Università degli Studi di Sassari
Corso di Formazione finalizzato alla preparazione per le procedure di
mobilità verticale per la categoria D, Area Tecnica, TecnicoScientifica, Elaborazione Dati settore BIOLOGICO
Lezione sull’accertamento diagnostico delle
malattie infettive
SVILUPPO DELLA LEZIONE
Epidemiologia delle malattie infettive
Inquadramento dell’accertamento diagnostico
delle infezioni nell’ambito della profilassi
Descrizione
tappe
dell’accertamento
diagnostico diretto delle malattie infettive
Principali
tecniche
molecolari
caratterizzazione di microrganismi
per
la
Mortalità per categoria di malattia
nelle principali regioni del mondo
Malattie infettive
Ogni condizione morbosa che
riconosca
come
causa
necessaria
della
sua
insorgenza l’azione di un
agente eziologico vivente.
Ogni condizione morbosa che riconosca come causa necessaria alla
sua insorgenza l’azione di un agente eziologico
Trasmissibili
Non trasmissibili
Esogene
Comunitarie
MALATTIE INFETTIVE
Nosocomiali
Endogene
Rapide
Lente
Modello eziopatogenetico generale delle malattie
Remissione del rischio
Fattori di malattia
Organismo
sano
Condizione
rischio
di
Persistenza indeterminata
del rischio
Malattia
Storia naturale e prevenzione delle malattie infettive
TRIANGOLO EPIDEMIOLOGICO
Ospite
Agente
eziologico
Ambiente
Malattie infettive
Riserva di infezione: persona, animale od oggetto in cui un
agente infettivo di norma vive e si moltiplica e da cui dipende
per la sopravvivenza in maniera tale da poter essere
trasmesso
Sorgente o fonte di infezione: persona, animale dal quale
l’agente passa direttamente all’ospite
Infezione: radicamento ed attiva moltiplicazione di un
microrganismo nell’ospite
Contaminazione: contatto di un microrganismo con un
elemento inanimato o con un distretto superficiale di un
organismo vivente
Patogenicità: proprietà (posseduta o meno) di provocare una
patologia caratteristica nell’uomo o in altre specie animali o
vegetali
Virulenza: esprime non solo il concetto di patogenicità ma
anche il livello di gravità che riesce a provocare
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI PENETRAZIONE
Malattie infettive
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
OSPITI
POTENZIALI
SORGENTE
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
• Uomo o Animale
Malato - Portatore
Sorgente di infezione: persona, animale da cui un agente infettivo passa ad
un ospite
Serbatoio di infezione: specie animale, vegetale o substrato inanimato
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
Malattie infettive
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
PORTATORI
Soggetti che eliminano uno specifico agente patogeno
in assenza di segni clinici di malattia
Portatori precoci: soggetti che si trovano nel periodo di incubazione di una
malattia e che possono diffondere l’agente patogeno anche prima del
manifestarsi della malattia stessa
Portatori convalescente: malati che continuano ad eliminare l’agente
patogeno anche dopo la guarigione clinica
Portatori sani: soggetti che si infettano ed eliminano l’agente patogeno
senza sviluppare la malttia
Portatori cronici: malati che continuano ad eliminare l’agente patogeno
anche dopo la guarigione clinica per diversi anni (anche tutta la vita)
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
Malattie infettive
VIE DI
ELIMINAZIONE
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI ELIMINAZIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
Cutanea
Genito-urinaria
Intestinale
Buccale
Respiratoria
Congiuntivale
Parenterale
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
Malattie infettive
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
VIE DI ELIMINAZIONE
Cutanea malattie localizzate, esantemi essudativi
Genito-urinaria malattie veneree, infez. urinarie
Intestinale salmonelle, shighelle, vibrio c., tenie, virus
polio, HB A
Buccale stomatiti, herpes, rabbia, virus parotite
Respiratoria malattie localizzate al naso, bronchi
faringe, trachea, polmoni; mal. generalizzate con esantemi:
morbillo, rosolia, varicella , vaiolo
Congiuntivale tracoma
