Biotecnologia
L’uso di organismi o parti di essi
per la produzione di prodotti
utili
La Biotecnologia ha origini molto antiche
Processi fermentativi di cibi e bevande
6000 a.C. i Sumeri e Babilonesi producevano birra
4000 a.C.
-gli Egiziani producevano pane lievitato
-il vino era già conosciuto nei paesi del Vicino Oriente
-diverse specie di ‘muffe’ venivano usate per produrre
formaggio
La proprietà dei microrganismi di causare
processi di fermentazione fu dimostrata da
Pasteur fra il 1857 e il 1876 e quindi fu
possibile effettuare un controllo più
consapevole ed efficiente delle fermentazioni
Produzione biotecnologica di farmaci
-negli anni ’40, furono introdotte tecnologie per la
coltura massiva di organismi microbici in condizioni
sterili per la produzione di antibiotici (es. penicillina),
vaccini, enzimi ecc.
Produzione biotecnologica di pesticidi
-es: produzione su larga scala del Bacillus thuringensis
come insetticida contro la piralide del mais
Domesticazione delle
piante e animali
Inizio del
miglioramento
genetico
Tutte le piante o parti di esse (es.
colture di radici, colture cellulari) che
oggi coltiviamo sono il risultato della
‘manipolazione’ dell’uomo per produrre di
prodotti utili
Un chiaro esempio
dell’azione dell’uomo
sulle piante selvatiche
Frumento selvatico e
Frumento coltivato
Esempio di miglioramento genetico operato dai
nostri antenati primitivi: selezione di mutanti
naturali
Rachide rigida
Rachide fragile
(efficace per la
dispersione dei
semi)
(limitante per la
dispersione dei
semi)
l’intervento dell’uomo ha
invertito il suo destino:
da probabile estinto a
maggiormente diffuso
Frumento selvatico
(Triticum squarrosa)
Caratteri comunemente associati con il processo
di domesticazione delle piante.
•Aumento nel numero di semi e frutti
•Dimensioni maggiori dei semi e dei frutti
•Maggiore uniformità e rapidità nella
germinazione dei semi
•Maggiore uniformità nel processo di maturazione
•Frutti e semi non deiscenti
•Autoimpollinazione
•Tendenza al ciclo vitale annuale
•Aumentate proprietà organolettiche
•Perdita di strutture di difesa
Dopo una lunga fase in cui l’uomo ha
operato come semplice selezionatore
della variabilità naturale intorno al
XVII-XVIII secolo ha iniziato a
‘combinare’ in modo controllato la
variabilità.
Sono di questo periodo i numerosi
incroci inter- e intra-specifici con lo
scopo principale di studiare le funzioni
del polline e ovulo (es: Josef Gottlieb
Kolreuter nel 1760 produsse un ibrido
tra la Nicotiana paniculata e N. rustica).
Dopo le scoperta
da parte di
Mendel delle leggi
dell’ereditabilità
è stato possibile
effettuare un
miglioramento
genetico più
consapevole e
mirato
Le varietà ad elevata resa prodotte in
seguito sono il risultato dell’applicazione
delle conoscenze genetiche più avanzate
di quel periodo, ovvero tramite:
gli incroci intra- ed inter-specifici
Esempio di ibrido interspecifico artificiale:
Triticale
Esempio di ibrido interspecifico artificiale:
Mapo
Origine:
incrocio tra il
mandarino
Avana ed il
pompelmo
Duncan
ottenuto da F.
Russo presso
l'Istituto
Sperimentale
per
l'agricoltura di
Acireale,
Italia
28 febbraio 1953: la scoperta della doppia elica del
DNA da parte di James Watson and Francis Crick
“credo di aver scoperto il segreto della vita“
(Crick, nell'Eagle Pub di Cambridge)
Questa scoperta determinò un
radicale cambiamento anche nel
settore del Miglioramento genetico
vegetale, dove la continua ricerca di
nuova variabilità da cui selezionare
caratteri utili portò allo sviluppo delle
tecniche di mutagenesi.
