12/03/2015
A.A. 2014-15
Dipartimento di Scienze della Vita
CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Crescita sincrona e metodi di sincronizzazione
• Germinazione di Bacillus subtilis
Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus
Genetica dei Procarioti - 2
baby machine method
Helmstetter & Cumming , 1963
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail
Germinazione di Bacillus subtilis
Crescita sincrona e metodi di sincronizzazione
Germinazione di Bacillus subtilis
• Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus
baby machine method
Helmstetter & Cumming , 1963
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Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus
Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus
In Caulobacter, chromosome replication never occurs more than once
per division. This is because division in this organism always gives rise
to two different types of cells.
Crescita sincrona e metodi di sincronizzazione
“baby machine method”
Germinazione di Bacillus subtilis
Ciclo cellulare di Caulobacter crescentus
• baby machine method
Helmstetter & Cumming , 1963
metodo fisico che permette di separare dalla popolazione
la frazione di cellule che sono nello stesso punto del
ciclo cellulare.
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“Baby cell column”
Il gene fliC codificante per una variante di
flagellina “sticky“ è stato introdotto nel
cromosoma sotto il controllo di un promotore
inducibile*
* INDUTTORE: isopropyl β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)
“Baby cell column”
I batteri sono cresciuti inizialmente in un
mezzo di coltura senza IPTG, quindi sono
brevemente esposti all’induttore (1-2
flagelli/cellula) e fatti aderire a sfere di vetro
Le sfere di vetro sono trasferite in una
colonna attraverso la quale è fatto fluire
terreno fresco
Le cellule “neonate” che non hanno flagello
sono lavate via dal passaggio del terreno
Bates et al., 2005. Molecular Microbiology 57 (2), 380-391.
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François Jacob (1920 – 2013)
«Le rêve d’une bactérie doit
devenir deux bactéries»
B-
fino all’inizio della replicazione del DNA
C-
replicazione del DNA
D
B-
fino all’inizio della replicazione del DNA
C-
replicazione del DNA
D
- formazione del setto,
separazione delle cellule figlie
- formazione del setto,
separazione delle cellule figlie
250–1000 nucleotidi per secondo
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Il paradosso della divisione in Escherichia coli
Il ciclo cellulare di Escherichia coli
B
C
D
Come può un batterio dividersi ogni 20 minuti se il DNA impiega
40 minuti per duplicarsi?
variabile
40 min
forca replicativa
20 min
Fase B - periodo di interinizio. Osservabile in cellule che si dividono
lentamente (T>60’); la cellula si prepara alla replicazione del DNA
Fase C - periodo necessario alla replicazione del DNA. Il limite è
dovuto alla velocità di sintesi del DNA da parte della DNA polimerasi
Fase D - periodo della divisione: tempo che intercorre tra il
completamento della replicazione del cromosoma e la divisione
cellulare.
T = 60 minuti
Replicazione del DNA in E. coli
0
10
20
30
40
50
C
D
40 min
20 min
60
Quando la velocità di crescita è elevata (20-25 min,
mentre il DNA si replica ogni 40 min), prima della
divisione cellulare, si avvia un nuovo ciclo di
replicazione del DNA quando ancora non è stato
completato il ciclo precedente.
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T = 40 min.
T = 20 min.
