Impiego illecito di anabolizzanti
nei bovini da carne
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Gli anabolizzanti, naturali o di sintesi, influenzano il metabolismo dell’animale
migliorando il rapporto di conversione tra assunzione di alimento ed incremento
ponderale, favorendo lo sviluppo dei tessuti muscolari.
La massa muscolare può essere incrementata o con un aumento del numero delle
miofibre o con un aumento del loro diametro –ipertrofia-.
Gli anabolizzanti più usati sono sostanze ad azione ormonale che si distinguono in
estrogeni, androgeni e progestinici e in relazione alla loro origine in ormoni
steroidei naturali o endogeni (17-beta estradiolo, testosterone e progesterone) e in
ormoni artificiali (trenbolone e zeranolo).
Gli ormoni artificiali si dividono inoltre in steroidi in grado di liberare rapidamente
in vivo l’ormone naturale (estradiolo benzoato e testosterone palmitato); in steroidi
a lenta metabolizzazione (trenbolone) ed in composti non steroidei ad azione
ormonale (dietilstilbestrolo o DES).
Si ritiene che gli anabolizzanti ormonali determinano un aumento della ritenzione di
azoto in forma di proteine muscolari, che si accompagna ad una minore tenerezza
delle carni.
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Anabolizzanti
Le molecole, naturali o di sintesi, utilizzate a scopo anabolizzante appartengono
principalmente alle seguenti c a t e g o r i e :
Ormoni sessuali e analoghi di sintesi
E s t r o g e n i: 17-b-estradiolo; etinilestradiolo; dietilstilbestrolo.
·Androgeni: testosterone; stanozololo; metiltestosterone; trenbolone.
G e s t a g e n i: progesterone; clormadinoneacetato; medrossiprogesteroneacetato.
Beta-agonisti
clenbuterolo; salbutamolo; mabuterolo; mapenterolo.
Cortisonici
prednisolone; desametazone; beclometazone.
Tireostatici
metiltiouracile; tapazolo.
Ormone della crescita
somatotropina; somatotropina ricombinante.
• Gli ormoni sessuali, i cortisonici e i beta-agonisti sono quelli più utilizzati dal
mercato illegale. Spesso vengono impiegati sotto forma di associazioni quali
ad es.:
• ·Estrogeni + Androgeni (estradiolo + testosterone).
• ·Estrogeni + Gestageni (estradiolo + progesterone).
• ·Ormoni sessuali + beta-agonisti + Corticosteroidi (cocktails con 5-30
componenti, estrogeni, androgeni, gestageni, beta-agonisti e
corticosteroidi).
• La somministrazione avviene per:
• via parenterale (iniezione)
• via transcutanea (pour-on)
• via orale
• impianto sottocutaneo
• Effetti degli anabolizzanti sul bovino
• Gli animali trattati con anabolizzanti vanno incontro a:
• alterazioni del comportamento;
• modificazione dei parametri zootecnici caratteristici della razza e
alterazioni morfo-funzionali di alcuni organi ispezionabili alla visita clinica;
• alterazioni morfologiche e funzionali a carico di diversi organi interni.
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Alterazioni del comportamento
• Sintomi
Molecola responsabile
• Ipereccitabilità, tremori, sudorazione
b-agonisti
• Aumento della libido
Androgeni, estrogeni
• Ipereccitazione, aggressività
Androgeni
• Sottomissione, movimenti lenti
Progestinici
• Modificazione dei parametri zootecnici caratteristici della razza e
alterazioni morfo-funzionali di alcuni organi ispezionabili alla visita
clinica
• Maschi
• muscolatura molto sviluppata;
• testicoli di dimensioni ridotte;
• ghiandola mammaria aumentata di volume;
• Femmine
• muscolatura molto sviluppata, soprattutto dei quarti anteriori e del collo;
• aumento di dimensioni del clitoride;
• edema della vulva;
• ghiandola mammaria e capezzoli aumentati di volume nei soggetti
impuberi;
• aumento delle secrezioni vaginali;
• inserzione “alta” della coda.
• Alterazioni morfologiche a carico dei principali organi
bersaglio-Effetti degli estrogeni
• Effetti sui maschi
• Quadro macroscopico: testicoli ridotti in dimensione e
sviluppo, aspetto biancastro della superficie di taglio della
prostata, aumento di dimensioni dei capezzoli, sviluppo della
ghiandola mammaria.
• Quadro istologico: atrofia testicolare, iperplasia/metaplasia
e fibrosi nella prostata e nelle ghiandole bulbo-uretrali,
differenziazione della mammella
• Effetti sulle femmine
• Quadro macroscopico: aumento di volume dell’utero; ovaie
cistiche o atrofiche; aumento di volume della ghiandola
vestibolare maggiore, della ghiandola mammaria e dei
capezzoli nei soggetti impuberi.
• Quadro istologico: metaplasia nella cervice e iperplasia/
metaplasia e fibrosi nella ghiandola vestibolare maggiore;
• ovaie cistiche o atrofiche; mucometra, sviluppo precoce della
porzione ghiandolare secernente (differenziazione) della
ghiandola mammaria nei soggetti impuberi
• Effetti degli androgeni- Effetti sui maschi
• Quadro macroscopico: testicoli ridotti in
dimensioni e sviluppo;
• aumento di volume delle ghiandole bulbouretrali.
• Quadro istologico: ipersecrezione, formazione
di cisti e fibrosi a livello di prostata e
ghiandole bulbo-uretrali;
• atrofia testicolare
• Effetti sulle femmine
• ·Quadro macroscopico: aumento di volume del
clitoride.
• ·Quadro istologico: aumento di dimensioni del
clitoride e separazione del prepuzio. A livello
della ghiandola vestibolare maggiore
ipersecrezione, formazione di cisti e fibrosi
• Effetti dei tireostatici
Quadro macroscopico: aumento di volume e di peso fino a tre volte
della tiroide.
tiroide normale vitello: 11-20 g (>35 g: sospetto trattamento con
tireostatici); tiroide normale vitellone 20-40 g.
