNA ligasi
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4
5
Tutte le DNA polimerasi in tutti gli organismi sono capaci
di sintetizzare DNA soltanto in direzione 5’-3’
5’
3’
Direzione di sintesi
DNA polimerasi
DNA dipendente
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nucleotide (nucleoside trifosfato): elemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleici
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La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un
nucleoside trifosfato (nucleotide) all’estremità 3’OH
5’
5’
3’
3’
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Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi
filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in
direzione opposta
5’
5’
Direzione di sintesi
5’
3’
3’
3’
5’
3’
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Replicazione del DNA 1
In corrispondenza delle origini di replicazione l’elicasi svolge i
filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi
e generando due filamenti singoli
Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e
lo stabilizzano
Denaturazione del DNA
helicase
Origin of replication
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Replicazione del DNA 2
La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve
innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex
novo la sintesi, ma solo di allungare un 3’ preesistente)
La DNA polimerasi III estende l’innesco a RNA sintetizzando DNA
innesco
3’
helicase
helicase
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La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa direzione di avanzamento
della elicasi e quindi in maniera continua …
Ma cosa succede sul filamento complementare?
Leading strand
helicase
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Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera
discontinua (la DNApol III va in direzione opposta rispetto
all’elicasi), attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di
Okazaki)
5’
3’ 5’
helicase
primase
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Replicazione del DNA 3
Rimozione del primer a RNA e “gap filling” da parte della DNA
pol I che attacca nucleotidi al 3’ libero del frammento di Okazaki
precedente mentre degrada il primer a RNA
5’
helicase
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Azione della DNA pol I
Primer RNA
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
DNA pol I
5’
3’
3’
5’
5’
5’ 3’
DNA pol I
3’
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Replicazione del DNA 4
Saldatura dei frammenti (ligasi)
5’
helicase
ligase
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Extension - The Replication Fork
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Primase
Laging Strand
Okazaki
fragment
5’
RNA
Primers
3’
Single strand
binding
proteins
5’
DNA
Polymerase
5’
3’
Helicase
Leading Strand
5’
3’
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La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei superavvolgimenti
Topoisomerasi I
rompono transitoriamente una
sola delle catene del DNA, la
ruotano attorno a quella integra
e infine riuniscono le estremità
interrotte
Le Topoisomerasi hanno il compito di rilassare (eliminare) le tensioni che si creano nella doppia elica
del DNA in seguito ai processi cellulari che implichino un cambiamento di topologia del DNA
(trascrizione, replicazione del DNA)
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Replicazione dell’estremità del cromosoma
DNA stampo
primer
fine
cromosoma
DNA in sintesi
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Telomeri
• Le estremità 5’ dei nuovi filamenti di DNA, negli eucarioti, non
possono essere replicate, dopo la rimozione dei primer perché non
esiste un’estremità 3’ per l’aggiunta dei nucleotidi.
• Ad ogni ciclo replicativo le molecole di DNA si accorciano
• Presenza di sequenze ripetute i telomeri che non contengono geni.
• Nelle cellule germinali, che devono preservare i genomi immutati
nel corso delle diverse generazioni, sono presenti le telomerasi
che allungano i telomeri.
• Probabile correlazione tra invecchiamento e accorciamento dei
telomeri.
• Trovata attività telomerasica in cellule tumorali.
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Telomeri
• Sequenze ripetute all’estremità dei cromosomi
• Costituiti da alcune migliaia di ripetizioni di
sequenze brevi
• Nell’uomo: (TTAGGG)n
• Proteggono il cromosoma dalla degradazione ad
opera di nucleasi (sono ripiegati su se stessi) ed
impediscono che le estremità dei cromosomi si
saldino tra di loro
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Telomeri
• Nelle cellule germinali e nelle cellule staminali la
lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni
divisione cellulare grazie all’attività della
telomerasi
• Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni
replicazione del DNA il telomero subisce un
accorciamento
• La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca
arresto della crescita cellulare e apoptosi
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Caratteristiche delle DNA polimerasi
• Hanno attività polimerasica SOLO in direzione 5’-3’
• Necessità di innesco a RNA (primer)
• Attività esonucleasica 3’-5’ correzione di bozze
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• Alla DNA polimerasi è associata un’attività esonucleasica che consente la
“correzione di bozze”= rimozione di nucleotidi errati.
• Con questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessi dalla DNA
pol mentre la replicazione è in corso.
• tasso di errore durante la sintesi 1 su 10.000 nt; dopo correzione 1su dieci
miliardi nt.
• È sufficientemente basso?
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• Nel genoma umano (aploide) ci sono c.a. 3 x109 nt
• di questi solo il 2% sono sequenze codificanti (esoniche)
• Se non ci fosse correzione di bozze (tasso di errore durante la sintesi 1x10-4 nt):
6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA
• Dopo correzione di bozze (1x10-10 nt ):
0.006 mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA (1
mutazione ogni 166 replicazioni)
• Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché intervengono dei
processi di riparazione del DNA post-replicativi
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RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair)
Provvede ad effettuare una scansione del DNA dopo la replicazione alla ricerca di appaiamenti
errati
Il sistema di riparazione è
in grado di riconoscere e
riparare il filamento di
nuova sintesi
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tasso di errore durante la sintesi 1x10-4 nt
dopo correzione 1x10-10 nt …è sufficientemente basso?
Difetti nel “mismatch repair”
Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti nel mismatch repair sono
associate al cancro.
La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si accumulano in tutto il genoma e che,
quando colpiscono geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la
trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non poliposico ereditario HNPCC,
autosomica dominante)
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I processi di riparazione del DNA post replicativi sono ESSENZIALI
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Un errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazione successivi
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Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni
multiple
Direzione di replicazione
bidirezionale a partire da ORI
multiple
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Replicazione del DNA circolare
ORI è sequenza ricca in A-T
Nei procarioti l’origine di
replicazione è singola
Direzione di replicazione
bidirezionale a partire da ORI
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La replicazione a circolo rotante
Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli
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