replicazione che inizia
replicazione iniziata 20 min. prima
0
10
20
30
40
50
60
replicazione
iniziata 20’ prima
D
replicazione iniziata 40’ prima
Replicazione del DNA in E. coli
La replicazione del DNA offre un modello di regolazione
inizia sempre all’origine
Un nuovo ciclo di replicazione inizia prima che si
completi il ciclo precedente
Apertura di forche multiple di replicazione
Le cellule in fase di divisione ereditano una copia
completa del genoma più una parte parzialmente
replicata
i geni prossimi all’origine sono duplicati per primi
aumenta il numero di copie
per questi geni quindi aumenta anche il numero dei loro prodotti
si tratta di geni associati con la sintesi della parete e
della membrana cellulare, es. OMP
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Nature 152, 274-275,1943
Bacteria in the Bottom Sediments of the Dead Sea
B. Elazari-Volcani
La replicazione del cromosoma è seguita dalla segregazione:
i cromosomi duplicati vengono disposti ai lati opposti della
cellula in divisione
I batteri quali E. coli riescono a portare a termine questo
processo in modo efficiente nonostante l’assenza di un
apparato mitotico
In questo processo è sicuramente implicato è l’operone
mukFEB
Mutanti muk producono cellule anucleate con una frequenza di
circa 100 superiore a quella del wild type
mukaku (“anucleato”)
Involucro e divisione cellulare
Una volta raggiunto il valore di 2Lu, in
B-
fino all’inizio della replicazione del DNA
C-
replicazione del DNA
corrispondenza di un punto mediano tra le due
estremità cellulari, inizia a formarsi un setto e la
sintesi della parete cellulare diviene bipolare.
D
-
formazione del setto,
separazione delle cellule figlie
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La formazione del setto richiede una regolazione:
TEMPORALE
SPAZIALE
regolazione temporale
Controllo nutrizionale
Nutritional control of cell cycle events
( a ) guanosine pentaphosphate or tetraphosphate (p)ppGpp) is produced in
response to amino acid or carbon starvation couples growth rate with DNA
replication by modulating DnaA abundance (it is unclear whether these effects are
direct or indirect and to what degree they contribute to the starvation-induced
replication arrest)
( b ) uridine-50-diphosphoglucose (UDP-glucose) is another small molecule that
transduces information about the nutritional status into the cell cycle. The
glucosyltransferases OpgH binds UDP-glucose and then modulate cell division by
directly inhibiting FtsZ assembly
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Regolazione spaziale della divisione in E. coli
regolazione temporale
In E. coli come in altri batteri di forma bastoncellare, il setto si
la divisione deve avvenire
SEMPRE dopo la duplicazione
del DNA (un blocco nella sintesi
del DNA non sarà seguito dalla
divisione)
localizza esattamente nella posizione centrale della cellula.
Come viene scelta la corretta posizione del setto?
SI
NO
proteina SulA (sistema SOS) che
inibisce in modo selettivo la
principale proteina responsabile
della formazione del setto (FtsZ).
Rod-shaped bacteria have two main systems to accurately
direct localization of the division plane to mid-cell:
• the Min system prevents aberrant division at the cell poles
• nucleoid occlusion prevents division from occurring over
the nucleoids
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Selezione del punto di divisione
Il sistema Min
Il sistema Min di Escherichia coli consiste di 3 proteine:
sistema Min
1
2
Il sistema Min
Il sistema Min di Escherichia coli consiste di 3 proteine:
MinC
MinD
MinE
DIVISION INHIBITOR PROTEIN
lacks site-specificity and when overexpressed in
the absence of the other Min proteins, causes a
global block in cell division and the formation of
long filaments
The minC, minD and minE gene products work in
concert to prevent septation at potential division sites
located near the ends of the cell
MinD
Selezione del punto di divisione
MEMBRANE
ASSEMBLY PROTEIN
Il sistema Min
MinD è una proteina associata
alla membrana
MEMBRANE ASSEMBLY PROTEIN
responsible for the membrane association of
MinC and MinE
TOPOLOGICAL SPECIFICITY FACTOR
responsible for giving site specificity to MinC
MinC
DIVISION INHIBITOR
PROTEIN
l’azione inibitrice di MinC è
esercitata direttamente sulla
proteina FtsZ
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Il sistema Min
MinE
TOPOLOGICAL SPECIFICITY FACTOR
responsible for giving site specificity to MinC
agisce su MinD ed è responsabile della localizzazione spaziale
del complesso MinCD: la sua funzione è quella di far
localizzare MinCD ai poli della cellula e lontano dal piano di
divisione mediano.
COME?