Quadro istologico: iperplasia/struma tiroideo
Effetti dei corticosteroidi
Quadro macroscopico: riduzione del volume e del peso del
timo (50-100 g, sino all’atrofia completa, contro i 400-800
g di un timo normale) e delle ghiandole surrenali.
Quadro istologico: atrofia e deplezione linfocitaria del timo;
involuzione adiposa e fibrosi;
• ipotrofia della corticale del surrene
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• Effetti dei b-agonisti
• Quadro macroscopico: rilassamento della muscolatura liscia
tracheale con aumento del diametro trasversale dell’organo
associato a scomparsa della cresta tracheale; riduzione del
grasso sottocutaneo e perirenale
Effetti tossici sugli animali
Gli anabolizzanti possono causare:
epatotossicità;
nefrotossicità;
ridotta fertilità;
aborto o mummificazione del feto nelle vacche gravide;
infezioni dovute all’immunodepressione (mastiti, artriti, peritoniti,
metriti);
• trauma a livello del punto di inoculazione della sostanza;
• cancerogenicità: dimostrata negli animali da laboratorio
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SCREENING
Significato e indicazioni dello screening
Lo screening utilizza metodiche di indagine ad elevata sensibilità i cui esiti
sono caratterizzati da pochi falsi negativi. Nel caso specifico, consente di
comprendere le dimensioni e la diffusione del fenomeno legato all’uso
fraudolento degli anabolizzanti.
Indagini utilizzabili per lo screening
Esame clinico dell’animale pre-macellazione
Esame macroscopico degli organi bersaglio
Esame istologico degli organi bersaglio
Esame clinico pre-macellazione
“Alterazioni del comportamento” - “Modificazione dei parametri zootecnici
caratteristici della razza e alterazioni morfo-funzionali di alcuni organi
ispezionabili alla visita clinica”.
• Nel vitello e nel vitellone l’esame istologico degli organi bersaglio
consente di stabilire con elevato grado di affidabilità : l’avvenuta
somministrazione di ormoni sessuali o analoghi di sintesi, cortisonici e
tireostatici.
• L’esame clinico, la valutazione della carcassa e l’esame macroscopico degli
organi: hanno valore orientativo sia per quanto riguarda gli ormoni
steroidei citati sia i beta-agonisti.
• Organi sottoposti ad esame istologico
• Prostata, ghiandola bulbo-uretrale, timo, tiroide- vitelli e vitelloni maschi
• Ghiandola vestibolare maggiore, ghiandola mammaria, timo, tiroide vitelle femmine
• Ghiandola vestibolare maggiore, timo, tiroide manzette (scottone: 15-18
mesi)
Ghiandola vestibolare maggiore (di Bartolino), standard normale e patologico dovuto all’effetto degli ormoni
sessuali NORMALE
La ghiandola si trova sulla parete laterale esterna del vestibolo vaginale a 3-5 cm dalla vulva, ha forma globosa
e un diametro di circa 2 cm.
Prelievo: la ghiandola si può raggiungere direttamente dall’esterno del vestibolo o dall’interno localizzando lo
sbocco del dotto escretore principale sulla parete laterale vestibolare.
Al fine di meglio evidenziare istologicamente il tessuto ghiandolare, deve essere prelevata la parte distale della
ghiandola che si trova al polo opposto del dotto escretore principale.
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Istologicamente è una ghiandola tubulo alveolare composta a secrezione mucosa, suddivisa
in lobuli da setti di connettivo denso. Presenta tre componenti principali:
1) il parenchima funzionale, formato da adenomeri a carattere mucoso poco rappresentato
nelle femmine impuberi; è ben sviluppata negli animali in età pubere e nelle vacche;
2) il tessuto stromale mio-connettivale: tessuto di sostegno, contenente il sistema vasale
emo-linfatico.
3) dotti escretori: monostratificato in sede lobulare, a più strati nei dotti intermedi,
pavimentoso stratificato, simile all’epitelio di rivestimento della cavità vaginale, nel dotto
principale.
Negli acini e nei dotti delle vitelle impuberi modesto o assente è il riscontro muco-secretivo
mentre può essere presente in quantità moderata nei soggetti puberi.
PATOLOGICO
Valutazione macroscopica: negli animali trattati con ormoni sessuali la ghiandola può
aumentare di volume e di consistenza. Possono essere presenti cisti visibili
macroscopicamente.
• Quadro istologico: iperplasia/metaplasia squamosa
dell’epitelio sia ghiandolare sia duttale, associato
talvolta a quadri di ipersecrezione, ipertrofia dello
stroma fibro-muscolare.
• Ectasia pronunciata dei dotti, formazione di cavità
cistiche e cisti intraepiteliali a livello dei dotti
escretori sono le conseguenze dell’ipersecrezione
che può essere o meno associata ad iperplasia.
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Prostata e uretra, standard normale e patologico dovuto all’effetto degli
ormoni sessuali
NORMALE
L’organo consta di due parti: una parte esterna, c o r p o della prostata, e una
parte interna, porzione disseminata.
Il corpo della prostata è costituito da due lobi appena accennati, collegati fra
loro mediante un istmo connettivale ed è disposto sulla superficie dorsale
dell’uretra pelvica, caudalmente alle vescicole seminali, presentandosi come
un corpo piccolo e appiattito. Ha uno spessore, dorso-ventralmente, di 0,5-1,5
cm, è lungo 0,5-1 cm circa e largo 2-3 cm. La parte disseminata è ben
sviluppata ed è incorporata nella parete dorsale dell’uretra per una lunghezza
dai 7 ai 15 cm circa, in rapporto all’età degli animali. Questa porzione, visibile
solo quando si seziona l’uretra, è avvolta a manicotto dal muscolo uretrale.
• Struttura: il corpo della prostata è avvolto da una capsula da cui deriva
uno stroma abbondante e ricco di cellule muscolari lisce.
• Il parenchima viene ad essere suddiviso dai setti in lobuli irregolari che
convergono verso l’uretra.
• Lo stroma è qui ancora abbondante e sostiene, oltre ai vasi ed ai nervi, un
insieme di ghiandole tubuloalveolari, ogni gruppo delle quali è incentrato
su un collettore che sbocca nell’uretra.