Parenterale HBV, HIV,
MODALITÀ DI TRASMISSIONE
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
Tr. VERTICALE
VIE DI
ELIMINAZIONE
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
madre
Tr. ORIZZONTALE
dopo la nascita
• via transplacentare
• al parto
prodotto del
concepimento
TORCH
Fonte di
infezione
Umano
Infetto
Modalità di
Trasmissione
Trasmissione verticale
(materno-fetale)
Ospite
Ospite
CATENA EPIDEMIOLOGICA
MODALITÀ DI TRASMISSIONE
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
DIRETTA: contatto
INDIRETTA:
- veicoli
- vettori
SEMIDIRETTA
o interumana
Trasmissione delle malattie
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
• Diretta
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
– Trasmissione sessuale (Sifilide, HBV, HCV, AIDS)
• Semidiretta
• per contagio interumano
– aerogena (Morbillo, Meningite, Scarlattina)
– (Mononucleosi)
Trasmissione delle malattie
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
• Indiretta
OSPITI
POTENZIALI
• Veicoli
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
– Febbre Tifoide, Poliomielite, Colera
– Botulismo
– Legionellosi
• Vettori
– vettore meccanico (mosca)
– vettore obbligato (zanzara anopheles)
– vettore di arricchimento (zecche, pulci, pidocchi)
CATENA EPIDEMIOLOGICA
SORGENTE
VIE DI
ELIMINAZIONE
Malattie infettive
OSPITI
POTENZIALI
TRASMISSIONE
VIE DI
PENETRAZIONE
VIE DI PENETRAZIONE
Congenita transplacentare
Orale digerente
Respiratoria
Congiuntivale
Genito-urinaria
Cute integra
Ferite
Iniezioni
Punture di insetti
Malattie infettive
• SPORADICA:
SPORADICA malattia normalmente non rilevabile in una
definita area geografica
• ENDEMIA:
ENDEMIA livelli di frequenza di una determinata
patologia che sia costantemente rilevabile in una definita
area geografica
• EPIDEMIA:
EPIDEMIA incidenza di una determinata patologia che
sia significativamente superiore a quella registrata nello
stesso periodo di tempo degli anni precedenti in una
stessa popolazione o area geografica definita e che
riconosca un movente comune
• PANDEMIA:
PANDEMIA epidemia che interessa nello stesso periodo
di tempo o in rapida successione temporale vaste aree di
popolazione a livello mondiale
PROFILASSI
• ogni attività finalizzata ad impedire l’insorgenza di
patologie o comunque la diminuzione dei livelli di
qualità di vita dei singoli o delle popolazioni;
• rivolta a contrastare l’azione dei diversi fattori di
rischio presenti nei tre ambiti connessi con la storia
naturale della malattia
Ambiente
Agente
Ospite
PROFILASSI
OBIETTIVI:
✔scoprire e rendere inattive le sorgenti ed i serbatoi di
infezione;
✔interrompere le catene di trasmissione;
✔modificare le condizioni ambientali favorevoli alla
persistenza ed alla diffusione delle infezioni;
✔modificare la recettività delle popolazioni.
PROFILASSI
A) INDIRETTA O MEDIATA
B) DIRETTA O IMMEDIATA
PROFILASSI
B) DIRETTA O IMMEDIATA
1. Generica
✓ denuncia
✓ isolamento e contumacia
✓ inchiesta epidemiologica
✓ accertamento diagnostico
✓ disinfezione
✓ disinfestazione
2. Specifica
✓ immunoprofilassi
✓ chemioprofilassi
PROFILASSI
✓ ACCERTAMENTO DIAGNOSTICO:
A)DIRETTO
Accerta la presenza dell’agente
eziologico nell’organismo ospite
B) INDIRETTO
Evidenzia i segni della reazione
immunitaria specifica
dell'organismo
POSTULATI DI KOCH
1) Si deve isolare il microrganismo dai malati
2) Si deve poter coltivare
3) Inoculato in un animale deve causare la
stessa malattia
4) Si deve isolare il microrganismo dall’animale
ACCERTAMENTO DIAGNOSTICO
• MALATO: precisare l’eziologia di una malattia in atto;
consentire una precisa diagnosi; orientare la terapia;
decidere eventuali misure profilattiche; stabilire la
prognosi.
• CONVALESCENTE: accertare che un individuo guarito
si sia liberato completamente dai microrganismi che lo
infettavano così da non rappresentare una possibile
fonte di contagio.
• SANO: individuare la presenza di eventuali portatori
sani fra gli individui che hanno avuto contatti con un
ammalato o fra soggetti da immettere in particolari
collettività o negli individui addetti a particolari
lavorazioni.
