Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2
1 piastra5 piastre -
96
480
72561
72562
1
2
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2
1 piastra5 piastre -
96
480
72561
72562
KIT DI SCREENING COMBINATO PER ANTICORPI ANTI-HCV E ANTIGENE VIRALE
DEL VIRUS DELL'EPATITE C IN SIERO O PLASMA UMANO UTILIZZANDO UNA
TECNICA DI IMMUNODOSAGGIO ENZIMATICO
862219 – 2013/09
3
INDICE
1. USO PREVISTO.................................................................................................................. 5
2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST ................................................................. 5
3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA ...................................................................................... 5
4. REAGENTI ........................................................................................................................... 6
5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI .................................................................................. 7
6. CAMPIONI .......................................................................................................................... 10
7. PROCEDURA .................................................................................................................... 10
8. LIMITAZIONE DEL TEST ................................................................................................ 13
9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI ............................................................... 14
10. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ...................................................................................... 16
4
1. USO PREVISTO
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 è un immunodosaggio enzimatico qualitativo per la determinazione
dell'infezione da virus dell'epatite C (HCV) basato sulla rilevazione di anticorpi anti-HCV e antigene del
capside nel siero o nel plasma umano. Il test di screening dell'epatite C può essere impiegato da laboratori
diagnostici e banche del sangue.
2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST
Il virus dell'epatite C (HCV) è un virus a senso positivo con involucro dell'RNA (9,5 kb) appartenente alla
famiglia delle Flaviviridae, di cui sono stati identificati i sei principali genotipi. L'HCV è riconosciuto come
causa principale dell'epatite virale non A e non B. L'infezione da HCV è caratterizzata da forma acuta e
cronica che può condurre a cirrosi e carcinoma epatocellulare.
Le evidenze sierologiche dell'infezione da HCV sono ottenibili tramite esami del sangue per eseguire lo
screening di antigeni dell'HCV e/o anticorpi e/o RNA. Rispetto al test per lo screening dei soli anticorpi antiHCV, l'impiego del test per lo screening combinato di anticorpi anti-HCV e antigene del capside dell'HCV può
ridurre il periodo della finestra sierologica e migliorare la determinazione dell'infezione.
3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 si basa sull'impiego di una fase solida preparata con antigeni purificati:
due proteine ricombinanti della regione non strutturale (NS3 e NS4) e un peptide della regione strutturale
(capside) del virus dell'epatite C, e un anticorpo monoclonale contro il capside dell'epatite C. La fase liquida
comprende due coniugati. Il primo coniugato (R6) consiste in un anticorpo monoclonale biotinilato di topo
contro il capside dell'epatite C. Tale anticorpo monoclonale non reagisce con il peptide del capside
impiegato nella fase solida. Il secondo coniugato (R7) è una miscela di anticorpi IgG anti-umani marcati con
perossidasi di topo e streptavidina marcata con perossidasi.
La procedura di dosaggio comprende le seguenti fasi della reazione:
1) Il coniugato 1, i campioni da testare e i sieri di controllo sono distribuiti nei pozzetti della micropiastra.
Gli eventuali anticorpi per HVC saranno legati agli antigeni fissati nella fase solida. In presenza di
antigene del capside dell'epatite C, tale antigene sarà legato dagli anticorpi monoclonali rivestiti nella
fase solida e dagli anticorpi monoclonali biotinilati contro l'antigene del capside dell'epatite C
(coniugato 1).
2) Dopo l'incubazione a 37°C per 90 minuti e la fase di lavaggio, si aggiungono il coniugato 2 contenente
anticorpi IgG anti-umani marcati con perossidasi e la streptavidina marcata con perossidasi a ogni
pozzetto della micropiastra. In presenza di IgG umana che abbia reagito con la fase solida, il
coniugato IgG anti-umano si lega con gli anticorpi umani Il coniugato di perossidasi/streptavidina si
lega alla biotina del coniugato 1, se nel campione è presente un antigene del capside dell'HCV.
3) Dopo 30 minuti di incubazione a 37°C, viene rimosso il coniugato enzimatico non legato tramite la
fase di lavaggio e la presenza dei complessi di perossidasi dell'anticorpo dell'antigene viene
individuata con l'aggiunta del substrato.
4) Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura di laboratorio (18 - 30°C), all'interruzione della reazione,
si rileva la lettura dello spettrometro a 450/620-700 nm. L'assorbanza misurata per un campione
consente di rilevare la presenza o l'assenza di anticorpi HCV e/o di antigeni del capside dell'epatite C
nel campione. L'intensità cromatica è proporzionata alla quantità di anticorpi HCV e/o antigene del
capside dell'epatite C nella fase solida.
