La farmacogenetica nella gestione del paziente con tumore
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SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica VI° CONGRESSO NAZIONALE FITeLab Slow Medicine Laboratory: IT’s the Future 1-2-3 Ottobre 2015 Ospedale Borgo Roma (Verona) La farmacogenetica nella gestione del paziente con tumore colorettale, l’esperienza traslazionale al CRO di Aviano Parte tecnico-pratica Franca SARTOR TLBM Farmacologia Sperimentale e Clinica CRO – Aviano Screening pre-terapeutico di markers farmacogenetici correlati alle tossicità da chemioterapia 0 alleli Dose Standard varianti DPYD Pazienti candidati a chemioterapia a base di Fluoropirimidine e/o Irinotecano Screening genetico pre-terapia DPYD*2A DPYD*13 DPYD-2846A>T UGT1A1*28 1 allele variante DPYD 2 o più alleli varianti DPYD UGT1A1*28/*28 Dose IRI 70% UGT1A1*1/*1 UGT1A1*1/*28 Possibile inclusione negli studi di fase 1b Riduzione Dose Fluoropirimidine del 50% Prediligere una terapia alternativa DESCRIZIONE DEL PROCESSO – Diagramma di flusso INIZIO Arrivo campione da analizzare Accettazione e registrazione NO Identificazione campione CORRETTA Ricontattare il richiedente SI NO Stoccaggio temporaneo Analisi immediata SI Analisi campione SI NO Analisi effettuata correttamente SI Emissione del referto e stoccaggi del campione biologico residuo FINE SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica TIPO DI ANALISI RICHIESTE/DISPONIBILI Polimorfismi del gene DPYD e tossicità severa da fluoropirimidine Metabolismo cellulare dei Fluoro-derivati DPD E’ L’ENZIMA CHIAVE LIMITANTE PER LA DETOSSIFICAZIONE DEI FLUORO-DERIVATI NELLE CELLULE Polimorfismi indagati: DPYD *2A (IVS14+1A/G, rs3918290) DPYD *13 (1679T/G, rs55886062) DPYD 2864 A/T (rs67376798) Polimorfismi delle isoforme UGT1A1 e UGT1A7 e terapia basata sull’IRINOTECANO UGT1A1 E UGT1A7 SONO LE ISOFORME DELL’ENZIMA UGT MAGGIORMENTE IMPLICATE NEL CATABOLISMO DELL’IRINOTECANO UO Complessa di Farmacologia Sperimentale e Clinica STRUMENTI UTILIZZATI PER L’ANALISI Pyrosequencing e Sequenziatore per analisi frammenti Pyrosequencing™ PSQ 96 MA (Biotage AB) PyroMark Q96 ID (Qiagen) Pyrosequencing™ Reazione di Minisequenziamento per sintesi Tale metodica si basa su una quantificazione luminometrica indiretta dei gruppi pirofosfato (PPi) che vengono liberati dai nucleotidi man mano incorporati durante la sintesi di un filamento di DNA complementare ad un templato stampo. Assay design Richiesti 3 PRIMERS Due primers (di cui uno biotinilato) per l’amplificazione tramite PCR della zona target contenente lo SNP • Primer biotinilato [conc]< 0,2µM • Prodotto PCR 200-300 bp Un primer di sequenza • • • • Complementare al filamento biotinilato Tm: 40°C-50°C Lunghezza: circa 15 basi. Posizionamento flessibile: terminale 3’, dopo appaiamento col filamento biotinilato (toglierei), deve risultare collocato adiacentemente al sito polimorfico Quando la base polimorfica forma un omopolimero con le basi adiacenti il primer di sequenza deve sovrapporsi alla regione omopolimerica Forward / Reverse Pyrosequencing assay Pyrosequecing Assay PREPARAZIONE del CAMPIONE 1) Amplificazione della regione di DNA contenente lo SNP (Y/R) tramite PCR con un primer BIOTINILATO (B) IMPIEGO del PYROSEQUENZIATORE Aggiunta di un nucleotide alla volta secondo un preciso ordine di dispensazione primer di sequenza nucleotidi incorporati NNNNNNN Y/R B 1) liberazione di gruppo PPi 2) separazione