• Gli alveoli sono rivestiti da un epitelio di aspetto variabile che riposa su
una membrana basale esile e spesso indistinta: si presenta basso e con
cellule cilindriche o cubiche in certi punti, dotate di espansioni apicali che
indicano una secrezione di tipo apocrino. Queste cellule, con nucleo
ovoidale e basale, presentano tutte le caratteristiche di un’attività
secernente nei vitelloni; mentre è per lo più assente nei vitelli.
• I condotti escretori sono dapprima irregolari e provvisti di numerose
dilatazioni e di diverticoli secernenti.
• Dotati di epitelio prismatico, confluiscono nei canalicoli prostatici, più
stretti e meno irregolari, che sboccano nell’uretra modificando il loro
epitelio che diventa progressivamente del tipo di transizione per unirsi a
quello dell’uretra. Una lieve attività secernente con accumulo di modeste
quantità di secreto nei dotti rientra nella norma.
• L’uretra è rivestita da un epitelio di transizione dalla superficie liscia,
formato da circa sei file di cellule sovrapposte, aventi il rapporto N/C a
favore del nucleo. L’età degli animali normalmente non determina
variazioni di assetto degne di nota.
• P r e l i e v o : una volta evidenziata l’uretra pelvica e la vescica urinaria,
si esegue una sezione dello spessore di 1 cm trasversalmente all’uretra
pelvica a 1 cm di distanza e caudalmente al corpo della prostata.
• PATOLOGICO
• Valutazione macroscopica: negli animali trattati la prostata può essere
aumentata di volume sia a livello del corpo sia nella parte disseminata
accompagnato da un aspetto biancastro dell’organo.
• Quadro istologico: iperplasia/metaplasia squamosa dell’epitelio sia
ghiandolare sia tubulare.
• Ipersecrezione e formazione di cisti di discrete dimensioni associate o
meno alle lesioni iperplastiche.
• L’epitelio uretrale è ispessito, metaplastico e forma delle pieghe, il
citoplasma delle cellule degli strati più superficiali è aumentato di volume,
il rapporto N/C è a favore del citoplasma.
• I trattamenti anabolizzanti possono determinare anche atrofia, con
diminuzione delle file di cellule.
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Ghiandola bulbo-uretrale, standard normale e patologico dovuto all’effetto degli
ormoni sessuali
NORMALE
Omologhe delle vestibolari maggiori nella femmina, di forma globosa lievemente
allungata, sono disposte sulla superficie dorsale dell’uretra, una a destra ed una a
sinistra,poco prima che questa esca dalla cavità pelvica, in stretto rapporto con il
bulbo del pene. Le dimensioni variano da 0,5-1 cm nei vitelli a 2-3 cm nei soggetti
puberi. Le due ghiandole possiedono ognuna un dotto escretore che sbocca nella
parete dorsale dell’uretra.
Struttura: possiedono una capsula di rivestimento e uno stroma denso, ricco di
cellule muscolari lisce e di fibre striate, che racchiude lobuli ghiandolari, composto
da ghiandole tubulo-alveolari/acinose, a carattere mucoso, con al centro un dotto
escretore che termina in uno o più dotti collettori aventi lo stesso epitelio dei dotti
ghiandolari. L’ epitelio di rivestimento degli adenomeri mostra aspetto variabile a
seconda della zona e dello stadio funzionale: nel vitello dove si trova in condizioni
di riposo, è cubico o
• L’ epitelio di rivestimento degli adenomeri mostra aspetto variabile a
seconda della zona e dello stadio funzionale: nel vitello dove si trova in
condizioni di riposo, è cubico o prismatico semplice; nei soggetti puberi le
cellule secernenti appaiono cilindriche o piramidali. La composizione
acinosa a carattere mucoso nei bovini adulti risulta determinante per
tutto lo spessore ghiandolare, mentre nei vitelli il tessuto è decisamente
immaturo.
• Prelievo: dopo aver prelevato la prostata, si localizzano le
ghiandole bulbo-uretrali nella porzione caudale dell’uretra
sotto al muscolo bulbo-spongioso e si preleva un campione
delle dimensioni di 1´1´2 cm.
• PATOLOGICO
• Iperplasia/metaplasia squamosa dell’epitelio alveolare e dei
dotti escretori, ipersecrezione, formazione di cisti, iperplasia
fibro-muscolare. Lesioni iperplastiche e ipersecretive possono
essere presenti sia singolarmente sia associate.
• Tra le sostanze ormonali utilizzate fraudolentemente, il 17β- estradiolo
rappresenta una delle molecole di cui si sospetta ancora l’utilizzo illecito
negli allevamenti, malgrado il suo divieto assoluto in Europa ed in Italia a
causa della carcinogenicità nell’uomo.
• Nell’ambito del PNR la ricerca di questa molecola è prevista tramite
l’applicazione di analisi di screening con tecniche Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) e di conferma con
gas cromatografia (GC) o cromatografia in fase liquida (LC) associate a
spettrometria di massa (MS) effettuate sul siero degli animali.
• Tuttavia la molecola va incontro a rapida biotrasformazione,che la rende
difficilmente identificabile o viene somministrata in associazione ad altre
molecole a dosaggi sempre minori, non individuabili dalle tecniche
diagnostiche in uso.
A: Ghiandola bulbo-uretrale normale con assenza di ipersecrezione (score 0) EE; B:
Ghiandola bulbo-uretrale con grave e diffusa metaplasia (score 3) ghiandolare e con
ipersecrezione moderata e diffusa (score 2) EE.
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I risultati della ricerca evidenziano come il metodo istologico sia stato in grado
di evidenziare l’avvenuto trattamento con 17β-estradiolo anche se
somministrato a basso dosaggio.
L’osservazione microscopica ha potuto evidenziarne l’utilizzo illecito dopo
quindici giorni di sospensione.