5
4. REAGENTI
4.1. Descrizione
Identificazione
sull'etichetta
Presentazione
Preparazione
72561
Presentazione
Preparazione
72562
Micropiastra
12 strip da 8 pozzetti ciascuna, rivestite
da anticorpo monoclonale anti-capside
del VHC, antigeni purificati ricombinanti
dell'epatite C (NS3, NS4) e un peptide
del capside dell'HCV.
Numero ID specifico = 93
1 piastra
Pronto per
l'uso
5 piastre
Pronto per
l'uso
Soluzione di lavaggio concentrata
(20x)
Tampone Tris NaCl pH 7,4
Conservante: ProClin™ 300 (0,04%)
1 fiala
70 ml
Da diluire
1 fiala
235 ml
Da diluire
1 fiala
1 ml
Pronto per
l'uso
1 fiala
1 ml
Pronto per
l'uso
1 fiala
1,5 ml
Pronto per
l'uso
1 fiala
3 ml
Pronto per
l'uso
Descrizione
R1
MICROPLATE
R2
CONCENTRATED
WASHING
SOLUTION
(20X)
R3
NEGATIVE
CONTROL
R4
POSITIVE
CONTROL
R5a
ANTIGEN
POSITIVE
CONTROL
Controllo positivo antigene
Controllo positivo antigene sintetico
contenente un peptide del capside
liofilizzato.
1 fiala
q.s. ad
1 ml
Da ricostituire
1 fiala
q.s. ad
1 ml
Da ricostituire
R5b
ANTIGEN
DILUENT
Diluente di R5a
Acqua distillata contenente conservante:
ProClin™ 300 (0,5 %)
1 fiala
1 ml
Da ricostituire
1 fiala
1 ml
Da ricostituire
CONJUGATE 1
Coniugato 1
Anticorpi monoclonali biotinilati di topo
contro antigene del capside dell'HCV.
Colore porpora
Conservante: Azoturo di sodio (< 0,1%),
®
Cosmocil CQ (0,025%)
1 fiala
15 ml
Pronto per
l'uso
2 fiale
2 x 30 ml
Pronto per
l'uso
R7
CONJUGATE 2
Coniugato 2
Anticorpi di topo diretti contro IgG
umana/perossidasi e
streptavidina/perossidasi.
Colore verde.
Conservante: ProClin™ 300 (0,5 %)
1 fiala
15 ml
Pronto per
l'uso
2 fiale
2 x 30 ml
Pronto per
l'uso
R8
SUBSTRATE
BUFFER
Substrato
Soluzione di acido citrico e acetato di
sodio, pH 4,0, contenente H 2 O 2
(0,015%) e dimetilsolfossido (DMSO)
1 fiala
60 ml
Da ricostituire
2 fiale
2 x 60 ml
Da ricostituire
R6
Controllo negativo
Tampone Tris HCI, contenente BSA
(Siero di albumina bovina);
Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)
Controllo positivo
Siero umano contenente anticorpi
dell'HCV, negativo all'antigene dell'HB e
per anticorpi anti HIV-1 e anti HIV-2
diluiti in un tampone Tris HCI
contenente BSA, e attivato
fotochimicamente.
Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)
6
4%
R9
CHROMOGEN:
TMB SOLUTION
(11X)
R10
STOPPING
SOLUTION
Cromogeno: Soluzione TMB
Soluzione contenente 3,3’, 5,5’
tetrametilbenzidina (TMB)
1 fiala
5 ml
Da diluire
2 fiale
2 x 5 ml
Da diluire
Soluzione bloccante
Soluzione di acido solforico (H 2 SO 4
1N)
1 fiala
28 ml
Pronto per
l'uso
3 fiale
3 x 28 ml
Pronto per
l'uso
4.2. Condizioni di conservazione e manipolazione
Conservare il kit a +2-8°C. Ogni articolo del kit conservato a +2-8°C può essere utilizzato fino dalla data di
scadenza riportata sulla confezione (fatto salvo laddove diversamente indicato).
Dopo l'apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 e R10 conservati a 28°C possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sulla confezione.
Identificazione
Conservazione
Dopo l'apertura del sacchetto sotto-vuoto, le strip del micropozzetto conservate a
+2-8°C possono essere utilizzate per 1 mese nella confezione originale
accuratamente risigillata.
La soluzione di lavaggio distillata può essere conservata a +2-30°C per 2
settimane. La soluzione di lavaggio concentrata (R2) può essere conservata a +230°C.
R1
R2
R5a + R5b
Dopo la ricostituzione, la soluzione di lavoro di controllo positivo antigene (R5) può
essere conservata per 1 mese a +2-8°C e 2 mesi a -20°C (fino a 5 cicli di
congelamento/scongelamento dopo il congelamento a -20°C).
R8 + R9
Dopo la ricostituzione, i reagenti conservati al buio possono essere utilizzati per 6
ore a temperatura ambiente (18-30°C).
