13. Regolazione dellespressione genica
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Controllo dell’espressione genica Corso di Genetica per Scienze per l’Ambiente e la Natura Alberto Pallavicini Perchè controllare l’espressione genica? L’intero complemento genico all’interno di una singola cellula rappresenta una quantità enorme di informazione biologica. Parte è necessaria in ogni momento (rRNA- housekeeping genes). Molti geni invece hanno un ruolo molto più specializzato e la loro informazione biologica viene richiesta dalla cellula solo in determinate circostanze. Tutti gli organismi sono pertanto capaci di regolare l’espressione dei loro geni. La regolazione genica in E. coli La regolazione genica permette ad un batterio di rispondere a cambiamenti ambientali. Un esempio viene fornito da quei geni batterici che sono coinvolti nell’utilizzazione di diversi zuccheri come fonte di carbonio e di energia. E. coli possiede una varietà di enzimi che permettono alla cellula di utilizzare vari zuccheri. Quali enzimi sono richesti in un determinato momento dipende da quali zuccheri siano disponibili nell’ambiente. Perchè non produrre sempre tutti gli enzimi? Spreco energetico... Regolando l’espressione genica i batteri sono in grado di adattarsi rapidamente alle condizioni ambientali ma senza spreco di energia. I geni inducibili La regolazione genica negli eucarioti Al livello più basilare, la regolazione genica riesce ad ottenere lo stesso risultato sia nei batteri che negli eucarioti: permette ad una cellula di modificare le sue capacità biochimiche. In realtà negli eucarioti esiste un livello maggiore di sofisticazione per quello che riguarda i segnali che influiscono sull’espressione genica. Le cellule eucariotiche possono rispondere ad una più vasta gamma di stimoli di regolazione. Alcuni geni eucariotici vengono regolati durante lo sviluppo. La regolazione genica negli organismi pluricellulari porta come conseguenza ad un specializzazione cellulare. Possibili meccanismi di controllo dell’espressione genica Il controllo dell’espressione genica è essenzialmente il controllo sulla quantità del prodotto genico che dev’essere presente all’interno della cellula. Questa quantità è un equilibrio fra due fattori: la velocità di sintesi e la velocità di degradazione. Il risultato di questo equilibrio è una diversa concentrazione all’equilibrio per ciascun prodotto genico all’interno della cellula. La regolazione di questo equilibrio si basa essenzialmente sulla velocità di sintesi del prodotto genico. Come può venire regolata la velocità di sintesi? Possibili meccanismi di controllo dell’espressione genica •La trascrizione. Se il numero dei trascritti che vengono sintetizzati nell’unità di tempo cambia, cambierà anche la quantità del prodotto genco che viene sintetizzato. •Il catabolismo dell’mRNA. Se le molecole di mRNA vengono degradate prima che possa avvenire la traduzione, la sintesi del prodotto genico sarà limitata, se si diminuisce il livello di degradazione ci sarà più prodotto genica. •Il processamento dell’mRNA. Nel caso della maggior parte degli mRNA eucariotici, eventi del processamento (cap, polyA e splicing) sono prerequisiti per la traduzione. •Traduzione. Vi deve essere un controllo sui numeri dei ribosomi o sulla velocità di traduzione. Controllo dell’espressione genica nei batteri La base per la nostra comprensione di come i batteri regolino l’espressione dei loro geni venne fondata da Jacob e Monod in una pubblicazione del 1961 che è considerata un classico dell’analisi sperimentale e della logica deduttiva. Jacob e Monod basarono le loro ipotesi sulla complessa analisi genetica dell’utilizzazione del lattosio da parte di E. coli e descrissero un elegante sistema di regolazione che solo successivamente è stato confermato in tutti i dettagli. Regolazione dell’utilizzazione del lattosio Il lattosio è un disaccaride composto da una molecola di glucosio legata ad una molecola di galattosio. Per poter utilizzare il lattosio una cellula di E. coli deve trasportare le molecole di lattosio all’interno della cellula e successivamente spezzare le molecole in galattosio e glucosio. Queste reazioni vengono catalizzate da tre enzimi: la lattosio permeasi, che trasporta il lattosio; la