Cinetica enzimatica

Chimica Biologica
A.A. 2010-2011
Cinetica Enzimatica
Marco Nardini
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Università di Milano
Macromolecole Biologiche
Cinetica Chimica
Termodinamica:
fornisce informazioni sulla spontaneità e sulle condizioni di equilibrio
di una reazione (che dipendono dalle caratteristiche di reagenti e prodotti)
Cinetica chimica:
fornisce informazioni sulla velocità con cui una reazione avviene (questa
dipende dalle modalità con cui una reazione avviene, ovvero dal
meccanismo di reazione)
Cinetica Chimica
Macromolecole Biologiche
Cinetica chimica
reazione con stechiometria totale: A → P
A reagenti
P prodotti
A → I1 → I2 → P I intermedi di reazione
- una qualsiasi reazione, per quanto complessa, può essere scomposta in una
serie di reazioni elementari
- l’insieme di questi passaggi rappresenta il meccanismo di quella reazione
- per una reazione elementare la velocità dipende in maniera semplice dalla
concentrazione dei reagenti (legge di velocità):
aA + bB + … zZ → P
v = k[A]a[B]b… [Z]z
Cinetica Chimica
Macromolecole Biologiche
Cinetica chimica
aA + bB + … zZ → P
v = k[A]a[B]b… [Z]z
v: velocità istantanea di comparsa del prodotto e scomparsa del reagente
k: costante di velocità
- Ordine di una reazione : grado algebrico della legge di velocità
- Molecolarità: numero di molecole che devono collidere per dar luogo alla
reazione
- per una reazione elementare l’ordine corrisponde con la molecolarità
Cinetica Chimica
Cinetica chimica
- reazione del primo ordine:
A→P
velocità della reazione v = d[P]/dt = -d[A]/dt = k[A]
- v (Ms-1) ⇒ k = costante di velocità (primo ordine) (s-1)
T = cost
Cinetica Chimica
Cinetica chimica
- reazione del secondo ordine:
2A → P
velocità della reazione v = d[P]/dt = -d[A]/dt = k[A]2
T = cost
- v (Ms-1) ⇒ k = costante di velocità (secondo ordine) (M-1s-1)
- reazione del secondo ordine:
A+B→P
v = d[P]/dt = -d[A]/dt = -d[B]/dt = k[A][B]
T = cost
- reazione del secondo ordine totale, del primo ordine per [A] e per [B]
- le reazioni trimolecolari sono rare
Cinetica Chimica
Cinetica chimica
Equazione di velocità
- descrive il progredire di una reazione nel tempo
- reazione del primo ordine:
v = -d[A]/dt = k[A]
[A]
d[A]/[A] = - k dt
⇒
⇒ d ln[A] = -k dt
ln[A] - ln[A0] = -kt eq. lineare
⇒
⇒
t
∫ d ln[A] = -k ∫ dt
[A0]
0
[A] = [A0] exp (-kt)
Cinetica Chimica
Cinetica chimica
- reazione del secondo ordine:
v = -d[A]/dt = k[A]2
[A]
-d[A]/[A]2 = k dt
⇒
⇒
1/[A] = 1/[A0] + kt
t
∫ - d [A]/[A]2 = k ∫ dt
[A0]
0
equazione lineare
- costruendo i grafici di ln [A] e di 1/[A] in funzione di t si distinguono le reazioni
del primo e secondo ordine (quale delle 2 è lineare) e si determina la costante
di velocità
- reazione del secondo ordine: A + B → P
se [B]>>[A] ⇒ pseudo-reazione del primo ordine rispetto ad A
([B] cost. durante la reazione)
analogamente per B
Cinetica Chimica
Cinetica chimica
t1/2 (emivita o tempo di dimezzamento)
tempo necessario affinché metà del reagente si sia trasformato in prodotto
- reazione del primo ordine:
t1/2 costante, indipendente da [A0]
ln[A] - ln[A0] = -kt ⇒ ln (1/2) = -k t1/2 ⇒ t1/2 = (ln 2)/k = 0.693/k
- le sostanze instabili (nuclei radioattivi) si decompongono con reazioni del
primo ordine
- reazione del secondo ordine:
t1/2 dipende da [A0]
1/[A] = 1/[A0] + kt ⇒ t1/2 = 1/k [A0]
Cinetica Enzimatica
Cinetica enzimatica
Reazione catalizzata da enzimi:
(reazioni ad 1 substrato)
curva di saturazione del substrato
- [S] bassa ⇒ v proporzionale ad [S]
- [S] aumenta ⇒ v non aumenta proporzionalmente ad [S]
- [S] alta ⇒ v indipendente da [S] ⇒ effetto di saturazione
ogni molecola di enzima ha il sito di legame del substrato occupato da S
reazione del primo ordine non catalizzata
Cinetica Enzimatica
quindi quando [S] è elevata la v diventa inipendente da [S], cioè è di ordine
zero rispetto al substrato
⇒ la reazione può essere pensata divisa in 2 reazioni elementari:
E+S
k1
k-1
ES
k2
k-2
E+P