5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI
Per l'uso diagnostico in vitro da parte di un operatore sanitario.
5.1. Precauzioni per la salute e la sicurezza
•
Questo kit di test deve essere maneggiato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato
e qualificato nelle procedure di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare
abbigliamento protettivo, guanti, protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in
maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio.
•
Il kit contiene componenti ematici umani. Il materiale di origine umana nella preparazione di
reagente R4 (controllo positivo) è stato testato e risultato non reattivo all'antigene di superficie
dell'epatite B (HBs Ag) e agli anticorpi dei virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1 e HIV-2 Ab) e
positivo agli anticorpi anti-HCV. Il controllo positivo R4 è inattivato tramite riscaldamento. Nessun
metodo di test conosciuto è in grado di garantire con assoluta certezza l'assenza di agenti infettivi.
Tutti gli emoderivati umani, i reagenti e i campioni umani, pertanto, devono essere manipolati con la
consapevolezza che si tratta di sostanze in grado di trasmettere malattie infettive ed è necessario
seguire le precauzioni generali per gli agenti patogeni ematici raccomandate nel rispetto di tutte le
normative locali, regionali e nazionali.
•
Versamenti biologici: I versamenti di materiale di origine umana devono essere trattati come
sostanze potenzialmente infettive.
I versamenti non contenenti sostanze acide devono essere immediatamente decontaminati e
asciugati. A questo scopo, disinfettare l'area in cui è avvenuto il versamento, i materiali ed eventuali
7
superfici o apparecchiature contaminate utilizzando un disinfettante chimico appropriato efficace per
i materiali a potenziale rischio biologico relativi ai campioni coinvolti (generalmente, una diluizione
1:10 di candeggina per uso domestico, 70-80% di etanolo o isopropanolo, uno iodoforo allo 0,5%
quale Wescodyne™ Plus, ecc.).
I versamenti contenenti sostanze acide devono essere adeguatamente assorbiti (asciugati con un
panno) o neutralizzati, l'area deve essere lavata con acqua e asciugata; il materiale utilizzato per
assorbire il versamento può richiedere lo smaltimento come rifiuto a rischio biologico. L'area deve
essere quindi decontaminata con un disinfettante chimico.
NOTA: Non collocare le soluzioni contenenti candeggina in autoclave.
8
•
Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come
potenzialmente infetti. I rifiuti di laboratorio, chimici o a rischio biologico devono essere manipolati e
smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali.
•
Per le raccomandazioni su precauzioni e rischi correlati ad alcuni componenti chimici del presente
kit, consultare i simboli riportati sulle etichette e le informazioni fornite alla fine delle istruzioni per
l'uso. La scheda di sicurezza è disponibile all'indirizzo www.bio-rad.com.
5.2. Precauzioni relative al protocollo
5.2.1.Preparazione
L'affidabilità dei risultati dipende dalla corretta implementazione delle seguenti pratiche di laboratorio
corrette.
• Non utilizzare reagenti scaduti.
• Non mescolare, né unire reagenti appartenenti a numeri di lotto differenti all'interno di un unico ciclo.
• Prima dell'uso attendere 30 minuti che i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente (18-30°C).
• La denominazione del test e il numero di identificazione specifico del test stesso sono riportati sul
telaio di ogni micropiastra. Questo numero di identificazione specifico è indicato anche su ogni strip.
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2: Numero ID specifico = 93
Verificare il numero di identificazione specifico prima dell'uso. Qualora il numero di identificazione risulti
mancante o diverso dal numero indicato corrispondente al dosaggio da testare, la strip non dovrà essere
utilizzata.
NOTA: Per la soluzione di lavaggio (R2, identificazione etichetta: colore verde 20X), tampone di substrato di
perossidasi (R8, identificazione etichetta: tampone TMB, colore blu), cromogeno (R9, identificazione
etichetta: TMB 11X, color porpora) e soluzione bloccante (R10, identificazione etichetta: 1N colore rosso), è
possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, fermo restando che venga utilizzato lo stesso lotto
all'interno di un determinato ciclo di test. Tali reagenti possono essere utilizzati con altre procedure della
nostra azienda. Contattare l'assistenza tecnica per informazioni dettagliate.
•
•
•
•
•
•
Ricostituire con cura i reagenti evitando eventuali contaminazioni.
Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure vetreria perfettamente lavata e asciugata con
acqua deionizzata.
Non far asciugare la micropiastra nell'intervallo compreso fra la fine dell'operazione di lavaggio e la
distribuzione del reagente.
La reazione enzimatica è particolarmente sensibile agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che
eventuali elementi di metallo entrino a contatto con le varie soluzioni contenenti coniugato o
substrato.
La soluzione di sviluppo (tampone substrato + cromogeno) deve essere di colore rosa. La variazione
del colore rosa entro pochi minuti dalla ricostituzione indica che il reagente non può essere utilizzato
e deve essere sostituito.