β-galattosidasi che idrolizza il legame; la β-galattoside transacetilasi di cui in realtà non si conosce a fondo la funzione. Normalmente questi enzimi sono quasi assenti nella cellula di E. coli ma in presenza di lattosio la quantità aumenta di 1000 volte in breve tempo ed in maniera coordinata. I geni per l’utilizzazione del lattosio formano un operone. I tre geni implicati nell’utilizzazione del lattosio vengono chiamati: lacZ (β-galattosidasi), lacY (permeasi) e lacA (transacetilasi). Questi geni sono associati nel genoma e formano un operone; ciascuno viene trascritto nella stessa molecola di mRNA. I geni per l’utilizzazione del lattosio formano un operone. I geni per l’utilizzazione del lattosio formano un operone. Con tecniche di analisi genetica identificarono i geni lacZ, lacY e lacA. Inoltre scoprirono un ulteriore gene lacI. Questo gene si trova a monte dei geni lac ma non fa parte dell’operone. Il prodotto genico di lacI è strettamente associato all’utilizzazione del lattosio ma non è un enzima richiesto per l’ingresso o la degradazione. I geni per l’utilizzazione del lattosio formano un operone. Il prodotto di lacI regola l’espressione degli altri tre geni, se lacI viene inattivato per mutazione l’operone lac risulta attivato in maniera costitutiva. La terminologia adottata da Jacob e Monod è ancora utilizzata: lacZ, lacY e lacA sono geni strutturali, mentre lacI è un gene regolatore. Il prodotto genico di lacI è una proteina capace di legarsi alla molecola di DNA di E. coli ad un sito nel promotore per l’operone lac e l’inizio del gene lacZ. Questo sito di attacco viene chiamato operatore. Il repressore del lattosio Il repressore del lattosio Di fatto l’operatore si sovrappone al promotore, in questo modo la trascrizione è bloccata. L’allolattosio è l’induttore della trascrizione. Infatti il repressore lac può legarsi anche a questa molecola. Esiste sempre un certo livello di trascrizione così qualche molecola dell’operone viene tradotta. In questo modo se nell’ambiente si trova lattosio alcune molecole possono entrare. Si formerà allolattosio che legherà il repressore, il complesso repressore-allolattosio si dissocia dalla molecola di DNA, permettendo alla RNA polimerasi di localizzare il sito promotore. Il repressore del lattosio Il repressore del lattosio L’allolattosio agisce come induttore dell’operone. Gli enzimi trascritti esauriranno la quantità di lattosio disponibile. Il legame tra il repressore e lo zucchero è una reazione all’equilibrio. Quando cala la concentrazione di lattosio libero il numero di complessi repressore-allolattosio diminuirà. Il repressore libero riprenderà la sua conformazione e si legherà nuovamente all’operatore. Gli effetti delle mutazioni sui geni. L’analisi di Jacob e Monod sull’operone lac è un ottimo esempio della maniera in cui le mutazioni vengono utilizzate per la ricerca genetica. Una mutazione è un’alterazione della sequenza nucleotidica di una molecola di DNA. Se una mutazione avviene all’interno di un gene potremo avere un’alterazione della sequenza aminoacidica della proteina codificata dal gene. Effetti delle mutazioni del gene lacOc Effetto cis-dominante della mutazione lacOc in un ceppo diploide parziale. Effetti delle mutazioni del gene lacOc Effetti delle mutazioni del gene lacI Effetti delle mutazioni del gene lacI Effetti delle mutazioni del gene lacI Il glucosio reprime l’operone lac. Se la cellula ha una fonte sufficiente di glucosio per le sue necessità energetica, questa cellula non avrà bisogno di metabolizzare il lattosio. Questo meccanismo viene chiamato la repressione da catabolita e coinvolge una seconda proteina regolatrice, la proteina attivatrice del catabolismo (CAP) e un secondo sito di legame a monte, il sito CAP. La CAP si lega al sito CAP solo in presenza di AMP ciclico (cAMP) un nucleotide modificato per mezzo dell’adenilato ciclasi. Il glucosio reprime l’operone lac. Controllando la quantità di cAMP all’interno della cellula il glucosio può regolare indirettamente il legame del complesso CAPcAMP al sito CAP. Il glucosio inibisce la sintesi di cAMP inibendo l’adenilato ciclasi. Infatti quando il complesso è legato al sito CAP stimola il legame dell’RNA polimerasi al promotore e pertanto stimola anche la