ki = costanti di velocità per le reazioni
Assunzione 1)
- l’enzima E ed il substrato S si associano reversibilmente a formare il
complesso enzima-substrato ES (“complesso di Michaelis”)
- il prodotto P si forma in un secondo momento, quando ES si rompe a dare E + P
- se [S] è elevata, tutto l’enzima è nella forma ES la seconda tappa limita la
velocità di reazione, che sarà insensibile ad aumenti di [S]
Cinetica Enzimatica
E+S
k1
k-1
ES
k2
E+P
Assunzione 2): la seconda reazione sia irreversibile
⇒ misure di velocità iniziale v0
- v0 si ha fintanto che <10% del substrato è stato trasformato in prodotto
(cioè prima che P si accumuli, visto che la velocità inversa è prop. a [P])
⇒ si minimizzano gli effetti delle reazioni reversibili (inibizione da parte
del prodotto e progressiva inattivazione)
Cinetica Enzimatica
Teoria di Michaelis-Menten
E+S
k1
k-1
ES
k2
E+P
- Equazione di Michaelis-Menten
velocità di reazione:
v = d[P]/dt = k2 [ES]
velocità di formazione del prodotto
[ES] = conc. intermedio precedente
k2 = costante di velocità
d[ES]/dt = k1 [E][S] – k-1 [ES] – k2 [ES]
Per integrarla occorre fare alcune assunzioni
velocità complessiva di
produzione di ES
Cinetica Enzimatica
Assunzione dello stato stazionario:
se [S]>>[E] (quasi sempre vero in condizioni fisiologiche)
⇒ d[ES]/dt = 0
(la velocità di sintesi e di consumo di ES sono uguali)
dopo pochi ms
Cinetica Enzimatica
E+S
k1
k-1
k2
ES
E+P
(stato stazionario)
d[ES]/dt = k1 [E][S] – k-1 [ES] – k2 [ES] = 0
k1 [E][S] = [ES] (k-1 + k2)
KM = costante di Michaelis
KM =
(k-1 + k2)
=
k1
[E][S]
[ES]
dove [ET] = [E]+[ES]
[ES] =
=
[ET] - [ES] [S]
[ES]
[E]T[S]
KM + [S]
Cinetica Enzimatica
[ES] =
[E]T[S]
KM + [S]
[ET] facilmente misurabile, [E] ed [ES] non direttamente misurabili
v0 = d[P]/dt|t=0= k2 [ES]
VMAX = k2 [E]T
⇒ v0 = k2 [E]T[S]
KM + [S]
velocità massima di una reazione
(quando l’enzima è totalmente nella forma ES ed [S] è elevata)
Eq. di Michaelis-Menten
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
iperbole rettangolare
Cinetica Enzimatica
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
- v0, in qualsiasi istante, è determinata dal rapporto fra 2 costanti (KM e VMAX) e
la concentrazione del substrato [S] in quell’istante
- se [S] = KM ⇒ v0 = VMAX/2 ⇒ definizione operativa di KM
KM è la conc. del substrato per cui la velocità della reazione è metà di quella
massima
Cinetica Enzimatica
dalla curva di saturazione del substrato
si possono ricavare VMAX e KM ma solo
in modo approssimato
⇒ necessarie [S] troppo elevate
(v = 0.99 VMAX se [S] = 99 KM)
[S] >> KM ⇒ v = VMAX (indipendente da [S] ⇒ cinetica di ordine 0)
[S] < KM ⇒ v = k’ [S] con k’ = VMAX/KM ⇒ cinetica del primo ordine)
- KM unico per ciascuna coppia enzima-substrato
- KM diverso per diversi substrati che reagiscono con lo stesso enzima
- KM dipende da T e pH
Cinetica Enzimatica
E+S
KM =
KS =
k1
k-1
ES
k2
E+P
k
(k-1 + k2)
k
k
= -1 + 2 = KS + 2
k1
k1 k1
k1
k-1
costante di dissociazione del complesso di Michaelis ES
k1
Se KS diminuisce ⇒ aumenta la affinità dell’enzima per il substrato
Se
KS >>
k2
cioè k2 < k-1 ⇒ KM è anche una misura di affinità
k1
dell’enzima per il suo substrato
(assunzione dell’equilibrio, perché la reazione ES→P più lenta di ES →E+S,
cioè prima che la reazione ES→P proceda si è creato un equilibrio fra [ES] e
[E][S])
Cinetica Enzimatica
Riassumendo:
KM e Vmax, una volta noti, definiscono la velocità della reazione enzimatica
ammesso che:
1) la reazione coinvolga un solo substrato (in casi multisubstrato varia solo la
conc. di un substrato e gli altri sono tenuti costanti)
2) la reazione ES→E+P è irreversibile (o esperimento limitato a quando [P]=0)
3) vale l’assunzione dello stato stazionario. Vero se [S0]>[ET] ed [ET] costante
4) T, pH, forza ionica ecc che possono influenzare la velocità di reazione sono
mantenute costanti
- l’analisi cinetica dello stato stazionario non è in grado di stabilire in modo
certo il meccanismo di reazione.