È inoltre importante sottolineare che durante tutto l’esperimento le analisi
chimiche eseguite sul siero hanno evidenziato residui nella totalità dei
soggetti solo 12 ore dopo il quarto inoculo della molecola, dimostrando che i
prelievi eseguiti da parte del servizio sanitario nazionale negli allevamenti
risulterebbero quasi sempre negativi in seguito a somministrazioni a basso
dosaggio.
Dalla ricerca è quindi emerso come la rilevazione di un’unica lesione, ossia la
metaplasia a carico delle ghiandole bulbo-uretrali, identifichi il trattamento
con 17β-estradiolo con elevato grado di affidabilità, permettendo un’estrema
semplificazione dell’interpretazione microscopica.
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Ghiandola mammaria, standard normale e patologico nella vitella impubere
dovuto all’effetto degli ormoni sessuali
NORMALE
Fino alla pubertà la ghiandola mammaria mantiene inalterata la morfologia
mentre, con l’avvio del ciclo sessuale inizia lo sviluppo della porzione secernente
e, con l’allattamento conseguente al parto, vengono raggiunti il pieno sviluppo e la
piena funzionalità. Ogni complesso mammario è costituito da due parti: il corpo
ghiandolare semisferico e il capezzolo.
Il corpo ghiandolare è formato dal parenchima ghiandolare e dal tessuto
connettivo interparenchimatoso dei dotti ed è rivestito dalla cute. Il sistema
cavitario è composto da tre segmenti: il dotto papillare, il seno galattoforo e i dotti
lattiferi.
La ghiandola mammaria è una ghiandola tubulo-alveolare. Il quadro istologico
presenta nella vitella i dotti escretori ramificati rivestiti da epitelio
monostratificato immersi in tessuto connettivo lasso e tessuto adiposo, circondati
inoltre da cellule mioepiteliali, cellule muscolari lisce e fibre elastiche.
• Nel soggetto impubere sono completamente assenti alveoli secernenti.
• P r e l i e v o : occorre prestare molta attenzione poiché nella vitella il
parenchima è ristretto a pochi cm di tessuto di colore rosa pallido
localizzato alla base del capezzolo dal quale si preleva un cubetto delle
dimensioni di 1´1´1 cm.
• PATOLOGICO
• Valutazione macroscopica: negli animali trattati con
estrogeni/progesterone la ghiandola mammaria è aumentata di volume e
i capezzoli possono essere allungati e lasciar fuoriuscire secreto.
• Quadro istologico: presenza più o meno pronunciata di tessuto
ghiandolare differenziato attorno ai dotti e negli spazi prima occupati dal
tessuto adiposo.
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Timo, standard normale e patologico dovuto all’effetto dei cortisonici
NORMALE
Il timo del bovino consta di una parte toracica e una parte cervicale. La parte
toracica, impari, è posta nella metà dorsale del mediastino asimmetricamente
a sinistra. La sua faccia destra è in rapporto con la trachea e con l’esofago.
La sua faccia sinistra è in parte rivestita dalla pleura. Il timo toracico è
connesso al tratto cervicale, impari, tramite l’istmo cervicotoracico, anch’esso
impari, che va a costituire un ponte parenchimatoso che decorre a sinistra
della trachea.
Nella parte cervicale del timo si distinguono un tratto caudale impari (corpo) e
due branche pari poste cranialmente.
Così il tratto cervicale del timo assume all’incirca la forma di una “V” con
l’apice rivolto verso il torace.
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Il corpo del timo cervicale giace dorsalmente alla trachea e viene affiancato dalle due vene
giugulari. Le branche si dispongono lateralmente alla trachea e raggiungono cranialmente
la ghiandola tiroide. Il tratto cervicale del timo è ricoperto lateralmente e centralmente
dal muscolo sternocleidomastoideo e dai muscoli ioidei inferiori.
Istologicamente il timo presenta una struttura lobulare.
I lobuli sono costituiti da una corticale più scura, e una midollare, più chiara, per la
presenza di linfociti in quantità maggiore nella prima e più diradati nella seconda.
Nella midollare sono presenti i corpuscoli di Hassall, del diametro di 20-100 μm formati da
lamine concentriche di cellule reticolari epiteliali in vari stadi di degenerazione.
Nella corticale si notano sparsi fenomeni apoptotici a carico dei timociti che vengono
inglobati dai macrofagi (tingible body macrophages). Nei vitelli la corticale può presentare
alla periferia piccole aree o strati sottili di tessuto adiposo ma rimane comunque sempre
chiaramente evidenziabile e supera quantitativamente la midollare.
Prelievo: è sufficiente prelevare un frammento, 1´1´2 cm, dal timo toracico chiaramente
evidenziabile sulla porzione craniale del mediastino davanti al cuore.
• PATOLOGICO
• Valutazione macroscopica: gli animali trattati con corticosteroidi
evidenziano riduzione di volume dell’organo sino alla sua scomparsa.
• Quadro istologico: i cortisonici causano la scomparsa dei timociti. Il timo
va incontro ad atrofia e il tessuto ghiandolare è sostituito da tessuto
adiposo. Tale fenomeno è più evidente a livello della corticale la quale si
assottiglia progressivamente a partire dalla periferia sino alla midollare.
• Nei casi più gravi il timo non è più riconoscibile ed è trasformato in una
massa di tessuto adiposo che ingloba sparsi cumuli di cellule linfocitarie.
• Tiroide, standard normale e patologico dovuto all’effetto dei tireostatici
• NORMALE
• La tiroide è localizzata anteriormente alla trachea, caudalmente alla
laringe. Essa risulta costituita da due lobi addossati alle superfici laterali
della trachea, e di una parte mediana o istmo, che aderisce alla faccia
ventrale della trachea.
• I due lobi laterali, dei quali il sinistro è generalmente più sviluppato, sono
appiattiti, consistenti al tatto e a contorno irregolarmente triangolare o
quadrangolare. L’istmo unisce tra loro i due lobi e risulta formato per lo
più da un cordone trasversale di tessuto ghiandolare, largo 1-1,5 cm,
applicato al secondo anello tracheale. Istologicamente possiede un
parenchima costituito da follicoli più o meno sferici
• Istologicamente possiede un parenchima costituito da follicoli più o meno
sferici delimitati da un epitelio semplice, piatto o cubico. Le cavità dei
follicoli sono ripiene di sostanza colloide, eosinofila, nella quale è
contenuto il secreto ghiandolare. Il volume ed il peso della tiroide variano
considerevolmente da soggetto a soggetto e secondo la razza, l’età ed il
sesso, ed anche con il variare delle condizioni climatiche e stagionali.
