EPATITE B
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO
HBV-HCV-HIV
Epatite B
L’interesse scientifico per il virus dell’epatite B (HBV) e le sue
manifestazioni cliniche negli ultimi anni è stato notevolmente alimentato dai
significativi progressi intervenuti nella diagnosi e nella terapia.
VIRUS DELL’EPATITE B
Il virus dell’epatite B è l’unico Hepdnavirus di intesse medico, ed è
specifico per la specie umana.
La particella virale completa o particella di Dane è una particella sferica del
diametro di 42 nm, composta da un involucro esterno Lipoproteico
(envelope) che circonda un nucleocapside di 18nm di diametro.
Screening sierologico e molecolare per HCV
16,4 milioni di donazioni; 1.652 positivi
HCV NAT
Anti-HCV
N.
+
+
1166
+
-
10*
-
+
476
-
-
0
* 7 WP, 1 ALT, 1 anti-HBc+
S. Laperche, TSIC Wiesbaden, 18-19 giugno 2008
I VIRUS RESPONSABILI DELL’AIDS
Agli inizi degli anni 80, la segnalazione di focolai di polmonite mortale da
Pneumocystis carinii associata a segni evidenti di compromissione del
sistema immunitario, in giovani adulti, per lo più maschi omosessuali portò,
negli USA, alla identificazione della Sindrome, oggi nota come “immuno
deficienza acquisita”, ed al sospetto che un agente infettante, a trasmissione
sessuale, potesse esserne la causa.
Oggi sono noti due virus responsabili della sindrome da immuno-deficienza
acquisita: HIV-1 e HIV-2.
HIV- 1 è diffuso in tutto il mondo.
HIV-2
è diffuso prevalentemente in Africa occidentale, caraibi e America
Meridionale, ed è meno virulento e provoca una malattia a decorso
più attenuato.
HIV GENOMA
Come tutti i retrovirus possiede tre geni fondamentali per la sua replicazione:
Gag- codifica per le proteine del
core del virione (p24, p17, p9, p7)
Da Pol derivano la
Trascrittasi Inversa
le proteasi
integrasi
Env codifica per le proteine
dell’involucro esterno (gp120, gp 41)
Oltre a questi geni, HIV possiede altri sette geni accessori che hanno funzione
regolatorie del ciclo virale e della sintesi proteica.
Schema dell’organizzazione del genoma del “provirus” di HIV-1 ed HIV-2
Le proteine Vif e Vpr sono proteine accessorie che vengono incorporate nel
virione maturo di cui sembra favoriscano l’infettività.
Vpu e Nef sono proteine con funzione “regolatrice”sul ciclo di replicazione virale
Vpu interviene nella maturazione e liberazione del virus.
CICLO VIRALE DI HIV
Sia HIV-1 che HIV-2 sono in grado di infettare le cellule che presentano sulla
loro membrana il recettore CD4.
La molecola CD4 è presente:
Linfociti T- helper
Su alcuni monociti (sangue periferico)
Nei macrofagi tessutali
Nelle cellule dendritiche follicolari (linfonodi)
Nelle cellule della microglia dell’encefalo
Nelle cellule dendritiche della cute-mucosa.
Ai fini dell’ingresso nella cellula CD4 da solo è insufficiente e il virus si deve
legare a un co-recettore.
I due tipi principali di co-recettore sono CCR5 e CXCR4, entrambi sono
espressi sulla superficie dei linfomonociti CD4(+) del sangue periferico, il che
spiega la loro sensibilità all’infezione.
La contemporanea interazione tra gp120 da un lato, e CD4 e co-recettore
dall’altro, provoca una serie di alterazioni conformazionali nella glicoproteina
dell’antirecettore che si traducono nella fusione dell’envelop virale con la
membrana della cellula e la liberazione nel citoplasma cellulare del
nucleocapside virale.
RETROTRASCRIZIONE: conversione del RNA del genoma virale in DNA
(definito provirus ), segue l’integrazione del provirus nel genoma della cellula.
Il genoma provirale consente l’attacco della RNA polimerasi II cellulare e
l’avvio del processo trascrittivo con formazione del RNA genomico ed mRNA.
VARIABILITA’ DEL GENOMA HIV
Una delle più evidenti caratteristiche del genoma di HIV è rappresentata dal
notevole grado di variabilità dimostrabile tra diversi stipiti virali da diversi
individui o, addiritura, tra gli stipiti virali isolati dallo stesso individuo in
diversi momenti dell’infezione.
La variabilità genomica di HIV-1 è rilevante per diversi aspetti della biologia
del virus, che vanno
Dal tropismo di cellula o tessuto
Al tipo di manifestazioni cliniche indotte
Virulenza
Suscettibilità alla risposta immune dell’individuo
Le sequenze che sono soggette a variazioni notevoli sono “env” e “nef”
mentre “gag” e “pol” sono più conservate. Si suppone che le proteine
codificate da gag e pol debbano mantenere la struttura-funzione del
Virus,mentre le proteine codificate da env cambiano per eludere la risposta
immune dell’organismo. La gp 120contiene epitopi in grado di evocare la
risposta immunitaria anticorpi neutralizzanti (la sua variazione elude la
risposta immunitaria.)