La soluzione di sviluppo può essere preparata in un contenitore di vetro o in un vassoio di plastica
monouso pre-lavato con 1N HCl, risciacquato accuratamente con acqua distillata e asciugato. Il
reagente deve essere conservato al buio.
Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo.
5.2.2.Elaborazione
•
•
•
•
•
Non modificare la procedura di dosaggio.
Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (vapori acidi, alcalini e di aldeide) o polvere
potenzialmente in grado di alterare l'attività enzimatica del coniugato.
Utilizzare una nuova distribuzione per ciascun campione.
Il lavaggio del pozzetto è una fase essenziale della procedura: attenersi al numero di cicli di lavaggio
raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati.
Un lavaggio inadeguato può condurre a risultati inesatti.
Seguire attentamente le procedure di lavaggio descritte per ottimizzare le prestazioni del test. Con
alcuni strumenti, potrebbe essere necessario ottimizzare la procedura di lavaggio (aumento del
9
•
numero di cicli della fase di lavaggio e/o del volume di tamponi di lavaggio per ogni ciclo) per
ottenere un livello accettabile di sfondo OD per il campione negativo.
Per gli adattamenti e le procedure speciali contattare l'azienda.
6. CAMPIONI
Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche correnti.
Il test dovrà essere eseguito su plasma o siero non diluito (prelevato da EDTA, citrato di sodio o ACD). Si
sconsiglia di utilizzare un campione prelevato dalle provette contenenti eparinato di litio.
È stato riscontrato un segnale inferiore sui campioni risultati positivi al test per l'antigene HCV.
I campioni contenenti aggregati devono essere chiarificati tramite centrifugazione prima del test. Aggregati o
particelle di fibrina sospese possono produrre falsi positivi.
Il campione sarà conservato a +2-8°C se il test viene eseguito entro 7 giorni oppure può essere surgelato a 20°C. Non ripetere più di 3 cicli di congelamento/scongelamento. I campioni devono essere scongelati a
temperatura ambiente (18-30°C). Si consiglia di omogeneizzarli capovolgendoli prima dell'uso.
I campioni contenenti fino a 120 g/l di albumina, 50 µg/l di biotina e 200 mg/l di bilirubina, i campioni
contenenti fino a 33 g/l di trioleina e i campioni contenenti fino a 2 g/l di emoglobina non compromettono i
risultati. Si sconsiglia tuttavia di utilizzare campioni iperemolizzati e iperlipemici contaminati.
Si raccomanda di non riscaldare i campioni in quanto ciò potrebbe ridurre in modo significativo la rilevazione
dell'antigene HCV.
Per essere spediti, i campioni devono essere confezionati in conformità con le disposizioni vigenti in materia
di trasporto di agenti eziologici e trasportati preferibilmente congelati.
7. PROCEDURA
7.1. Materiali necessari ma non forniti
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acqua distillata.
Ipocloruro di sodio (candeggina per uso domestico) e bicarbonato di sodio.
Carta assorbente.
Pellicole adesive.
Guanti monouso.
Occhiali di sicurezza.
Provette monouso.
Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o preimpostate per misurare e
dispensare 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl e 1 ml.
Cilindri graduati da 10 ml, 200 ml e 1.000 ml. Miscelatore vortex.
Sistema di lavaggio automatico, semi-automatico o manuale per micropiastre.
Bagno d'acqua o incubatore per micropiastre equivalente, dotato di termostato impostato a 37°C ±
1°C (*).
Contenitore per rifiuti biologici potenzialmente pericolosi..
Lettore di micropiastre dotato di filtri 450, 490 nm e 620-700 nm (*).
(*) Per informazioni dettagliate sull'apparecchiatura raccomandata, consultare il nostro reparto
tecnico.
7.2. Preparazione dei reagenti
7.2.1.Reagenti pronti all'uso
Reagente 1 (R1): Micropiastra
Ogni supporto del telaio contenente 12 strip è avvolto in un sacchetto di alluminio laminato sigillato.
Tagliare il sacchetto con le forbici o un bisturi da 0,5 a 1 cm sopra la sigillatura. Aprire il sacchetto ed
estrarre il telaio. Riporre le strip inutilizzate nel sacchetto. Chiudere con cura il sacchetto e conservarlo a +28°C.
Reagente 6 (R6): Coniugato 1
10
Omogeneizzare capovolgendo prima dell'uso.
Reagente 7 (R7): Coniugato 2
Omogeneizzare capovolgendo prima dell'uso.
7.2.2.Reagenti per ricostituire
Reagente 2 (R2): Soluzione di lavaggio concentrata (20x)
Diluire 1:20 in acqua distillata per ottenere una soluzione di lavaggio pronta all'uso.
Preparare 800 ml per una piastra di 12 strip.
Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Soluzione di sviluppo dell'enzima
Diluire 1:11 il cromogeno (R9) nel tampone di substrato (per es. 1 ml di reagente R9 + 10 ml di reagente R8)
poiché 10 ml sono necessari e sufficienti a trattare 12 strip. Omogeneizzare.
Reagente 5a (R5a) + Reagente 5b (R5b): Soluzione di lavoro (R5).
Versare il contenuto di diluente R5b nella fiala di Ag R5 liofilizzato. Richiudere la fiala e lasciare decantare
per 10 minuti a temperatura ambiente (18-30°C) agitando e capovolgendo la fiala periodicamente per
favorire lo scioglimento.
7.3. Procedura di dosaggio
Attenersi rigorosamente alla procedura.
Utilizzare sieri di controllo negativo e positivo per ogni test al fine di confermarne la qualità.
Attenersi alle pratiche di laboratorio corrette di seguito riportate:
1) Determinare attentamente il piano di identificazione e distribuzione del campione.
2) Preparare la soluzione di lavaggio diluita R2 e la soluzione di lavoro di controllo positivo
dell'antigene (R5a + R5b). (fare riferimento al § 7.2)
3) Estrarre il telaio di supporto e il numero di strip necessarie (R1) dalla confezione protettiva.
Riporre le strip inutilizzate nella confezione. Chiudere la confezione e riporla a +2-8°C.
4) Distribuire nel pozzetto nel seguente ordine (distribuzione consigliabile sulla piastra):
• 100 μl di coniugato 1 (R6) in ogni pozzetto, quindi
• 50 μl di controllo negativo (R3) nel pozzetto A1,
• 50 μl di controllo positivo (R4) nei pozzetti B1, C1, D1,
• 50 μl di soluzione di lavoro di controllo positivo dell'antigene (R5a + R5b) nel pozzetto
E1,
• 50 μl del primo campione nel pozzetto F1,
• 50 μl del secondo campione in G1, ecc.
Omogeneizzare la miscela con almeno 3 aspirazioni o con un agitatore per micropiastre per 5
secondi. Se la distribuzione dei campioni richiede più di 10 minuti, si consiglia di distribuire i
controlli positivi e negativi dopo i campioni da testare.
A seconda del sistema impiegato, non è possibile modificare la posizione dei controlli o l'ordine
di distribuzione.
NOTA: dopo la distribuzione, il pozzetto contenente il campione (o i controlli) passa da porpora a blu.
È possibile verificare la presenza del (campione + coniugato 1) nei pozzetti tramite lettura
spettrometrica a 620 nm (fare riferimento al § 7.7).
5) Se possibile, coprire la piastra con una nuova pellicola adesiva.
6) Incubare la micropiastra per 90 minuti (± 5 min.) a 37°C ± 1°C.
7) Se necessario, rimuovere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto dei pozzetti in un contenitore
per rifiuti liquidi e aggiungere almeno 370 µl di soluzione di lavaggio in ogni pozzetto. Aspirare
nuovamente e ripetere il lavaggio almeno 5 volte. Il volume residuo deve essere inferiore a 10 μl
(se necessario, asciugare le strip capovolgendole su carta assorbente).
Se si dispone di un sistema di lavaggio automatico, seguire lo stesso ciclo operativo.
8) Distribuire rapidamente 100 μl di soluzione di coniugato 2 (R7) in ogni pozzetto nella piastra.
Il coniugato deve essere agitato con delicatezza prima dell'uso. Coprire, se possibile, con una
nuova pellicola adesiva e incubare per 30 minuti (± 5 min.) a 37°C ± 1°C.
NOTA: il coniugato è di colore verde. È possibile verificare la presenza del coniugato nei pozzetti
tramite lettura spettrometrica a 620 nm (fare riferimento al § 7.7).
11
9) Rimuovere la pellicola adesiva, svuotare tutti i pozzetti tramite aspirazione e lavare almeno 5
volte come descritto sopra.
10) Preparare una soluzione di sviluppo dell'enzima (reagente R8 + R9).
11) Distribuire rapidamente 80 μl di soluzione di sviluppo dell'enzima preparato (R8 + R9) in tutti i
pozzetti. Far sviluppare la reazione al buio per 30 minuti (± 5 minuti) a temperatura ambiente (18
- 30°C). Non utilizzare pellicole adesive durante questo periodo di incubazione.
NOTA: in questa fase della manipolazione si può controllare visivamente la distribuzione della
soluzione di sviluppo, di colore rosa. Vi è una netta differenza di colorazione tra un pozzetto vuoto e
un pozzetto contenente la soluzione di substrato rosa. (Fare riferimento al § 7.7)
12) Aggiungere 100 μl della soluzione bloccante (R10) utilizzando la stessa sequenza e la stessa
percentuale di distribuzione della soluzione di sviluppo.