ACCERTAMENTO DIAGNOSTICO
tappe
1) PRELIEVO
2) TRASPORTO
3) ESAME MACROSCOPICO
4) ESAME MICROSCOPICO
5) ESAME COLTURALE
5a) ANTIBIOGRAMMA
6) PROVA BIOLOGICA
1) PRELIEVO
2) TRASPORTO
3) ESAME MACROSCOPICO
4) ESAME MICROSCOPICO
5) ESAME COLTURALE
5a) ANTIBIOGRAMMA
6) PROVA BIOLOGICA
1) PRELIEVO
2) TRASPORTO
3) ESAME MACROSCOPICO
4) ESAME MICROSCOPICO
5) ESAME COLTURALE
5a) ANTIBIOGRAMMA
6) PROVA BIOLOGICA
1) PRELIEVO
2) TRASPORTO
3) ESAME MACROSCOPICO
4) ESAME MICROSCOPICO
5) ESAME COLTURALE
5a) ANTIBIOGRAMMA
6) PROVA BIOLOGICA
ACCERTAMENTO DIAGNOSTICO
ESAME MICROSCOPICO
• A fresco
- stratto sottile
- goccia pendente
• Dopo colorazione
- coloraz. dirette
- coloraz. indirette
- coloraz. semplici
- coloraz. differenziate
- coloraz. doppie
ESAME MICROSCOPICO
• A fresco
- stratto sottile
- goccia pendente
• Dopo colorazione
- coloraz. dirette
- coloraz. indirette
- coloraz. semplici
- coloraz. differenziate
- coloraz. doppie
Trichomonas vaginalis
Dopo colorazione
- coloraz. dirette
- coloraz. indirette
- coloraz. semplici
- coloraz. differenziate
- coloraz. doppie
Fucsina basica
Stafilococchi
Streptococchi
Diplococchi G -
Escherichia coli
Micobatteri
ACCERTAMENTO DIAGNOSTICO
Differenziato in relazione a:
- microrganismi sospettati
- materiale clinico
- sede dell’infezione
TERRENI DI COLTURA
Stato fisico
- liquidi
- solidi
- solidificabili
- solidificati
Finalità
- di arricchimento
- di isolamento
- di identificazione
- selettivi
- elettivi
ESAME COLTURALE
TERRENI DI COLTURA
Finalità
- di arricchimento
- di isolamento
- di identificazione
- selettivi
- elettivi
Agar sangue
Agar
TAPPE TRADIZIONALI
arricchimento
selettivo
isolamento
identificazione
biochimica
P.C.R.
10
9
11
10
12
11
? ??
sierotipizzazione
REAZIONE DELLA POLYMERASE CHAIN REACTION.
SEQUENZA DELLE TAPPE ENZIMATICHE
a
a
b
0. DNA nativo
b
1. Denaturazione
a
2. Appaiamento innesco
a
3. Estensione innesco
a’
a
a’
a
a’
a
a’’
a’
b’
b
b’
b
b’
b
b’
b’
a’
a’
a
b
a’
a’’
b
b’’
b
b’
b’
b’’
Fase 0: i due filamenti del DNA nativo risultano appaiati l’uno all’altro nella normale
condizione di doppio filamento.
Fase 1: il DNA denatura dissociandosi nei singoli filamenti a e b.
Fase 2: la temperatura si abbassa e i primer si accoppiano con i rispettivi filamenti.
Fase 3: estensione dell’innesco nella direzione 5’-3’ per entrambi i filamenti
Bande
sequenza target
Controllo negativo
Controllo positivo
Campione negativo
Campioni positivi
Applicazioni pratiche: diagnosi di meningite da Listeria monocytogenes
TOTALE
n° 145 pz. nell’arco di tempo 2000-2007
Terapia meningite
Ampicillina
Cloramfenicolo
Aciclovir
rachicentesi
Colonna vertebrale
Amplificazione DNA
Estrazione DNA
• 15’ 98 °C
• kit Qiagen
LIQUOR
test di
agglutinazione
al lattice
PCR
Sensibilità della PCR convenzionale
M
1x106 1x105 1x104 1x103 1x102
10
Primers specifici gene hlyA (listeriolisina O)
(5’- CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3’
5’-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3’)
Curva di taratura in funzione della densità ottica delle
bande elettroforetiche
Sensibilità della PCR Real-Time
Diluizioni seriali di DNA di Listeria monocytogenes, equivalenti a 3 x 105
( ), 3 x 104 ( ), 3 x 103 ( ), 3 x 102 ( ), 60 ( ), 30 ( ), 15 ( ), CFU .
monitoraggio terapia antibiotica
PCR convenzionale
PCR Real-Time
M
K+
K+
0 gg
15 gg
30 gg
55 gg K-
0 15 30 55 giorni
234 bp
TECNICHE DI CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI MICRORGANISMI
ANALISI R.F.L.P.
P.C.R.