L’uomo da semplice selezionatore e
successivamente ‘combinatore’ della
variabilità naturale diventa
l’artefice della produzione di nuova
variabilità su cui operare per la
selezione di caratteri utili
(anche se gli incroci inter-specifici avevano
già rappresentato di fatto i primi tentativi di
produrre nuova variabilità)
In agricoltura per sviluppare nuove varietà …………
•Uso di radiazioni per causare mutazioni
casuali
Raggi X, g
Es: Cariossidi di frumento irradiate con raggi gamma
Raggi g
Progenie
genotipo selezionato
Box 6
Box 7
Il grano duro Creso
e' stato ottenuto da
un incrocio tra una
varieta' messicana, la
Cymmit, e una
italiana, la Cappelli, la
quale e' stata
precedentemente
sottoposta a
bombardamento con
raggi X (è stato usato
il mutante di Cappelli
Cp B144).
In generale, circa 2000 varietà coltivate
derivano da questo trattamento
Più recentemente, le conoscenze
soprattutto sui fitormoni hanno portato allo
sviluppo di metodologie di Miglioramento
genetico che utilizza colture cellulari
Da una
singola cellula
vegetale
possiamo
ottenere una
pianta intera
• Colture cellulari
• Variazione
Somaclonale
• Colture aploidi
• Semi Artificiali
• Ibridi Interspecifici
– Embryo Rescue
– Fusione dei
Protoplasti
(ibridazione somatica)
• Micropropagazione
Esempio di varietà derivata da
variazione somaclonale
Le tecniche del DNA ricombinante
(ingegneria genetica) rappresentano
un ulteriore affinamento delle tecniche
di manipolazione genetica per il
miglioramento genetico delle varietà
coltivate.
Nel settore vegetale l’applicazione di
queste tecniche ha contribuito a
produrre individui con specifiche
caratteristiche utili ( es. produzione di
metaboliti secondari utili, resistenza a
insetti, erbicidi, virus, alterato
contenuto in specifiche sostanze ecc.)
Riassumendo…….
•L’agricoltura non è nata in seguito ad un processo di
selezione naturale ma è una ‘invenzione’ dell’uomo
•Le piante coltivate non sono il risultato della selezione
naturale ma della selezione artificiale operata dall’uomo
•Le piante coltivate derivano da mutanti naturali
sottoposti al processo di miglioramento genetico o da
mutanti prodotti dall’uomo sulla base delle tecniche di
miglioramento genetico
•Le tecniche del miglioramento genetico si basano sulle
conoscenze biologiche
•Le tecniche del DNA ricombinate sono metodologie
del miglioramento genetico. Esse si basano sulle più
attuali conoscenze biologiche
Stretta correlazione tra Fisiologia
vegetale e Biotecnologie vegetali
Contributo della fisiologia vegetale
La conoscenza dei processi fisiologici che regolano
la crescita e lo sviluppo della pianta consente un
intervento mirato nella selezione e manipolazione di
uno specifico carattere di interesse
Contributo delle biotecnologie vegetali
Produzione di piante transgeniche
per la verifica in planta del ruolo svolto da
specifiche componenti
per l’individuazione di processi fisiologici
(macchine geniche)
per costituire varietà con migliorate
caratteristiche (es. più resistenti, più
produttive, qualitativamente superiori)
Contributo delle Biotecnologie vegetali
nell’ambito della
Fisiologia vegetale
Miglioramento genetico
Ricerca di base
Aspetti applicativi
Il contributo delle biotecnologie
vegetali sia alla Fisiologia vegetale
che al Miglioramento genetico
prevede la produzione di piante
transgeniche, quindi
Vediamone i passaggi essenziali
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
Produzione di piante transgeniche:
caratteristiche essenziali di un costrutto genico
“gene di interesse”
gDNA
Promotore
gDNA
Transgene specifico
Es. 1) CaMV 35S (343 bp)
2) Ubiquitina di mais (1992 bp)
Terminatore
Es. NOS
Metodi di trasformazione
Biologico (Agrobacterium): dicotiledoni
Fisico (Biolistico): Monocotiledoni
•Elettroporazione
•Fusione con liposomi
•Microiniezione
•Vettori virali: solo per trasformazioni transienti
Metodo Fisico: trasformazione diretta
Bombardamento o metodo biolistico (microprojectile or particle bombardment). Questa tecnica si basa
sull’uso di un bombardatore (“particle gun” or “gene gun”). Il costrutto viene precipitato su particelle d’oro
che vengono ‘sparate’ nel tessuto vegetale. Nella amggior parte dei casi si osserva espressione transiente
(il DNA non si integra nel genoma ma viene trascritto finchè non viene degradato). In una piccola
percentuale di cellule il costrutto si integra nel DNA genomico e quindi si ha l’espressione stabile. Uno dei
principali limiti di questa tecnica è che spesso si ha l’integrazione di copie multiple del transgene.