trascrizione dell’operone lac. Quando il sito CAP non è occupato, l’operone viene trascritto solamente a bassa frequenza, anche se fosse presente il lattosio e il repressore lac non sarebbe legato all’operatore. Regolazione espressione genica eucarioti Siti a monte e proteine che si legano al DNA Il gene per la metallotioneina umana. Esempio per illustrare il ruolo dei siti a monte dei geni e le proteine che si legano al DNA nella regolazione genica degli eucarioti. La metallotioneina è una proteina che protegge le cellule da effetti tossici dovuti ai metalli pesanti, quali il cadmio. Nove sono i siti coinvolti nell’espressione del gene per la metallotioneina, divisibili in quattro gruppi: 1. Il TATA box. Questo è il sito al quale l’RNA polimerasi II si lega la DNA. 2. Gli elementi a monte del promotore (UPE). Gli esempi più comuni sono il GC box e il CAAT box Siti a monte e proteine che si legano al DNA 3. Siti enhancers (di attivazione) costituiscono anch’essi degli elementi di attivazione della trascrizione, ma contengono sequenze di DNA più lunghe che gli UPE e contengono siti di legame per un certo numero di proteine. 4. Elementi di risposta transiente. Un sito di risposta transiente attiva la trascrizione in maniera temporanea, in risposta ad uno stimolo esterno della cellula. Le proteine che si legano al DNA Sia nel caso dei procarioti che degli eucarioti è stato più facile identificare i siti a monte di un gene, che studiare le proteine leganti il DNA che si attaccano a questi siti. Solo dall’inizio degli anni 90 quest’area di ricerca ha progredito più rapidamente. Possiamo riconoscere tre classi principali di proteine che interagiscono con il DNA. a) Motivo a Zinc finger. Sono chiamati così perche la struttura assomiglia a dita sporgenti dalla proteina. Caratteristicamente dua aa cisteina e dua istidina sono posizionati in modo da legare una molecola di zinco. Le proteine che si legano al DNA b) Motivo a Leucine Zipper. Le proteine con leucine zipper sono dimeri con ciascun dominio leucine zipper consistente di due regioni ad elica. Il nome deriva dalle presenza di leucine (L) ad ogni settima posizione. c) Motivo helix-turn-helix. In questa struttura due eliche α sono separate da quattro aminoacidi, in modo che la catena polipeptidica abbia una brusca curvatura. Gli aminoacidi delle due eliche prendono il contatto con il DNA. Le proteine che si legano al DNA La regolazione dei geni durante lo sviluppo Uno dei principali problemi ancora irrisolti dai genetisti è quello di colmare la lacuna concettuale fra il comprendere come venga regolato un gene individuale e comprendere come sia controllata una funzione biologica complessa. Il problema più importante e più difficile è quello di capire come sia regolata la serie programmata di cambiamenti che conducono dall’uovo fecondato all’essere umano adulto. Identificazione dei geni associati allo sviluppo Si capisce facilmente come trovare l’informazione biologica che una determinata proteina sia una β-galattosidasi ma come comprendere che un gene determini la funzione: “fai crescere una gambo in questo punto, fallo adesso”? Mutanti di sviluppo nella Drosophila Tra i tanti mutanti di Drosophila che sono stati scoperti, ve ne sono molti nei quali lo sviluppo stesso del moscerino è completamente alterato. Un esempio sorprendente viene fornito da Antennapaedia che causa la crescita delle zampe invece di antenne. Questo tipo di mutazione che causa la trasformazione di una parte del corpo in un’altra viene detta omeotica. Identificazione dei geni associati allo sviluppo Alla fine degli anni 70 con la capacità di isolare e caratterizzare la sequenza genica si scoprì che ciascuno di questi geni possedeva una sequenza molto simile lunga 180 bp. Questa sequenza venne chiamata omeobox e si ritiene codifichi una struttura con capacità di legare il DNA. I geni omeotici nei vertebrati. Nel 1984 vi fu una grande sorpresa quando si scoprì che una struttura tipica di un omeobox era presente nel rospo Xenopus laevis. Successivamente le prime strutture omeobox vennero identificate nei mammiferi e sappiamo ogg che la specie umana possiede almeno 38 geni di questo tipo. Attività genica differenziale in tessuti diversi Attività genica differenziale in tessuti diversi