In alternativa è noto che la RT commette molti errori nell’incorporazione delle
basi.
TIPI E SOTTOTIPI Per HIV-1 esistono 3 gruppi
M (Major)con 9 sottotipi (A-K) sono in relazione all’area geografica.
O (outlayer) con 5 sottotipi
N (non M – non O )con pochi sottotipi
Per HIV-2 sono descritti 8 sottogruppi ( A-H) e nessun sottotipo
PATOGENESI DELL’AIDS
Infezione primaria: può essere asintomatica o, più frequentemente dopo un
periodo di incubazione di 3 – 6 settimane si traduce in una malattia acuta con
febbre che si esaurisce spontaneamente nel giro di alcuni giorni, quindi
difficile da diagnosticare.
L’infezione si accompagna ad un elevato titolo di viremia nel sangue
periferico e nel giro di 1 settimana massimo 3 mesi si produce una intensa
risposta immunitaria che provoca una notevole riduzione della viremia.
Il decorso dell’infezione da HIV
Successivamente il virus viene sequestrato nei linfonodi soprattutto all’interno
delle cellule dendritiche follicolari.
Inizia così la FASE DI LATENZA CLINICA che non coincide con la latenza
virale (nei linfonodi continua la replicazione virale) che si accompagna alla
liberazione di virus e prodotti virus specifici che determinano lesioni
fondamentali.
Anche in assenza di manifestazioni cliniche evidenti, infatti, i soggetti infetti da
HIV-1 presentano un progressivo calo nel numero dei linfociti CD4+ circolanti.
La sintomatologia inizia con lo stadio LAS (lynphoadenopatic syndrome )
Subito dopo inizia lo stadio ARC (AIDS-related complex) che si accompagna ad
un
ulteriore
diminuzione
dei
linfociti
T-helper,
anemia
e
ipergammaglobulinemia.
Inizio della fase AIDS conclamata in cui il virus, non è più contenuto dalla
reazione linfonodale.
Evoluzione immunologica
dell’infezione da HIV
DIAGNOSI SIEROLOGICA DELL’INFEZIONE DA HIV
L’infezione da HIV è seguita dalla costante e progressiva replicazione del
virus in una serie di organi bersaglio ed è destinata a sfociare nella
definitiva compromissione del sistema immunitario e nella comparsa di
sintomatologia clinica.
La sieropositività ossia la rilevazione di anticorpi specifici per HIV nel siero
del soggetto, consente di confermare la diagnosi di infezione in atto.
I test per la diagnosi di infezione da HIV servono per:
1) Identificare i soggetti siero-positivi per una terapia antivirale
precoce
2) Identificare i portatori che possono trasmettere l’infezione ad altri
soggetti (es. donatori di sangue, donne in gravidanza)
3) Per seguire il decorso della malattia e confermare la diagnosi
4) Valutare l’efficacia della terapia.
TEST DI SCREENING (2Marzo 1985)
Le soluzioni ottimali per un test di screening sono:
1) Rilevazione degli anticorpi
2) Rilevazione dell’antigene
3) Utilizzare Ag ricombinanti di grandi dimensioni
4) Rilevazione del “cluster” lineare di gp 41
5) Impiego di struttura tridimensionale di p24 Ag
6) Rilevazione equivalente dei vari sottotipi
7) Sensibilità
8) Specificità
Test HIV di 1a generazione
Indirect anti-human assay format EIA
Plasma/Serum
Sample
Bead
+
HIV-1 Viral Lysate
Bead
Enzyme Conjugate
Enzyme conjugated
anti-human IgG
Substrate
Detection of
anti-HIV-1 IgG
Test HIV di 2a generazione
Indirect anti-human assay format EIA
Plasma/Serum
Sample
Bead
+
Recombinant HIV-1
(& HIV-2)
proteins/peptides
Bead
Substrate
Enzyme Conjugate
Enzyme conjugated
anti-human IgG
• Migliore sensibilità e specificità
• Anticorpi contro il nuovo virus HIV-2 (scoperto nel 1986)
• Solo il 51-93% delle infezioni da HIV-2 rilevate dai test anti-HIV-1
Detection of
anti-HIV-1 IgG
Test HIV di 3a generazione
Direct (sandwich) assay format EIA or CMIA
Plasma/Serum
Sample
Microparticle
Microparticle
+
Substrate
or H2O2
Enzyme Conjugate
Recombinant HIV-1
(& HIV-2)
proteins/peptides
Enzyme or acridinium
conjugated to
recombinant HIV-1/2
proteins/peptides
• Rileva tutte le classi di immunoglobuline (IgG, IgM, IgA)
• Migliore sensibilità in sieroconversione, maggiore specificità
• Inclusione di antigeni di HIV-1 gruppo O (metà anni ’90)
Detection of
anti-HIV-1
IgM & IgG
Infezione da HIV – IgM e IgG