Disco di rottura
Valvola della pressione
Disco con le particelle d’oro
ricoperte di DNA
Piastra di arresto
Linea per il vuoto
Linea del gas
Camera del vuoto
Campione va qui
Metodo biologico: Agrobacterium tumephaciens
Possiede un megaplasmide in aggiunta al suo DNA
cromosomico
Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-)
responsabili di numerose malattie delle piante
A. tumefaciens - crown gall disease – galla del colletto
rose
A. rhizogenes - hairy root disease- radici pelose
Meno studiato ma molto simile all’ A. tumefaciens
grapevine
A volte il
tumore può
essere molto
esteso!
Agrobacterium: un ingegnere genetico naturale
Il trasferimento del T-DNA segue un preciso meccanismo
con numerosi passaggi, alcuni dei quali sono stati chiariti
Agrobacterium
e
Ingegneria Genetia vegetale
Osservazioni chiave
Il T-DNA è permanentemente incorporato nel genoma
della cellula ospite
Nessuno dei geni codificati dal T-DNA sono necessari
per questo;
Soltanto i bordi del T-DNA e le funzioni vir sono
necessari
Bordo di sinistra, LB
Bordo di destra, RB
Solo le due estremità – circa 25 basi ciascuna - sono necessarie
per il trasferimento e l’integrazione del T-DNA
Operativamente per la trasformazione sono necessari:
• Il gene di interesse posto tra il LB e RB
• Geni Vir
Questi due componenti devono essere presenti nell’A.
tumefaciens per poter trasferire il gene di interesse
Plasmide Ti
Gene di interesse
T-DNA
LB
RB
E
D
C
G
B
A
vir
Plasmide Ti
ori
•Sistema del Vettore binario
Gene di interesse
T-DNA
E
LB
D
C
G
B
A
RB
vir
Plasmide Ti helper
Plasmide Ti
ori
ori
•Sistema del
Vettore binario
Fig. 15.6 Watson et al DNA ricombinante
•Sistema del Vettore binario
1) Plasmide di piccole dimensioni
ad ampio spettro d’ospite:
•Due Ori: di E. coli e di Agrobacterium
•RB (e LB)
•Marcatori per la selezione e
mantenimento in E. coli e A. tumefaciens
•Marcatore di selezione per le piante
•Gene di interesse
2) Plasmide Ti helper
(Ti disarmato)
•Privo del T-DNA
•Contiene i geni Vir
•Sistema del
Vettore binario
Fig. 15.6 Watson et al DNA ricombinante
•Sistema del
Vettore binario
Fig. 15.6 Watson et al DNA ricombinante
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
La necessità di usare i marcatori di selezione è dovuta
al fatto che:
Soltanto una piccola frazione delle cellule ospiti
subisce la trasformazione
Funzione del marcatore di selezione
Quindi, si usano condizioni di coltivazione in
cui le cellule trasformate sopravvivono, mentre le cellule non
trasformate muoino = pressione selettiva
Capsula di Petri contenente terreno di coltura per la
selezione (negativa) di piante trasformate (es. canamicina,
erbicida)
Produzione di piante transgeniche:
Passaggi essenziali
Isolamento del gene di ‘interesse’ (es: inserimento in un
plasmide)
Preparazione di un costrutto per la trasformazione
genetica
Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale
(Trasformazione genetica)
Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di
selezione)
Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (OGM)
Rigenerazione
Il rapporto auxina
/citochinina
regola la
morfogenesi nelle
colture di tessuti
Piante e tessuti usati per la trasformazione
La scelta del tessuto dipende dalla specie
Il tessuto deve essere capace di generare callo (tessuto
indifferenziato) da cui si potrà rigenerare la pianta intera
Alcuni tessuti che si sono riscontrati trasformabili in
più piante sono:
•Embrioni immaturi
•Dischi fogliari
•Meristemi apicali
Es. I fiori di Arabidopsis possono essere semplicemente immersi in
una soluzione contenente il costrutto genico (Floral dip
transformation)
Metodo fisico
Metodo biologico
http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/genetransfer.html
Cosa è stato fatto...