Mlu I
Alu I
Hinf I
Dde I
Sau 3A
DIGESTIONE CON ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE (PCR - RFLP)
M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4
E.R.: HinfI
E.R.: MluI
1
2 3
4
E.R.: AluI
M: Peso molecolare st. (pBR322 Hae III digest)
PCR R.A.P.D.
5’-AACGCGCAAC-3’
5’-AAGAGCCCGT-3’
Cellule
batteriche
Cellule +
agarosio
P.F.G.E.
Agarosio +
DNA genomico
RESTRIZIONE
Not I
LISI
Nru I
P.F.G.E.
EPISODIO TOSSINFETTIVO ALIMENTARE
Caratterizzazione molecolare di Salmonella enteritidis mediante P.F.G.E.
N. stipite
M
1
4
5
6
13
18
21
22
26
34
15
17
19
35
Restrizione
con
XbaI
pattern 1
pattern 2
pattern 3
37
M
FREQUENZA DI ISOLAMENTO DEI SIEROTIPI DI SALMONELLA
ISOLATI IN SARDEGNA NEGLI ULTIMI 7 ANNI
(2000-2007)
altre
typhimurium
28,5%
33,2%
london
0,7%
infantis
1%
hindmarsh
1,2%
muenchen
1,3%
derby
1,6%
enteritidis
bredeney
1,6%
infantis
1%
4,5,12:i:2,5%
26,6%
CLUSTER ANALYSIS DEI PATTERN DI
SALMONELLE 4,5,12:i:- OTTENUTI CON PFGE
Pattern
1
Pattern
2
CLUSTER ANALYSIS DEI PATTERN PFGE
DI SALMONELLE 4,5,12:i:- E TYPHIMURIUM
Pattern 1
Pattern 2
4013
401a
3992
4010
4091
4100
4101
393a
3965
4112
406a
Ty373a
Ty3861
3986
4001
Ty322a
Ty3834
Ty329a
Ty3798
Ty315a
ty340a
Ty392a
Ty3696
Ty3802
3958
403a
391a
CLUSTER ANALYSIS DEI PATTERN PFGE DI SALMONELLE
4,5,12:i:- ED ALTRI SEROVAR
4013
401a
3992
4010
4091
4100
4101
393a
3965
4112
406a
Ty373a
Ty3861
3986
4001
Ty322a
Ty3834
Ty329a
Ty3798
Ty315a
Ty340a
Ty392a
Ty3695
Ty3802
3958
403a
391a
S. branderup
S. enteritidis PT6a
S. hadar PT11
S. infantis
S. enteritidis PT4
S. london
PCR based RAPD fingerprinting degli stipiti di P. aeruginosa
isolati dall’acqua, dai pazienti e dal personale.
a
c
q
u
a
M: marker 100 bp ladder
11: stanza di lavaggio
12: stanza di degenza 1
13: stanza di degenza 2
1: stanza di medicazione
2: cucina
8: antibagno
10: bagno
4: stanza di degenza 2
5: stanza di degenza 3
p
a
z
i
e
n
t
i
M
11 12 13 1
2
8
10 4
5
A
B
bp
A
900
800
700
60
0
500
B
400
C
300
D
200
E: personale assistenza
100
Profilo di macrorestrizione (PFGE) dei due stipiti di P. aeruginosa
risultati filogeneticamente simili con la RAPD.
M
674 Kb
M: marker
5: acqua, degenza 3
paziente B
361 Kb
208 Kb
5
B
C D
E
TEST DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI
METODO DELLA DILUIZIONE IN BRODO
M.I.C.
Numero provetta:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
50
25
12,5
6,25
3,12
1,6
0,8
0,4
controllo
Concentrazione di antibiotico
µ g/ml
DETERMINAZIONE DELLA M.C.B.
50
25
12,5
6,25
M.I.C.
M.C.B.= 25
µg/ml
3,12
1,6
0,8
0,4
controllo
TEST DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI
METODO DELLE MICRODILUIZIONI IN BRODO
1
A
B
µg/ml
C
D
E
2
3
4
5
6
ANTIBIOTICO
TEST DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI
METODO DI KIRBY-BAUER
AMC
CTX
PIP
Diametro aloni (mm)
METODO DI KIRBY-BAUER.
E - TESTS
256
0,016
Zone di inibizione ellettiche intorno alle strisce
impregnate di antibiotico. La M.I.C. viene letta
sulla scala riportata nella striscia.