anti-HIV IgG
anti-HIV IgM
Test HIV di 4a generazione (Ag/Ab Combo)
Direct (sandwich) assay format EIA or CMIA
Plasma/Serum
Sample
Microparticle
Microparticle
+
Substrate
or H2O2
Detection of
anti-HIV-1
IgM & IgG
Enzyme Conjugate
Recombinant HIV-1/2
proteins/peptides
& anti-p24 antibodies
p24
Enzyme or acridinium
conjugated to
recombinant HIV-1/2
proteins/peptides
& anti-p24 antibodies
• Rileva tutte le classi di immunoglobuline (IgG, IgM, IgA)
• Rileva p24 di HIV-1/2/O
• Migliore sensibilità in sieroconversione rispetto ai test per soli anticorpi
Infezione da HIV: chiusura del periodo “finestra”
con i diversi test sierologici e molecolari
HIV-RNA (plasma)
Ag p24
EIA 4° generazione
EIA 3° generazione
EIA 2° generazione
EIA 1° generazione
0
10
20
30
40
50
60
Giorni dopo l'esposizione
70
80
ALGORITMO PER LA DIAGNOSI DI HIV
Test HIV
Combo
Negativo
Reattivo
STOP
Western blot
Positivo
Negativo
Infezione da HIV
Test per p24
o HIV-RNA
Negativo
(falso positivo)
Positivo:
Infezione da HIV
Attualmente in Italia non c’è consenso sulle linee guida da seguire per la
diagnosi dell’infezione da HIV
Ann.Ist Super Sanità 2010 Vol.46. N°1:34-4
SUGGESTED STRATEGIES FOR THE LABORATORY DIAGNOSIS OF
HIV INFECTION IN ITALY
In Italy there are not consensus guidelines for the diagnosis of HIV infection
in individuals who wish to know their HIV serostatus.
At the present, each laboratory/hospital is generating its own standard
operating procedures, including diagnostic algorithms.
Nel 2008 l’AMCLI aveva proposto un percorso diagnostico per la diagnosi di
infezione da HIV.
Sostanzialmente questo percorso prevede in caso di positività del test di
screening la ripetizione del test di screening con un secondo metodo che
abbia almeno la sensibilità di quello precedente.
Nello stesso periodo sono uscite le linee guida della Regione Piemonte DD
n°189 del 19 Luglio 2007 che prevede:
Raccomandazioni principali
anonimato, qualora l’utente ne faccia richiesta.
ticket, esenzione
impegnativa, medico di base o richiesta interna.
Test sierologico per gli anticorpi
utilizzo di test immunometrici di quarta G. e p24
i risultati positivi devono sempre essere confermati con W.B.
risultato indeterminato eseguire ? Ricerca di HIV RNA
l’utente può essere sottoposto a più prelievi.
il laboratorio deve lavorare su provetta madre
il laboratorio deve usare un CQI giornaliero
il laboratorio deve partecipare a un VEQ regionale o nazionale o inter.
REFERTAZIONE DEL TEST
il referto va consegnato solo all’interessato
entro una settimana massimo
il risultato deve contenere anche le informazioni sul metodo
il risultato di positivo può essere consegnato solo dopo conferma W.B.
il laboratorio se non esegue il test di conferma lo deve inviare presso
un centro di riferimento
PROCEDURA DI LAVORO
test di screening di 1°livello
se reattivo ripetizione del test con un altro metodo
su campioni reattivi o dubbi eseguire W.b.
risultati concordemente positivi, richiamare il soggetto per un secondo
prelievo sul quale eseguire solo test di screening, in caso di
conferma,consegna del referto con counselling post test e invio del
soggetto presso centro di M.I.
in caso di risultati discordanti inviare il campione presso un centro
di riferimento per l’esecuzione dell’ HIV RNA, in caso di sospetta
infezione inviare il soggetto presso un centro di M.I.
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Risultato negativo
risultato negativo ma se si sospetta una esposizione recente il pz. va
inviato al centro di M.I.
Risultato positivo
presenza di infezione
Risultato indeterminato
ripetere la sierologia a distanza di un mese dal primo prelievo
RISULTATI FALSI-POSITIVI e FALSI-NEGATIVI
CON I TEST DI SCREENING
Falsi positivi
infezioni acute
autoimmunità
gravidanza
trasfusioni multiple
immunizzazione recente contro il virus influenzale
manipolazione impropria del campione.
Falsi negativi
infezione recente (periodo finestra)
ipogammaglobulinemia
infezione allo stadio avanzato (raro)
sierotipo di HIV-1 raro (es. gruppo O )