La formazione di un setto a un polo porta alla formazione di
La rapida oscillazione fa in modo che l’inibitore del setto
minicellule (cellule di dimensioni più piccole e anucleate)
MinCD sia statisticamente più presente ai poli che al centro
impedendo, quindi, la formazione del setto ai poli
minicellula
I poli sono siti potenziali di divisione non occlusi dal nucleoide
Proc Natl Acad Sci U S A. 1967,57(2): 321–326.
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Selezione del punto di divisione
Occlusione del nucleoide
Il nucleoide esercita un effetto negativo sul posizionamento del
setto: in una regione occupata dal nucleoide non si formerà mai il
setto
Il volume cellulare è occupato
dal nucleoide. Non ci sono siti
liberi per la formazione del setto
NO: nucleoid occlusion proteins
In seguito alla segregazione del
two proteins that have a role in the NO phenomenon have been identified:
Noc in Bacillus subtilis and SlmA in Escherichia coli.
DNA, la regione mediana rimane
libera dal nucleoide. Il setto può
formarsi
Selezione del punto di divisione
B-
fino all’inizio della replicazione del DNA
C-
replicazione del DNA
the nucleoid occlusion (NO) proteins are associated with the nucleoid
D
- segregazione dei nucleoidi,
formazione del setto,
separazione delle cellule figlie
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Mutante termosensibile per una proteina del divisoma (FtsQ).
Formazione del setto e divisione in Escherichia coli
Una fase precoce della divisione nei batteri è la formazione dello
Z ring a livello del sito di divisione.
Z-ring
A T non permissiva le cellule
crescono normalmente in
dimensioni ma non potendo
dividersi formano cellule lunghe
e filamentose con più copie del
cromosoma (non visibile nella
figura) che poi muoiono.
fts = Filaments
A T permissiva le cellule si
dividono correttamente.
Un fenotipo analogo è osservabile in mutanti termosensibili per altri geni della divisione.
La formazione dello Z ring è dovuta alla capacità della
proteina FtsZ di polimerizzare
FtsZ
Filamenting temperature-sensitive mutant Z
FtsZ è virtualmente presente in tutti i batteri, nella
maggioranza degli Archaea e nei cloroplasti e mitocondri
degli eucarioti.
Tra le proteine batteriche coinvolte nella divisione è
quella più conservata
queste proteine possono legare ed idrolizzare nucleosidi trifosfati
(GTP) che forniscono l’energia necessaria al rimodellamento della
forma cellulare, possibilmente contrastando le forze dovute al
turgore e alla architettura parietale presente.
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Schematic representation of
septal ring assembly in E. coli
Blue: proteins assembling at the
cytoplasmic face of the IM
Black: trans-membrane inner-membrane
proteins
Assemblaggio di proteine, PBPs
Orange: periplasmic proteins
specializzate, che dirigono la sintesi
Purple: outer-membrane (lipo-)proteins
del materiale parietale e di altri
Red: regulators of Z-ring positioning
involucri cellulari che costituiranno i
nuovi poli della cellula
costrizione e, possibilmente,
una fase addizionale di chiusura
del setto
proteins that are essential for viability are underlined
FtsZ
è la proteina principale del setto e quella che interviene per prima
proteina citoplasmatica di 40.000 D, circa 20.000 copie per cellula
The cytokinetic machinery, or divisome, is highly
conserved in bacteria and many of the essential
components are found in almost all bacterial cells
è una GTPasi con attività polimerizzante che richiede GTP
La polimerizzazione è inibita da SulA (controllo della replicazione)
e da
MinC (controllo spaziale della localizzazione del setto)
Tra le proteine
Fts è quella più conservata tra i procarioti: è
assente solo nelle clamidie.
E’ presente in alcuni mitocondri e cloroplasti
.....