ANTIBIOGRAMMA CON METODO
SEMIAUTOMATICO (ATB)
0,5 McF
Identificazione
biochimica
3 McF
Suspension Medium / NaCl 0,85 % Medium
ATB Medium
• 18 / 24 ore
• 37 °C
• O2 / O2
ATB
ATB
S
R
I
R
S
File: C:\Program Files\Biotech\ALFwin\home\helicobacter pylori\327a#07.seq
Analyzed by: Andrea Piana - Helicobacter pylori
Run: training
Method: ReadyMix.cbk
Date: 98-04-22
Clone 7: Clone07-105 - 10pmoli
C:\Program Files\Biotech\ALFwin\home\helicobacter pylori\327a#07.seq Length: 486 May 21, 2001 11:37 Type: N
Check: 9612 ..
1 AGATGGGAGC XGTCTCAACC AGAGATTCAG TGAAATTGTA GTGGAGGTGA
51 AAATTCCTCC TACCCGCGGC AAGACGGAAA GACCCCGTGG ACCTTTACTA
101 CACTAGCACH GCTAATGGGA ATATCATGCG CAGGATAGGT GGGAGGCTBT
151 GAAGTAAGGG CTTBGGCXCT TATGGAGCCA TCCTTGDRRX ACCACCCTTG
201 ATGTTTCTGT TAGCTAACTG GXCTGTGTTA TCCACAGGCA GGACAATBCT
251 TBGTGGGTAG TTTGACTGGX GCGGTCGCCT CCTARAAAGT AACGGAGGCT
301 BXCAAAGGTT GGCTCATTGC GGTTGGAAAT CGCAAGTTGA GTGTAATGGC
351 ACAAGCCAGC CTGACTGTAA GACATXBAAG TCAAGCAGAG ACGXVAgTCG
401 GTCATAGTGA TCCGGTGGTT CTGTGTGGAA GGGCCATCGC TCAAAGGATA
451 AAAGGKKACC CCGGGGATAA CAGGSBTGAT CTCYCC
WILD TYPE -----MUTATION A2143G --------MUTATION A2144G ---------
CGGAAAGAC
CGGGAAGAC
CGGAGAGAC
Strain 327
Mutation A2143G
Strain 105
A---->G
wild type
96 97
A G
98 99 100
A C G
101 102
G A
103 104 105106
A A
G A
107 108109110 111
C
C C C
G
Bases
T
70
C
71
A
72
A
73
G
74
A
75
C
76
G
77
G
78
G
79
A
80
A
81
G
82 83
A C
84 85
C C
86
C
87 Bases
G
T
Strain 168
Strain 112
Mutation A2144G
heterozygote
A---->G
A e/o G
95
A
G
A
C
G
100
G
A
G
A
G
105
A
C
C
C
C
110
G T
G
Bases
G G
71
A
72
G
73
A
74
C
75
G
76
G
77
R
78
A
79
A
80
G
81
A
82
C
83 84
N C
85
C
86
G
87 88
T G
Bases
G
MUTATION 2143 A------>G
ENZYME Bbs I
5’...GAAGAC...3’
Recognition site
3’...CTTCTG...5’
MW 1
2
MUTATION 2144 A------>G
ENZYME Bsa I
3
Recognition site
4
MW: 100 bp DNA ladder;
(pb) MW
700
800
1: strain 99, mutation A2143G;
600
700
2: strain 325, mutation A2143G;
600
3: strain 327, mutation A2143G;
500
4: strain 330, mutation A2143G;
(pb)
500
400
5: strain 112, mutation A2144G;
400
6: strain 114, mutation A2144G;
7: strain 198, mutation A2144G;
300
300
5’...GGTCTC...3’
3’...CCAGAG...5’
5
6
7
SCELTA DELL’ANTIBIOTICO
SENSIBILE
INTERMEDIO
RESISTENTE
ANTIBIOTICO
• Dosaggio
• Ritmo di somministrazione
• Via di somministrazione
• Cinetica
• Tossicità
• Attività battericida
• Costo
PAZIENTE
• Età
• Integrità difese spec. ed aspec.
• Funzionalità emuntori
• Altre patologie
INFEZIONE
• Tipo
• Localizzazione
ACCERTAMENTO DIAGNOSTICO
INDIRETTO
• Ricerca ed eventuale dimostrazione di una risposta da parte
dell’organismo all’ingresso di microrganismi o più in generale di
agenti patogeni
• In genere si cercano, nel siero del malato, gli Ac specifici contro Ag
del microrganismo sospettato
• Specifica, rapida, semplice ed indispensabile nel caso in cui vi sia
difficoltà ad eseguire l’accertamento diagnostico diretto
• Importante stabilire, oltre la presenza, la quantità (titolo anticorpale)
per seguire l’evoluzione della malattia (infezione in atto, pregressa,
vaccinazione)