NOTA: in questa fase di manipolazione si può controllare visivamente la distribuzione della soluzione
bloccante incolore. Il colore del substrato, rosa (per i campioni negativi) o blu (per quelli positivi),
sbiadisce dai pozzetti che diventano incolori (per i campioni negativi) o gialli (per quelli positivi) dopo
l'aggiunta della soluzione bloccante.
13) Asciugare accuratamente il fondo di ogni piastra. Attendere almeno 4 minuti dopo l'aggiunta
della soluzione bloccante ed entro 30 minuti dal blocco della reazione, leggere la densità ottica a
450/620-700 nm con un lettore per piastre.
14) Verificare la corrispondenza tra lettura spettrofotometrica e visiva e rispetto al piano di
identificazione e distribuzione di piastra e campione.
7.4. Controllo qualità
Utilizzare i controlli positivi (R4 e R5) e il controllo negativo (R3) a ogni esecuzione del test per confermare il
dosaggio. (Fare riferimento a §7.5)
7.5. Criteri di validazione del test
Il test è confermato se le condizioni seguenti sono rispettate:
1) Per il controllo negativo R3:
Il valore di assorbanza misurata deve essere inferiore al 60% del cut-off:
O.D. < cut-off x 0,6
2) Per il controllo positivo degli anticorpi R4:
0,800 ≤ O.D. medio R4 ≤ 2.700
Se uno dei singoli valori del controllo positivo R4 differisce di oltre il 30% dal valore medio, ignorare il
valore e ripetere il calcolo con i due valori di controllo positivi restanti.
3) Per la soluzione di lavoro R5:
O.D. > 0,500
7.6. Calcolo/Interpretazione dei risultati
Il cut-off si determina con il controllo positivo R4:
Calcolare il valore dell'assorbanza media misurata per il controllo positivo R4.
Calcolare il valore di cut-off:
OD medio R4
CO = --------------------5
La presenza o l'assenza di anticorpi anti-HCV e/o di antigene del capside si determina confrontando
l'assorbanza registrata con il valore di cut-off calcolato per ogni campione.
Per ogni campione si calcola il seguente rapporto:
12
Rapporto = OD del campione/Valore CO
I campioni con densità ottica inferiore al valore di cut-off sono ritenuti negativi (rapporto < 1) da Monolisa™
HCV Ag-Ab ULTRA V2.
I risultati immediatamente inferiori al valore di cut-off (CO-10 % < O.D. < CO, rapporto tra 0,9 e 1) dovranno
tuttavia essere interpretati con cautela. È consigliabile ritestare in duplicato i campioni corrispondenti quando
consentito da sistemi e procedure di laboratorio.
I campioni con densità ottica maggiore o uguale al cut-off (rapporto ≥ 1) sono considerati inizialmente positivi
da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. Dovranno essere ritestati in duplicato prima dell'interpretazione
finale.
Se, dopo la ripetizione del test, il valore del rapporto di almeno uno dei 2 duplicati risulta maggiore o uguale
a 1, il risultato iniziale è ripetibile e il campione è dichiarato positivo con Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. I
valori del rapporto dei 2 duplicati sono inferiori a 1, il risultato iniziale non è ripetibile e il campione è
dichiarato negativo.
I campioni ritestati due volte e risultati negativi con Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, ma con un valore
prossimo al valore di cut-off (rapporto tra 0,9 e 1) dovranno essere considerati con cautela. È consigliabile
ritestare il paziente con un altro metodo o un altro campione.
In caso di densità ottica molto bassa dei campioni testati (OD negativo) e quando si controlla la presenza di
campioni e reagente, i risultati possono essere interpretati come negativi.
Si consiglia di confermare i campioni positivi seguendo le attuali raccomandazioni nazionali e gli algoritmi.
7.7. Verifica spettrometrica del pipettaggio di campione e coniugato (facoltativa)
Verifica del pipettaggio di campione e coniugato 1 (R6)
È possibile verificare la presenza di coniugato 1 (R6) + campione nel pozzetto tramite lettura automatica a
620 nm.
Ogni pozzetto contenente campione e coniugato 1 (R6) deve avere OD maggiore di 0,800.
NOTA: dopo l'aggiunta del campione, il coniugato 1 (R6) passa da porpora a blu.
Verifica del pipettaggio di coniugato 2 (R7)
Il coniugato 2 (R7) è di colore verde.
È possibile verificare la presenza di coniugato 2 (R7) nei pozzetti tramite lettura automatica a 620 nm: Il
valore OD di ogni pozzetto deve essere superiore a 0,300 (un valore inferiore a questo indica normalmente
una scarsa dispensazione del coniugato).
Verifica del pipettaggio di soluzione di sviluppo
È possibile verificare la presenza di soluzione di sviluppo rosa nel pozzetto tramite lettura automatica a 490
nm.