• Nel vitello ha un colore che varia dal bruno-grigiastro al bruno-scuro,
mentre nell’adulto è di color bruno-rossastro chiaro. La circolare 29.09.00,
n. 14 (GU 268, 16.11.2000) identifica il peso normale della tiroide nel
vitello tra gli 11 e i 14 grammi.
• Prelievo: la tiroide è addossata ai primi anelli tracheali, i lobi sono
disposti in posizione laterale e sono uniti dall’istmo costituito da tessuto
ghiandolare e connettivo. Il prelievo si esegue asportando un lobo della
ghiandola.
• PATOLOGICO
• Valutazione macroscopica: nei soggetti trattati con tireostatici le
alterazioni macroscopiche sono rappresentate da un semplice aumento di
volume e di peso dell’organo.
• Quadro istologico: le alterazioni istopatologiche dell’epitelio sono di tipo
iperplastico caratterizzate da proliferazione dell’epitelio follicolare con
formazioni di aspetto papillare o a cuscinetto associate a deplezione della
sostanza colloide, sino alla proliferazione pluristratificata che, nei casi più
gravi, determina la scomparsa del lume follicolare.
• L’aspetto generale dell’alterazione può essere quindi riferito ad uno
“struma iperplastico” che può aggravarsi sino allo “struma
parenchimatoso” in cui il tessuto ghiandolare assume un aspetto
compatto.
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I glicocorticoidi di sintesi (es. desametasone, betametasone, prednisolone,
metilprednisolone e flumetasone) sono molecole largamente impiegate nella
pratica clinica veterinaria. In particolare, il desametasone (DEX) è un agente
terapeutico che trova numerose applicazioni nelle specie da reddito.
Negli ultimi anni si è andato diffondendo in Europa l’utilizzo di tali farmaci come
promotori di crescita soprattutto nella specie bovina, sia da soli, sia in
associazione ad altri principi attivi non consentiti, quali estrogeni, androgeni e/o
β-agonisti.
l’impiego illecito di questi composti pone un serio problema per la salute del
consumatore: l’eventuale accumulo di residui negli organi edibili del bovino,
infatti, è potenzialmente pericoloso.
I possibili effetti nocivi comprendono:
azione immunodepressiva
alterazioni del metabolismo glicidico, con aumento della glicemia e resistenza
all’insulina.
• il passaggio dei cortisonici e dei loro metaboliti attraverso la
barriera placentare è stato associato ad aborti, parti prematuri,
insufficienza surrenalica dei neonati e ritardi nella crescita corporea
e nello sviluppo dell’encefalo.
• l’esposizione attraverso il latte materno può esitare in diminuito
accrescimento,
• disturbi del metabolismo e problemi di mineralizzazione ossea.
• la pericolosità dei residui dei glicocorticoidi sintetici è ben
documentata dalla fissazione nei Paesi dell’Unione Europea di
valori estremamente bassi relativi alla Dose Giornaliera Accettabile,
pari a soli 0,9 µg totali
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INDICAZIONI TERAPEUTICHE
I corticosteroidi naturali sono una famiglia di ormoni a struttura steroidea,
prodotti dalla corteccia delle ghiandole surrenali.
glicocorticoidi, dotati di azione antiinfiammatoria e antiallergica e
intervengono sul metabolismo di carboidrati, lipidi e proteine
mineralcorticoidi, che svolgono importanti funzioni per la regolazione
dell’equilibrio idro-elettrolitico.
In condizioni di stress o di ipoglicemia l’ormone adrenocorticotropo (ACTH)
secreto dall’ adenoipofisi stimola, a partire dal colesterolo, la sintesi del
cortisolo il principale ormone glicocorticoide, il quale favorisce le reazioni di
gluconeogenesi, attivando lipolisi e catabolismo proteico con un aumento del
tasso glicemico.
A livello cardiovascolare si verifica un incremento della forza di contrazione
cardiaca, della pressione sanguigna e della perfusione tissutale.
Parallelamente vengono inibite le reazioni immunitaria ed infiammatoria,
mediante la depressione della sintesi anticorpale, la riduzione del numero dei
linfociti e degli eosinofili circolanti, e la stimolazione della lipocortina che
reprime l’attività della fosfolipasi A2, enzima coinvolto nell’insorgenza del
processo infiammatorio.
Gli effetti fisiologici dei mineralcorticoidi, sono legati all’aumento della
ritenzione di sodio, cloro e acqua, a fronte di una maggiore escrezione di
potassio, fosforo e calcio, con conseguente aumento della pressione arteriosa.
• Le molecole sintetiche utilizzate a scopo farmacologico derivano
dal cortisolo ma, grazie ad alcune modificazioni della struttura
chimica, sono dotate di una maggiore attività
antiinfiammatoria (glicorticoidea) associata ad un minor
effetto sodio-ritentivo (mineralcorticoideo).
• Per quanto riguarda il bovino, il DEX (soprattutto sodio-fosfato)
viene largamente utilizzato in caso di disordini muscolo-scheletrici,
chetosi primaria, reazioni allergiche, shock ipovolemico e affezioni
cutanee di diversa natura.
• Inoltre, viene spesso associato ai chemioantibiotici per la terapia di
supporto delle malattie batteriche ad evoluzione iperergica, e
impiegato nelle vacche durante le ultime fasi della gestazione per
indurre il parto.
FARMACOCINETICA
• I glicocorticoidi sono caratterizzati da un rapido
assorbimento:
• In circolo vengono veicolati principalmente dalla transcortina,
una α-globulina specifica, e in misura minore dall’albumina; la
percentuale di legame dei composti di sintesi con le proteine
plasmatiche è inferiore a quella dei corrispondenti ormoni
endogeni (pari a circa il 90%), pertanto tendono a trasferirsi
con maggiore facilità ai tessuti, esplicando un’azione
farmacologica più rapida ed intensa.