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12/03/2015
Allungamento
FtsZ
è omologa alle tubuline eucariotiche
Brook, Biologia dei
microrganismi – 1
Microbiologia generale
59
Brook, Biologia dei
microrganismi – 1
Microbiologia generale
60
15
12/03/2015
Allungamento
Escherichia coli
Mutazioni a carico di mreB
mreB: murein regulation gene
Actina-omologo
MreB family
aa sequence identity 15%
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12/03/2015
Thermotoga maritima
Helical cytoskeletal “cables” visualized by fluorescence
microscopy of live cells of B. subtilis expressing a GFP fusion
these proteins carry out nucleotide binding and hydrolysis, and that they
can polymerize into linear protofilaments, similar to eukaryotic actins.
to the MreB homologue, Mbl. Three cells from the field
(arrowed) are shown enlarged to the right.
How Do MreB Proteins Determine Cell Shape?
“peptidoglycan factory”
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The superfamily of bacterial actin homologs
a | Cells such as Staphylococcus aureus contain the tubulin-like
division protein FtsZ, which is present in virtually all eubacteria, most
cells containing FtsZ as the sole cytoskeletal element are spherical.
b | When actin-like MreB homologues are present, cells can take on a
rod-shaped morphology like that seen in Escherichia coli. MreB and
its homologues often appear as intracellular helical structures
(orange) when viewed with fluorescence microscopy.
A growing family: the expanding universe of the bacterial cytoskeleton
M. Ingerson-Mahar, Z. Gitai
FEMS Microbiology Reviews
Volume 36, Issue 1, pages 256-267, 28 NOV 2011
It may invade a homologous doublestranded DNA sequence and catalyze
strand exchange: key reaction of
homologous recombination
la risposta SOS causa l’inibizione della divisione cellulare
it may promote LexA cleavage: SOS
response induction (co-protease)
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12/03/2015
La risposta SOS causa l’inibizione
della divisione cellulare
LexA
SfiA (SulA) interagisce con FtsZ
in condizioni normali l’espressione di sulA è inibita dalla proteina LexA
Il processo è reversibile: SulA è una proteina instabile
RecA-stimulated selfdegradation of LexA
low level expression of all genes due to repression
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DNA damage
SOS DNA polymerases
alternative DNA polymerases:
Pol II (encoded by polB)
error-free
Pol IV (encoded by dinB)
error-prone
Pol V ( encoded by umuDC)
repression is relieved---high level expression
Antimicrobials as promoters of genetic variation
Black arrows: different sizes of the induction zone for the different antibiotics used.
The induction of SOS response is reported here by green fluorescent protein
(GFP) expression in a lawn of Escherichia coli cells harbouring a recA∷gfp
transcriptional fusion. At the edge of an inhibition zone blue light illumination
reveals that GFP is being overexpressed. Disc with no antibiotic (No Ab),
Ceftazidime (CAZ), ampicillin (AMP), ciprofloxacin (CIP), fosfomycin (FOS),
trimethoprim (TMP), sulfametoxazol (SUL) and trimethoprim plus sulfametoxazol
(SXT).
All antibiotics shown, except FOS, are able to induce the recA∷gfp
transcriptional fusion.
Blazquez et al., 2012. Current Opinion in Microbiology
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ICE derived from Vibrio cholerae
resistance to chloramphenicol, sulphamethoxazole, trimethoprim and streptomycin
Può tollerare livelli di radiazione > 1000 volte i livelli che ucciderebbero un essere
umano
Fu isolato nel 1956 da una lattina di carne che era stata irradiata con raggi X
Deinococcusradiodurans harbours 4 genetic elements designated as:
ICEs: Integrating conjugative elements are a diverse group of mobile elements
that are transferred by means of cell–cell contact and integrate into the
chromosome of the new host
•
•
•
•
chromosome I
chromosome II
a megaplasmid
a small plasmid
riparazione convenzionale del DNA
nuove funzioni di riparazione RecA-dipendenti e RecA-indipendenti
accumulo di ioni Mn(II) che dovrebbero prevenire la formazione di ROI
presenza di cromosomi multipli ( fino a 10)
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![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
