I.T.S.E. Cecilia DEGANUTTI
CERCASI
ENZIMA
ALUNNI:
Bogojevic Lidija
De Stefano Davide
Gabara Mihai Andrei
Stoian Ioana
Versolatto Sara
INSEGNANTE: Prof.ssa Cinello Eugenia
TECNICO LABORATORIO: Finiello Carmen
CERCASI ENZIMA
Nepenthes X “Rebecca Soper”: è una pianta insettivora che ha
sviluppato un metodo di cattura degli insetti per la necessità di sali
minerali non presenti nel terreno originario. Presenta ascidi
(particolari coppe presenti come prolungamento delle foglie)
contenenti liquido digestivo. Il colore particolare e il suo odore
serve per attirare gli insetti al loro interno.
Enzima: è un catalizzatore biologico, cioè una molecola proteica
capace di accelerare le reazioni senza subire trasformazioni
chimiche permanenti.
Gli enzimi sono regolati da:
Temperatura
Grado di acidità
Presenza di coenzimi
Domande guida:
• Come digerisce la nostra pianta carnivora?
• L’attività delle proteasi è analoga a quella dell’uomo?
• Il meccanismo di azione dei suoi enzimi è riconducibile al modello conosciuto di
attività enzimatica digestiva dell’uomo?
COME ABBIAMO CERCATO DI RISPONDERE:
• Individuando al microscopio il tessuto
ghiandolare che secerne il liquido
digestivo.
• Misurando il pH degli ascidi per individuare
relazioni con l’attività digestiva della pianta.
Osservazioni:
•Si modifica solo il pH degli ascidi con BSA (A e B).
•Il pH sale durante la digestione.
•Le modifiche di pH possono dipendere o da un effetto
tampone degli AA o da una reazione della pianta.
COME ABBIAMO CERCATO DI RISPONDERE:
•Individuare metodi adeguati per rilevare l’attività digestiva e le modalità di
attivazione e di blocco della proteasi.
Proteina utilizzata: BSA
Abbiamo deciso di utilizzare BSA purificata (siero albumina bovina) per semplificare lo
studio della digestione proteica.
Metodo: spettrofotometria
Strumento: Spettrofotometro
Esso misura la trasmitanza e l’assorbanza.
É formato da 5 parti: sorgente luminosa,
monocromatore, chopper, vano porta
campioni e fototubo.
Assorbanza: è l'unità di misura con la quale
si individua l'assorbimento della luce ad
una certa λ da parte di un colorante.
Colorante utilizzato: Blu brillante di Coomassie G-250
Esso si lega alle proteine causandone la colorazione (più
alta è la concentrazione di proteina, più scuro è il colore).
ESPERIMENTO 1
Procedimento:
Aggiunto BSA al liquido digestivo della pianta, proseguito l’esperimento effettuando prelievi dagli ascidi A e B:
In VITRO:
•Conservato i campioni a temperatura ambiente.
•Dopo 24, 48, 72 ore bloccato l’attività enzimatica aggiungendo
NaOH fino a pH 7 e raffreddando i campioni (-18°).
In VIVO:
•Dopo 24, 48, 72 ore e bloccato l’attività enzimatica
aggiungendo NaOH fino a pH 7 e raffreddando i campioni
(-18°).
RISULTATI DELL’ANALISI SPETTROFOTOMETRICA:
•Sono migliori nei campioni trattati con la soluzione di idrossido di sodio.
•L’assorbanza generalmente diminuisce (= digestione) per poi aumentare...
...perché?
POSSIBILI CAUSE:
•Torbidità: sul fondo degli ascidi erano presenti residui di insetti precedentemente digeriti.
•Concentrazione in vivo: l’evaporazione del liquido degli ascidi può averne causato l’aumento.
MODIFICHE APPORTATE AGLI ESPERIMENTI SUCCESSIVI:
•Usare una maggiore concentrazione di albumina.
•Misurare i volumi dei campioni per valutarne le possibili variazioni.
•Bloccare l’enzima con una soluzione tampone invece che con la soluzione di idrossido di sodio.
•Utilizzare anche un ascidio appena aperto dove non sono ancora stati digeriti insetti.
•Per le analisi in vitro preparare un campione unico dove mettere la BSA e da cui fare tutti i prelievi.
•Prolungare le osservazioni a 7 giorni sia in vitro che in vivo.
ESPERIMENTO 2 IN VITRO
Procedimento:
Analogo all’esperimento precedente con le variazioni elencate nell’esperimento 1:
Abbiamo:
• Preparato due campioni con liquido di ascidi diversi da cui fare i prelievi M e P e
filtrato il campione M.
• Utilizzato la soluzione tampone TRIS HCl (pH 7.5) per bloccare l’attività enzimatica.
Osservazioni:
• Poco liquido digestivo negli ascidi.
• Perdita di liquido nei campioni (probabile evaporazione).
• I risultati migliori sono quelli filtrati perché il liquido risulta essere meno torbido.
ESPERIMENTO 2 IN VIVO
Abbiamo deciso di utilizzare un ascidio nuovo,
appena aperto, per verificare la presenza degli
enzimi.
Procedimento:
Abbiamo:
• Inserito 180 µg di BSA nel ascidio.
• Misurato il volume del liquido e segnato il
livello sulla superficie dell’ascidio.
• Prelevato 2 campioni, dopo 0, 24, 48, 72
ore , e aggiunto, in uno dei due, il
tampone Tris HCl e conservati a
temperatura di -18°C;
• Effettuato l’analisi spettrofotometrica.
Problemi:
• Rimisurando il volume ci siamo accorti di
una notevole perdita di liquido nell’ascidio.
• Prima di eseguire l’analisi abbiamo diluito i
campioni
con
acqua
aggiungendo
un’adeguata
quantità
di
soluzione
tampone.
CONCLUSIONI
Cosa abbiamo imparato:
Lo studio degli organismi è molto complesso, la verifica delle ipotesi viene ostacolata
da molti fattori disturbanti difficili da eliminare ed è per questo che è necessario fare
delle semplificazioni.
Lavorare in vitro invece che in vivo permette di ridurre i “disturbi”.
L’enzima nel liquido delle Nepenthes agisce a pH acido e risente della temperatura.
Come avviene la digestione delle proteine e la loro scomposizione in amminoacidi.
A utilizzare il pH e la sua scala logaritmica.
A usare strumenti di laboratorio come
spettrofotometro, microscopio…
A cercare collaborazione con persone fuori
dall’ambiente scolastico.
Limiti del lavoro e possibili miglioramenti:
Avremmo potuto:
Utilizzare una maggiore quantità di albumina visto che il margine di errore, come si
può vedere dai grafici, è minore nella parte centrale.
Utilizzare più piante della stessa specie per poter fare dei confronti.
Utilizzare un antibiotico per verificare che non ci siano dei batteri simbionti che
favoriscono la digestione operata dalla pianta.
Fare l’esperimento in un periodo dell’anno diverso da quello invernale, in quanto la
temperatura del periodo non era ideale per questo tipo di pianta tropicale.
Senza la curiosità e l’interesse di
scoprire cose nuove, di spiegare il
perché di quello che ci accade attorno
e la voglia di fare una cosa
nonostante la fatica e i continui
ostacoli, non ci sarebbe l’innovazione.
A volte sono proprio queste piccole
cose e le esperienze che fanno nascere
la passione e fanno avere dei risultati
straordinari!