• La biotrasformazione di tali molecole avviene
prevalentemente nel fegato tramite reazioni di ossidazione,
catalizzate principalmente dal citocromo P450 e dalle
steroido-deidrogenasi, e di coniugazione con acido
glucuronico e solfato.
IMPIEGO ILLECITO
• In riferimento al DLgs. 158/2006, per trattamento
illecito si intende “l’utilizzazione di sostanze o
prodotti non autorizzati, ovvero di sostanze o
prodotti autorizzati, a fini o a condizioni diversi
da quelli previsti dalle disposizioni vigenti”.
• L’impiego dei corticosteroidi al di fuori della
regolare prescrizione da parte del Medico
Veterinario e della conseguente annotazione su
apposito registro, si configura pertanto come
trattamento illecito.
• Il razionale per l’impiego dei glicocorticoidi quali promotori di
crescita si basa sui numerosi effetti “favorevoli” determinati
dalla somministrazione dei farmaci a bassi o bassissimi
dosaggi, ben inferiori a quelli utilizzati a scopo terapeutico.
• A dosi farmacologiche, infatti, i glicocorticoidi di sintesi
riducono l’indice di accrescimento e conducono ad atrofia
muscolare, in seguito al già citato aumento del catabolismo
proteico.
• Al contrario, la somministrazione di basse dosi per lunghi
periodi (3-6 settimane) attraverso la via orale, o l’impiego i.m.
di preparazioni ritardo capaci di garantire un lento rilascio del
principio attivo, possono influenzare positivamente
l’accrescimento degli animali e la qualità delle carni.
• In particolare, studi sperimentali condotti sia sui vitelloni sia
sui vitelli a carne bianca hanno dimostrato come, utilizzando
tali protocolli di trattamento, il DEX sia in grado di migliorare
l’indice di conversione e la conformazione delle carcasse, e di
aumentare moderatamente il volume delle masse muscolari.
• Quest’ultimo effetto, rilevato nel muscolo longissimus dorsi,
è stato messo in relazione con un incremento dei livelli
plasmatici di insulina, che riduce il catabolismo proteico e
favorisce la sintesi di nuove proteine aumentando la
captazione degli aminoacidi.
• L’utilizzo dei glicocorticoidi a scopo illecito è spesso associato
alla somministrazione di altri promotori di crescita, quali i βagonisti o gli steroidi anabolizzanti, allo scopo di sfruttare gli
effetti sinergici tra i diversi principi attivi.
• In particolare, il DEX ha la capacità di attenuare la sottoregolazione dei recettori β-adrenergici indotta dal
trattamento a dosi auxiniche con il clenbuterolo, aumentando
quindi l’efficacia di quest’ultimo quale agente di ripartizione.
• Inoltre, i cortisonici sono in grado sia di potenziare la lipolisi
sia di attenuare la glicogenolisi epatica e alcuni degli effetti
negativi sul muscolo (es. colorito scuro, aumento della
resistenza al taglio e diminuzione della sapidità) indotti dai
composti β-adrenergico-mimetici.
• L’associazione dei glicocorticoidi ad altri promotori di
crescita è giustificata anche dalla possibilità di
contrastare in parte le indagini degli organi di
controllo.
• L’azione inibente sull’ormone antidiuretico (ADH)
esercitata da tali composti determina, infatti, poliuria e
polidipsia, diminuendo la concentrazione urinaria di
altre molecole somministrate a scopo illecito.
• Infine, l’attività antiinfiammatoria viene sfruttata
fraudolentemente per ridurre, a livello del punto di
inoculo, le lesioni derivanti da ripetute
somministrazioni i.m. di sostanze più o meno
consentite.
METODOLOGIE DIAGNOSTICHE TRADIZIONALI
• Le alterazioni cliniche ed anatomo-patologiche
derivanti dalla somministrazione prolungata di
glicocorticoidi a basse dosi sono spesso
difficilmente evidenziabili.
• E’ possibile riscontrare fenomeni di poliuria e
polidipsia
• alla macellazione, l’organo maggiormente
interessato è il timo, che può presentarsi atrofico
e diminuito di peso, con un aumento della
componente adiposa e connettivale.
• Tale riscontro è evidente soprattutto nei vitelli a carne bianca
• Nei vitelloni, invece, le alterazioni si evidenziano maggiormente all’esame
istologico, con la presenza nella corticale di un caratteristico quadro
definito “a cielo stellato”, per i numerosi linfociti apoptotici e fagocitati dai
macrofagi.
• Per quanto riguarda le indagini ufficiali, i campioni da sottoporre ad analisi
sono l’urina (in allevamento) e il fegato (al macello).
• l’escrezione urinaria dei glicocorticoidi è rilevabile sia durante la
somministrazione, sia per un periodo variabile dopo la sospensione del
trattamento, a seconda della via di somministrazione, della dose e della
natura del composto impiegato; gli stessi fattori influenzano la persistenza
dei residui nel fegato, che si aggira intorno ai 6-8 giorni dall’ultimo
trattamento.
• Per le analisi di screening, le metodiche impiegate
sono quelle basate sui saggi immunoenzimatici, quali
l’ELISA, con un valore di cut-off pari a 2 ng/ml; per
l’eventuale conferma si ricorre, invece, alla
cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di
massa (LC-MS/MS).
• una scarsa efficacia dei controlli ufficiali nel
contrastare il ricorso illegale ai promotori di crescita,
sono da ricercare soprattutto nelle mutate strategie di
trattamento adottate dagli allevatori. Queste ultime,
infatti, prevedono l’impiego di dosaggi molto bassi e/o
di molecole di struttura sconosciuta, capaci di limitare
notevolmente l’efficacia dei controlli ufficiali
METODOLOGIE DIAGNOSTICHE COMPLEMENTARI
• Metodi innovativi che non si basano sull’identificazione
delle molecole, bensì sulla messa in evidenza degli
effetti specifici causati dall’impiego illecito delle stesse.