Approvate per la commercializzazione
negli USA: 12 specie di piante
coltivate
Mais
patata
Cotone
Pomodoro
riso
zucchine
Soia
Barbabietola
lino
Papaya
Cicoria
colza
Sono stati modificati 6 caratteri
Resistenza agli erbicidi
Resistenza agli insetti (Bt)
Resistenza ai virus
Ritardo nella maturazione dei frutti
Alterazione nel contenuto in olii
Controllo nella produzione del polline
2010 – Aumento nel contenuto in amilopectina
Europa
Unico evento autorizzato in EU è il mais Bt MON810 (coltivato in
Spagna)
Resistenza agli insetti
Mais resistente alla
piralide (Ostrinia
nubilalis) tramite la
proteina Bt
Esempio di:
•Unica pianta transgenica coltivata in Europa
•Implementazione dell’espressione
Ciclo vitale della piralide: ciclo annuale
Ciclo vitale della piralide: danni della pianta
Infezioni secondarie su mais attaccata dalla piralide
Diffusione della piralide in Europa
Il controllo tradizionale della piralide
•Impiego di insetticidi chimici attivi per contatto sulle uova
e per ingestione sugli stadi larvali (es. prodotti a base di
piretroidi o altri principi attivi come il Rynaxypyr,
Indoxacarb, diflubenzuron)
•preparati a base di Bacillus thuringiensis var. Kurstaki
(Btk). Tali prodotti agiscono per ingestione, causando la
morte delle larve dopo 3-5 giorni.
(prodotto usato anche nella lotta biologica)
•I tricogrammatidi (imenottero parassitoide Trichogramma
brassicae) sono parassitoidi oofagi (si sviluppano all’interno
dell’uovo dell’insetto ospite) (prodotto usato nella lotta
biologica)
•Combinazione di formulati chimici e preparati a base di Btk
•MONITORAGGIO: per individuare il momento di intervento
più efficace è di fondamentale importanza effettuare
osservazioni dirette delle ovature sulle foglie e monitorare il
volo del lepidottero con trappole a feromoni e luminose
Trappole a cono di rete innescate con
feromoni specifici per O. nubilalis
per monitorare la presenza degli
Adulti.
OPERATIVITÀ
•Trattamenti con insetticidi chimici: si effettuano con trampolo
semovente, impiegando volumi d’ acqua elevati (400/800 l/ha).
•Btk: è applicato con l’ausilio di macchinari a trampolo con manica
d’aria. Possono essere necessari 2 trattamenti intervallati da 710 giorni.