Un pozzetto con soluzione di sviluppo deve avere una densità ottica superiore a 0,100 (un OD inferiore
indica una scarsa dispensazione della soluzione di sviluppo).
Si verifica una variazione cromatica significativa dei pozzetti vuoti da incolore a rosa dopo l'aggiunta della
soluzione di cromogeno del substrato preparata.
8. LIMITAZIONE DEL TEST
Date le diverse risposte immunologiche dei pazienti affetti dal virus dell'epatite C (soprattutto durante le
sieroconversioni), si possono osservare alcune differenze di rilevazione tra test in base al tipo di proteine
antigeniche impiegate. Un risultato negativo durante un test di screening non esclude quindi la possibilità di
esposizione o infezione da virus dell'epatite C.
Secondo la letteratura, i portatori di HCV sottoposti a trattamento di immunosoppressione o con coinfezione
da HIV-HCV possono presentare livelli di anticorpi particolarmente bassi, sotto il limite di rilevazione dei test
HCV.
Qualsiasi tecnica ELISA può produrre reazioni con falsi positivi. Si consiglia di verificare la specificità della
reazione di qualsiasi campione risultato positivo ripetibile, secondo i criteri di interpretazione del kit
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 kit, applicando un metodo idoneo: impiegare separatamente un test di
screening degli anticorpi anti-HCV ELISA con test di rilevazione degli anticorpi anti-HCV immunoblot per
13
dimostrare la presenza di anticorpi anti-HCV. Se necessario, utilizzare un test di biologia molecolare per lo
screening del genoma HCV.
Il metodo colorimetrico di verifica della deposizione di campioni e/o coniugati e/o soluzione di sviluppo non
consente un controllo preciso dei volumi distribuiti e rivela soltanto la presenza del campione e/o dei
coniugati e/o della soluzione di sviluppo. La percentuale di risposte errate con questo metodo è strettamente
associata alla precisione del sistema utilizzato (coefficiente cumulativo di variazione di distribuzione e lettura
superiore al 10% riducono notevolmente la qualità della verifica).
L'impiego del test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 non è approvato per gruppi di campioni o campioni
diluiti.
Eccezionalmente, si possono rilevare particelle fini nel diluente campione (R6), la cui presenza non altera
comunque la qualità del reagente.
9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI
9.1. Misurazione di precisione
La riproducibilità e la precisione intermedia sono state determinate utilizzando campioni con diverse
concentrazioni di anticorpi anti-HCV e antigeni HCV. I campioni sono stati testati 30 volte durante la stessa
serie di test per determinare la ripetibilità.
La precisione intermedia è stata valutata testando i campioni in duplicato ogni 20 giorni in 2 cicli indipendenti
ogni giorno.
Sono stati calcolati medie dei rapporti, deviazioni standard e coefficienti di variazione (CV).
9.1.1.Ripetibilità
Campioni
N
Media dei
rapporti
Deviazione
standard
CV %
Negativo
S1
30
0,23
0,024
10,4
Positivo
antigene
HCV
S2
30
1,21
0,048
4,0
S3
30
1,43
0,053
3,7
S6
30
7,18
0,166
2,3
Positivo
anticorpi
anti-HCV
S4
30
1,42
0,046
3,2
S5
30
1,35
0,083
6,1
S7
30
6,73
0,153
2,3
I CV ottenuti su 6 campioni positivi sono <10%.
9.1.2.Precisione intermedia
Negativo
S1
80
0,22
Intradosaggio
CV
DS
%
0,017 7,5
Positivo
antigene
HCV
S2bis
80
2,80
0,143
5,1
0,277
9,9
0,283
10,1
0,421
15,0
S3
80
1,56
0,124
7,9
0,129
8,2
0,083
5.3
0,197
12,6
S6
68
6,69
0,500
7,5
0,621
9,3
0,557
8,3
0,973
14,5
Positivo
anticorpi
anti-HCV
S4
80
1,57
0,062
3,9
0,125
8,0
0*
N/A
0,140
8,9
S5
80
1,75
0,075
4,3
0,164
9,3
0*
N/A
0,181
10,3
S7
80
7,69
0,285
3,7
0,531
6,9
0*
N/A
0,603
7,8
Campioni
N
Media
dei
rapporti
Interdosaggio/operatore
In giornata
Riproducibilità
totale
DS
CV %
0,029
CV
%
12,7
0,043
19,4
DS
CV %
DS
0,028
12,5
*: Il valore negativo della varianza è stato stimato a 0.
I CV ottenuti su 6 campioni positivi non sono superiori al 15%.
9.2. Prestazioni cliniche
Le prestazioni di Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 sono state determinate testando i campioni di donatori
di sangue casuali , pazienti ricoverati, pazienti con infezioni acute e croniche da virus dell'epatite C e
14
pazienti con sintomi non associati all'infezione da virus dell'epatite C. Gli studi si sono svolti presso 2 sedi di
donatori di sangue, un nosocomio e un sito Bio-Rad.