• Tale approccio consentirebbe di rilevare casi di
sospetta positività indipendentemente dalla natura e
dalla dose del composto utilizzato, permettendo di
orientare le indagini chimico analitiche e di contrastare
più efficacemente le nuove strategie di trattamento.
• In relazione al DEX, diversi lavori sperimentali hanno
proposto alcuni parametri quali biomarcatori di
trattamento illecito con tale farmaco nel bovino da
carne
• a) Morfologia del timo
• Le alterazioni di quest’organo in seguito alla somministrazione del DEX
sono state studiate sperimentalmente soltanto nei vitelli a carne bianca.
Negli animali trattati secondo un dosaggio terapeutico (due
somministrazioni i.m di 15 μg/kg a distanza di una settimana) o
anabolizzante (0,4 mg al giorno per os per 23 giorni), il timo presenta una
progressiva atrofia, deplezione linfocitaria e aumento della componente
adiposa, con conseguente diminuzione di peso dell’organo, soprattutto in
rapporto al peso corporeo.
• nel vitello a carne bianca l’atrofia timica regredisce velocemente al
termine del trattamento, sia esso per via i.m. o orale, e che l’organo
mostra una rigenerazione completa a distanza, rispettivamente, di 25 e 11
giorni dall’ultima somministrazione, compatibile con il tempo di attesa
previsto per alcune fra le specialità medicinali più impiegate.
• Poiché i trattamenti illeciti, invece, vengono protratti fino a
pochi giorni dalla macellazione, per garantire gli effetti
anabolizzanti desiderati, le lesioni timiche potrebbero
essere ancora evidenziabili.
• Nel complesso, l’esame istopatologico viene proposto come
un efficace test di screening per contrastare l’uso illegale dei
corticosteroidi nella produzione dei vitelli a carne bianca.
• Recentemente, infatti, la morfologia timica è stata
impiegata, insieme alla determinazione chimica nel fegato,
quale parametro per valutare la positività ai più comuni
glicocorticoidi in uno studio di campo condotto sia sui vitelli
a carne bianca sia sui vitelloni
• Modulazione degli enzimi farmaco-metabolizzanti
• Gli enzimi biotrasformativi hanno un ruolo chiave nella conversione
delle sostanze endogene e xenobiotiche in composti più polari ed
idrosolubili.
• In particolare, i corticosteroidi costituiscono il substrato di
numerosi enzimi, e sono in grado, a loro volta, di incrementarne
l’espressione, così come riportato per il citocromo P450 (CYP) 3A
epatico sia nell’uomo sia nel ratto.
• gli studi condotti finora nel bovino non hanno confermato tali dati.
In due esperimenti simili ma indipendenti, condotti rispettivamente
nei vitelli a carne bianca e nei vitelloni, è stato osservato come la
somministrazione di DEX sia per os sia i.m. non moduli in modo
significativo nel fegato l’espressione genica del CYP3A, misurata
mediante la PCR quantitativa (real-time PCR)
• Tasso di cortisolo ematico
• Uno degli effetti del trattamento con i glicocorticoidi è
l’inibizione dell’attività dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene,
che determina una riduzione della sintesi endogena di
cortisolo.
• Pertanto, in uno studio condotto in campo, un gruppo di
ricercatori italiani ha valutato la possibile correlazione tra i
livelli ematici di tale ormone e l’impiego illecito dei
corticosteroidi
• Da queste indagini è emerso che il tasso di cortisolo ematico è
inversamente proporzionale alla severità delle lesioni timiche,
e che concentrazioni inferiori a 2 ng/ml sono correlate in
modo significativo con la presenza di residui del
glicocorticoidi nel fegato.
• Modulazione dei recettori linfocitari
• L’azione dei glicocorticoidi a livello cellulare è mediata dal legame
con recettori citoplasmatici (glucocorticoid receptors,GR), che
regolano l’espressione genica e, quindi, proteica di specifici
effettori.
• Tra questi ricordiamo la tirosina aminotransferasi (TAT), un enzima
a prevalente localizzazione epatica il cui ruolo fisiologico consiste
nell’avviare la gluconeogenesi a partire dagli aminoacidi. In
particolare, l’incremento di espressione della TAT, dimostrato
nell’uomo e nel ratto, rappresenta una delle risposte più precoci e
sensibili in seguito alla somministrazione dei glicocorticoidi
• Peraltro, i GR sono essi stessi regolati dall’azione dei cortisonici
secondo un meccanismo di feed-back negativo che determina nei
tessuti bersaglio una riduzione dei livelli recettoriali e della
conseguente risposta biologica
• In tre esperimenti distinti, condotti su vitelli a carne bianca o
vitelloni trattati con il DEX per os secondo diversi protocolli
anabolizzanti, l’espressione genica nel fegato sia del recettore sia
dell’enzima non è risultata significativamente modificata dalla
somministrazione del farmaco.
• Analogamente, non sono stati riscontrati incrementi apprezzabili
dell’attività catalitica della TAT nei vitelloni, che si presenta
addirittura ridotta nei vitelli a carne bianca.
• Al contrario, la modulazione recettoriale in seguito al trattamento
con il DEX risulta evidente e specifica nei linfociti periferici
provenienti da vitelli a carne bianca trattati con una delle più
utilizzate combinazioni di promotori di crescita (17β-estradiolo,
clenbuterolo e DEX).
• Nel suddetto studio, la significativa riduzione della concentrazione
dei GR in queste cellule, determinata con tecniche R.I.A.
(radioimmunoassay), coincide in particolare con il periodo di
somministrazione orale del glicocorticoide, dimostrando la
causalità del fenomeno, ed è in accordo con quanto riportato per i
linfociti umani
•
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Approccio proteomico
La maggior parte dei promotori di crescita e delle molecole ad effetto anabolizzante,
agisce prevalentemente attraverso meccanismi di tipo trascrizionale, che
determinano un incremento/decremento della sintesi di proteine specifiche.
Le indagini di proteomica consentono di individuare, nelle proteine
differenzialmente espresse, dei biomarcatori indiretti del trattamento.