•Tricogrammatidi: Il parassitoide è commercializzato sotto
forma di pupe pronte a sfarfallare su cartellini di cartoncino da
applicare alle piante o lanciare dal perimetro dell’appezzamento.
macchina a trampolo
Le piante di mais GM esprimono la proteina insetticida
del Bacillus thuringensis
Isolamento del gene Bt
Preparazione del
costrutto genico
Trasformazione
genetica
Rigenerazione
della pianta
Cultivar resistente alla piralide
Madalità di azione della proteina Bt
Maisgard (Monsanto)
Maisgard (Monsanto)
Sezione del fusto
di mais transgenico
per il gene Bt
Pianta di mais
NON
transgenica
Resistenza agli erbicidi
(carattere GM più diffuso)
bromoxynil cotone
glufosinato barbabietola, colza, mais, soia
glifosato
barbabietola, mais, cotone, soia
sulfonil urea cotone, lino
Eritrosio-4-fosfato
fosfoenolpiruvato
3-deidrochinato
3-deidroshichimato
acido scichimico 3-fosfato
fosfoenolpiruvato
EPSP sintasi
glifosato
EPSP
Corismato
Triptofano
Fenilalanina
Tirosina
Modalità d’azione delle piante di mais NK603 tolleranti al
glifosato
EPSPS: 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasi
CTP: proteina di trasporto nel cloroplasto
Resistenza agli erbicidi
(carattere GM più diffuso)
bromoxynil cotone
glufosinato barbabietola, colza, mais, soia
glifosato
barbabietola, mais, cotone, soia
sulfonil urea cotone, lino
•Streptomyces hygroscopicus accumula come metabolita
secondario il Bialaphos un tripeptide lineare composto
da fosfinotricina-Ala-Ala.
•Per evitare l’effetto tossico del Bialaphos lo S.
hygroscopicus possiede l’enzima phosphinothricin
acetyltransferase (PAT) codifiato dal gene bar.
•Le piante transgeniche prodotte con il gene bar sono
resistenti all’erbicida fosfinotricina
•Il gene bar viene comunemente utilizzato nella
procedura di trasformazione genetica come agente
selettivo (Marcatore di selezione)
Riso dorato – Ricco di provitamina A
AMFLORA
Patata autorizzata
alla coltivazione nel
2010, produce solo
amilopectina
Patata d’oro
Principali preoccupazioni per ambiente e consumatori:
1. La diffusione di caratteri GM alle specie affini
selvatiche;
2. La diffusione della resistenza agli antibiotici nelle
popolazioni selvatiche di microrganismi;
3. Diffusione del materiale GM sulle coltivazioni
“biologiche”: es: attraverso le api (che renderebbe la
produzione biologica impossibile con l’attuale
normativa)
Limite 0.9%)
I prodotti Biotech vengono
Continuamente Controllati
Scoperta
Isolamento
del gene
Trasform
azione
Sviluppo del Prodotto
Valutazione
della pianta
in serra e in
campo
Commercializzazione
Produzione
Post
Selezione
Sviluppo
Market
Market
della linea della varietà in campo
NIH-Natinal Institute of Healt
Linee guida
Es.
negli
USA
USDA - U.S. Department of Agriculture
Determina se è sicura da crescere
EPA - U.S. Environmental Protection Agency
Determina se è sicura per l’ambiente
FDA - U.S. Food and Drug Administration
Determina se è sicura come cibo
Grazie a questi controlli non ci sono
sul mercato i famosi mostri fragolapesce o pomodoro-pesce
Cosi come non è presente in
commercio la soia GE allergenica
Le piante GM sono più pericolose delle
altre piante?
No.
Dagli studi pubblicati relativi alla sicurezza
degli OGM (ca. 3.500) e dai dati ottenuti da una
serie di studi finanziati dalla Comunità Europea
durato 15 anni (70 milioni di €, 400 Centri di
ricerca pubblici coinvolti) emerge che gli OGM
non manifestano un comportamento diverso da
quello delle colture tradizionali
Regolamenti sulla Etichettatura degli
alimenti contenenti OGM
Stati Uniti: Concetto di alimenti OGM
sostanzialmente equivalenti ai convenzionali.