del singolo filamento biotinilato Y/R 3) 2) emissione di luce visibile che viene evidenziata nel pirogramma tramite un picco proporzionale ai dNTPs incorporati B appaiamento con il primer di sequenza primer di sequenza Y/R B 3) spegnimento del segnale (apirasi) e aggiunta del nucleotide successivo Sequenza nucleotidica Nucleotidi aggiunti 4) sintesi del filamento complem. e determinazione della sequenza Pyrosequecing: esempio di risultati C/C wild type C/T eterozigote T/T mutato DPYD in DIAGNOSTICA – SNP analizzati DPYD *2A (IVS14+1A/G, rs3918290) DPYD *13 (1679T/G, rs55886062) DPYD 2864 A/T (rs67376798) SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica SEQUENZIATORE PER ANALISI DEI FRAMMENTI Sequenziatore per analisi frammenti genetic analyzer ABI PRISM 3100 Analisi dei frammenti Metodica basata su una elettroforesi capillare associata ad un’analisi di fluorescenza impiegata per studiare STR (short tandem repeats) o delezioni/inserzioni in quanto permette di separare frammenti di DNA di lunghezza diversa, amplificati utilizzando un primer marcato con un fluoroforo, in base alla loro dimensione. 2 3 1 Schema del processamento di frammenti di DNA all’interno dello strumento Genetic Analyzer ABI Prism 3100 4 Interpretazione dei risultati con il software Gene Scan Separazione di frammenti di DNA di varie dimensioni marcati con differenti fluorofori (rosso=ROX, verde=JOE, giallo=LIZ) Il più piccolo è il più veloce ed esce per primo (t1) mentre il più grande esce per ultimo (t3) . Esempio: determinazione dell’UGT1A1*28 94bp 6/6 ripetizioni 94bp 96bp 6/7 ripetizioni 96bp 7/7 ripetizioni SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica ANALISI DEI DATI E REFERTAZIONE DNLAB DNfirma INTERPRETAZIONE RISULTATI SUGGERIMENTI DPYD WT per tutte e tre le varianti: Non sono state riscontrate controindicazioni genetiche all'utilizzo di un dosaggio standard di fluoro pirimidine. Eterozigote per una sola variante : Sulla base della variazione genetica riscontrata è consigliabile una riduzione del dosaggio iniziale di fluoroprimidine al 50% della dose standard per limitare l’incidenza di tossicità severa al trattamento, in base alle linee guida SIF-AIOM. Un aggiustamento successivo della dose può essere effettuato in accordo con le norme della normale pratica clinica. Eterozigote per più di una variante Sulla base delle variazioni genetiche riscontrate è consigliabile valutare l’utilizzo di una terapia alternativa alle fluoroprimidine per l’alto rischio di sviluppare tossicità severa al trattamento. Omozigote mutato per una delle varianti: è consigliabile valutare l’utilizzo di una terapia alternativa alle fluoroprimidine per l’alto rischio di sviluppare tossicità severa al trattamento. UGT1A1*28 *1/*1 (WT): Non sono state riscontrate controindicazioni genetiche all'utilizzo di un dosaggio standard di irinotecano. *1/*28 (ETEROZIGOTE): Non sono state riscontrate controindicazioni genetiche all'utilizzo di un dosaggio standard di irinotecano. *28/*28 (MUTATO): Sulla base della variazione genetica riscontrata è consigliabile una riduzione del dosaggio iniziale di irinotecano al 70% della dose standard per limitare l’incidenza di tossicità severa al trattamento, in base alle linee guida SIF-AIOM. Un aggiustamento successivo della dose può essere effettuato in accordo con le norme della normale pratica clinica. SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica GRAZIE PER L’ATTENZIONE