Applicando la tecnica dell’elettroforesi bidimensionale (2D-E) a fluidi (siero, plasma)
e omogenati di tessuti o frazioni subcellulari, è possibile discriminare ciascuna
proteina sottoforma di un punto (spot) colorato su un gel di poliacrilamide.
L’analisi quantitativa dell’intensità di tali spot per mezzo di appositi software
consente di rilevare le eventuali differenze fra una situazione di “controllo” ed una
situazione “alterata”.
L’identificazione delle proteine d’interesse avviene, quindi, determinando le
sequenze peptidiche con l’ausilio di particolari spettrometri di massa (MALDI-TOF), e
confrontandole con banche dati specifiche disponibili in rete.
• Recentemente l’applicazione di tale approccio ha permesso di
identificare per la prima volta un marcatore proteico nelle
frazioni subcellulari epatiche di vitelli a carne bianca trattati
con 17β-estradiolo, clenbuterolo e DEX.
• L’espressione dell’ adenosina chinasi (ADK), un enzima
citosolico coinvolto nel metabolismo glicidico, è risultata
diminuita di circa il 50% rispetto agli animali di controllo
• In considerazione del ruolo dell’ADK nel metabolismo
glucidico, sarebbe lecito attendersi un coinvolgimento dei
glicocorticoidi nella modulazione di tale enzima.
• Approccio genomico
• la modulazione dell’espressione proteica indotta dai promotori di
crescita può essere determinata anche a livello genico, mediante
tecniche che consentono di rilevare differenze della quantità di
RNA messaggero.
• In particolare, la real-time PCR viene più frequentemente utilizzata
con un approccio di tipo gene-candidato, ossia nello studio mirato,
in specifici organi o tessuti, dell’espressione di geni ritenuti
coinvolti in un determinato processo cellulare
• I microarray (matrici ad alta densità), invece, consentono di
confrontare i profili di espressione di due o più campioni,
utilizzando supporti solidi su cui vengono “fissate” migliaia di
sequenze nucleotidiche corrispondenti ad altrettanti geni.
• Questo secondo tipo di approccio ha il vantaggio di poter analizzare
contemporaneamente moltissimi geni appartenenti a differenti
categorie di processi cellulari e, anche se necessita di una
successiva validazione mediante real-time PCR dei risultati ottenuti,
può evidenziare variazioni geniche altrimenti non rilevate.
• Nel 2009 è stato pubblicato il primo lavoro nel quale la combinazione di
tali metodologie è stata impiegata per la caratterizzazione del profilo
genico muscolare di vitelloni (Charolaise x Limousine) trattati
sperimentalmente con dosi auxiniche di DEX (0,75 mg/capo per os per 43
giorni), da solo o in associazione con tre iniezioni intramuscolari di 17βestradiolo (20 mg/capo) a intervalli di 14 giorni. I risultati delle analisi di
microarray rivelano che il trattamento con il glicocorticoide determina
l’aumento della trascrizione di un elevato numero di geni (609), la
funzione biologica dei quali può essere ricondotta a tre categorie
principali di processi cellulari: motilità e comunicazione, trasmissione del
segnale e metabolismo proteico.
• Di particolare rilievo è risultata la sovra-regolazione di geni associati con
la miogenesi e l’ipertrofia muscolare e la sotto-regolazione del gene
codificante per la miostatina, una proteina che svolge un ruolo chiave nel
controllo (negativo) della proliferazione muscolare.
• Tali effetti sono significativamente attenuati dalla
somministrazione degli estrogeni, con un numero di geni
regolati in senso positivo rispetto ai controlli pari a 77, di cui
poco meno della metà coincide con quelli identificati negli
animali trattati con il solo glicocorticoide.
• La successiva validazione dei dati mediante real-time PCR su
alcuni dei geni maggiormente modulati ha permesso di
identificare una serie di marcatori molecolari, specifici per la
somministrazione del DEX.
• Per quanto riguarda l’associazione glicocorticoide-estrogeni,
invece, i risultati sono meno affidabili, e sottolineano come il
ricorso a più sostanze illecite favorisca, ancora una volta, il
mascheramento degli effetti indotti dai singoli composti.
Parametro
tecnica
matrice
caratteristiche
vantaggi
svantaggi
referenze
Morfologia/ist
ologia
timo
Atrofia e
assottigliamen-to
corticale
Sensibilità elevata
Facilità
esecuzione
Analisi post-mortem
Discrezionalità
operatore
Possibili falsi positivi
per pregressa terapia
cortisonica
Biolatti et al., 2005
Enzimi
farmaco
metabolizzant
i
fegato
Modulazione positiva
o negativa di CYP3A,
CYP2E1
Facilità
esecuzione
Analisi post-mortem
Specificità non elevata
Giantin et al. 2010
Cortisolo
ematico
Siero
Diminuzione
Analisi in vivo
Facilità di
esecuzione
Costo contenuto
Adattabilità ad
indagini
su vasta scala
Recettori
glicorticoidei
Linfociti
periferici
diminuzione
Analisi in vivo
Separazione dei linfociti
indaginosa
Tecnica analitica
complessa (RIA)
Odore et al., 2006
Proteomica
Siero, plasma,
tessuti
Identificazione di
biomarcatori proteici
Analisi in vivo e
post mortem
Indagine di
validazione e
screening, costi
bassi,
Variabilità individuale
Nebbia et al., 2008
Vascellari et al.,
2008
Marin et al., 2008
• I biomarcatori non potranno mai sostituire le metodiche previste
nell’ambito dei controlli ufficiali, ma potrànno fornire un utile ausilio in
sede di screening, in modo da orientare le indagini di conferma.
• A tale proposito è bene ricordare come l’impiego di test di screening
basati sull’azione biologica delle molecole in questione è stato
ufficialmente riconosciuto dalla Comunità Europea per la ricerca dei PCB e
dei composti diossino-simili (Regolamento (CE) n.1883/2006).
• la disponibilità di biomarcatori affidabili può costituire un importante
strumento per le associazioni di allevatori e produttori e le grandi catene
di distribuzione, al fine di mantenere un elevato standard di qualità e
sicurezza della filiera animale.