Se sostanzialmente equivalenti non c’e’
necessità di etichettamento
Europa: Alimenti contenenti >0.9% di OGM devono
essere etichettati (49/2000) (solo per
favorire la libera scelta del consumatore)
Controllo presenza OGM
negli alimenti
Si utilizza la tecnologia della reazione a catena della
DNA Polimerasi (PCR) che consente di rilevare la
presenza di OGM anche a livelli inferiori allo 0.1%
Analisi OGM sugli alimenti
Estrazione del DNA
Allestimento
della
reazione
Analisi PCR
Risultato
Conclusioni
Gli OGM offrono diversi potenziali benefici se
utilizzati appropriatamente:
• Cibo più sano
• Minore impatto ambientale
• Minori costi di produzione
La valutazione deve essere sicuramente
fatta caso per caso
Inoltre, si può sempre migliorare………..
Le piante cisgeniche: utilizzo della procedura di
trasformazione genetica per l’inserimento di geni
proveniente da piante sessualmente compatibili
Contributo delle Biotecnologie alla
Fisiologia vegetale
Verifica in planta del ruolo svolto da specifiche
componenti Produzione di piante
transgeniche
Malattie del frumento: Fusariosi della spiga
•Malattia causata da Fusarium
graminearum e altre specie del genere
Fusarium spp.
•Le cariossidi sono contaminate da
micotossine tossiche per l’uomo e
animali (es. Deossinivalenolo, DON)
Patogeni
producono enzimi capaci di degradare la
parete
GLU
PL
XIL
La parete della cellula vegetale
Cellulosa
Emicellulosa
Homogalacturonan
Pectina
xyloglucan
Ca2+-crosslinked
galactomannan
non-methylesterified
arabinoxylan
methylesterified
Rhamnogalacturonan
RG I
(galactan) (arabinan)
RG II
(boron-diester)
Alcune osservazioni:
•La parete cellulare contiene delle proteine in grado di
inibire, in saggi in vitro, gli enzimi idrolitici dei funghi
patogeni. Per questo motivo, queste proteine sono state
chiamate inibitori delle glicosidasi.
•I geni che codificano per gli inibitori delle glicosidasi
aumentano la trascrizione in seguito all’infezione della
pianta
Un esempio di inibitore delle glicosidasi è l’inibitore
proteico delle poligalatturonasi (PGIP)
Ipotesi: Gli inibitori delle glicosidasi partecipano alla
difesa della pianta contro i funghi patogeni in quanto
inibendo l’attività di specifiche idrolasi fungine rallentano
la colonizzazione del tessuto ospite da parte del fungo
patogeno
1. Isolato il gene che codifica per la PGIP
2. Preparato il costrutto genico:
Promotore
costitutivo
ATG… …Gene PGIP.…TAA Ter
3. Trasformazione genetica di embrioni immaturi con il
metodo Biolistico
4. Selezione, rigenerazione e trasferimento in terreno delle
piante T0
Le piante
transgeniche
presentno un
aumento nell’attività
di inibizione di 20
rispetto alle piante
di controllo
Attività PGIP contro FgPG (% inibizione)
Caratterizzazione biochimica e molecolare delle
piante transgeniche
120
J82-23aNS
Controllo
J82-23aT
100
80
60
40
20
0
11.8 17.7 70.0 0.7
0.8
Quantità di estratto
proteico totale (µg)
3.4
Esperimenti di infezione
Frumento-Fusarium
graminearum
Esperimenti di infezione Frumento-Fusarium graminearum
% infected spikelets
NS
T
Days post-infection
Valutazione del grado di infezione
7 dpi
26%
T
C
16
14
12
10
8
6
4
2
0
3
6
8
10
dpi
J82-23aNS
J82-23a T
13
16
19
23
# Infected spikelets/Tot spikelets
# infected spikelets/tot spikelets
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
T
8 dpi
C
T
C
21 dpi
Le piante transgeniche posseggono una riduzione del sintomo del 26%
Le cariossidi delle piante transgeniche infettate con F.
graminearum mostrano una riduzione nell’accumulo di DON del
50% rispetto alle piante di controllo infettate
Cariossidi infettate delle
piante di controllo
Cariossidi infettate delle
piante transgeniche