9.2.1.Specificità diagnostica
Lo studio è stato svolto su campioni di siero e plasma EDTA prelevati presso 2 centri di donazione su
donatori casuali.
È stato inoltre eseguito uno studio di specificità sui campioni dei pazienti ricoverati.
Tutti i campioni sono stati sottoposti a test anti-HCV con marcatura CE.
Popolazione
Struttura
Tipo di
campione
Numero
Campioni
reattivi ripetuti
(RR)
Specificità
(%)
siero
537
1
536/537
plasma
2002
0
2002/2002
siero
2638
2
2636/2638
5177
3
99,94%
5174/5177
99,83% – 99,99%
502
1
99,80%
501/502
98,92% – 100,00%
Intervallo di
confidenza 95%
#1
Donatori di
sangue
#2
#1 + #2
Pazienti
ricoverati
#3
siero
*: 3 donatori risultati indeterminati con il test di riferimento sono stati esclusi dai calcoli
9.2.2.Sensibilità diagnostica
La sensibilità diagnostica è stata studiata su 575 campioni di pazienti affetti da virus dell'epatite C. Tra questi
campioni, 25 provenivano da pazienti campionati nelle 24 ore precedenti all'analisi. Sono stati testati 481
diversi campioni genotipizzati (1; 2; 3; 4; 5; 6).
Tabella 1: Genotipi testati
1
2
3
4
5
6
(1, 1a, 1b, 1a/b)
(2 2a/c, 2a,
2b, 2b/3
(3, 3a, 3b, 3c)
(4, 4a, 4a/c, 4a/c/d,
4c, 4e, 4h, 4n, 4r)
(5, 5a)
(6, 6a, 6a/b, 6n)
241
56
107
63
8
6
Genotipi
N
Total
e
481
La sensibilità diagnostica di tutti i campioni testati è pari al 100% (575/575) con un intervallo di confidenza
del 95% di [99,4-100,0].
Campioni di pazienti con infezione acuta:
39 gruppi di sieroconversione (10 profili di capside, 10 profili NS3 e 19 profili multipli) sono stati testati con
dosaggio Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 e confrontati con un dosaggio combinato di antigeni/anticorpi e
con un dosaggio di anticorpi anti-HCV entrambi con marcatura CE. In tutti i gruppi si è ottenuta una
rilevazione precoce.
Di questi 39 gruppi, uno non è stato rilevato da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2 e tre non sono stati
rilevati dal dosaggio combinato Ag-Ab assunto come confronto.
Dei 38 gruppi rilevati da Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2, 5 hanno registrato una rilevazione precoce, 27
una rilevazione equivalente e 6 una rilevazione tardiva rispetto al dosaggio combinato Ag-Ab. Rispetto a un
test con anticorpi anti-HCV, 28 gruppi hanno registrato una rilevazione precoce, 9 una rilevazione
equivalente e 1 una rilevazione tardiva.
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2
Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2
contro dosaggio combinato Ag-Ab
contro dosaggio Anti-HCV
HCV
Numero di gruppi
38
38
Rilevazione precoce
5
28
Rilevazione equivalente
27
9
15
Rilevazione tardiva
6
1
9.3. Specificità analitica / studio di reattività incrociata
365 campioni potenzialmente interferenti contenenti anticorpi contro patogeni che potrebbero provocare
patologie infettive (Citomegalovirus, virus di Epstein Barr, VZV, virus del morbillo, virus della rosolia, virus
della parotite, virus dell'herpes, virus dell'influenza, virus dell'epatite A, virus dell'epatite B, HIV 1/2, HTLV
1/2, sifilide, Toxoplasma gondii, Dengue, Chagas), campioni del gruppo a rischio (pazienti dializzati, affetti
da cirrosi non epatica, donne in gravidanza, donne pluripare) o campioni di pazienti con disturbi del sistema
immunitario (autoanticorpi, fattori reumatoidi, anticorpi anti-topo e mielomi) sono stati testati con Monolisa™
HCV Ag-Ab ULTRA V2 test.
Due campioni sono risultati ripetutamente positivi con il test Monolisa™ HCV Ag-Ab ULTRA V2. La
specificità osservata in questa popolazione target pari al 99,45% (363/365) era simile alla specificità dei
campioni clinici.
9.4. Effetto gancio
È stata studiata l'esistenza di un possibile effetto gancio testando 5 campioni con titoli alti a varie diluizioni.
L'equivalenza di risultati osservati tra i campioni diluiti e non diluiti mostra l'assenza dell'effetto gancio.
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18
19
20
21
22
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincare
92430 Marnes-la-Coquette - Francia
Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00
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23
2013/09
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