- in particolare non è in grado di definire natura e numero di intermedi, che
devono essere determinati in altro modo (es: tecniche spettrofotometriche)
Cinetica Enzimatica
Numero di turnover ed efficienza catalitica
Si definisce la costante catalitica
kcat =
VMAX
[E]T
numero di turnover
- numero di molecole di substrato convertite in prodotto (numero di
processi di reazione) per molecola di enzima per unità di tempo quando
l’enzima è saturato con il substrato
- kcat ha le dimensioni del reciproco di un tempo (s-1)
ES
Ciclo catalitico dell’enzima
S
E
P
Cinetica Enzimatica
Numero di turnover ed efficienza catalitica
numero di turnover
kcat =
VMAX
[E]T
- misura della massima attività catalitica
- nel modello di reazione di Michaelis-Menten kcat = k2
essendo VMAX = k2 [E]T
- per [S] saturanti, nota VMAX ed ammesso sia nota la [ET] nella miscela di
reazione si può calcolare kcat , che è una costante, mentre VMAX dipende
dalla concentrazione dell’enzima (cresce al crescere di [ET])
Cinetica Enzimatica
Numero di turnover ed efficienza catalitica
- in condizioni fisiologiche [S] è raramente saturante
(in vivo [S]/KM ~ 0.01-1.0 ⇒ i siti attivi spesso non sono saturati dal substrato)
- si usa il rapporto kcat/KM come indice dell’efficienza catalitica per enzimi
che rispettano la cinetica di Michaelis-Menten ed operano al di sotto della
saturazione
- se [S]<<KM si formerà poco complesso ES ⇒ [E] ~ [E]T
v0 ~ k2 [E]T[S]
KM + [S]
v0 ~
kcat
[E] [S]
KM
kcat/KM costante di velocità del secondo ordine apparente per la reazione di E ed
S a formare il prodotto
⇒ la velocità della reazione varia direttamente in base a quanto spesso l’enzima
incontra il substrato
Cinetica Enzimatica
Numero di turnover ed efficienza catalitica
E+S
KM = (k-1 + k2)
k1
k1
k-1
⇒
ES
k2
E+P
kcat
k1 k2
=
≤ k1
KM (k-1 + k2)
- la decomposizione di ES in E + P non può avvenire più frequentemente di
quanto E ed S si incontrino per formare ES
⇒ l’efficienza catalitica di un enzima non può essere superiore alla velocità
(controllata dalla diffusione) con cui E ed S si combinano a dare ES
- gli enzimi più efficienti hanno kcat/KM intorno a 108 M-1s-1
(catalizzano una reazione quasi ogni volta che l’enzima incontra il substrato
⇒ “Perfezione catalitica”)
Cinetica Enzimatica
Analisi dei dati Cinetici
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
dalla curva di saturazione si ha solo una stima approssimata di VMAX e KM a
causa dell’andamento asintottico della curva (v0 = 0.91 VMAX se [S] = 10 KM)
⇒ sottostima di VMAX
Cinetica Enzimatica
Grafico dei “doppi reciproci“ (Lineweaver-Burk)
v0 =
VMAX [S]
KM + [S]
1
KM 1
1
=
+
v0
VMAX [S] VMAX
- migliori misurazioni ottenute fra 0.5 KM < [S] < 5 KM
- importante rappresentazione visiva dati cinetici
Es: non-linearità se cinetica ≠ Michaelis-Menten (enzimi allosterici)
- problemi:
per [S] piccoli, piccoli errori in vo risultano in grossi errori in 1/vo
punti sper. concentrati (affollamento per [S] grandi)
Cinetica Enzimatica
Reazioni a 2 substrati
- di solito gli enzimi catalizzano reazioni in cui sono coinvolti 2 o più substrati
e portano alla formazione di prodotti multipli
- reazioni a 2 substrati (e 2 prodotti):
(~60% delle reazioni enzimatiche conosciute)
la maggior parte:
- reazioni di trasferimento di un gruppo funzionale
- reazioni di ossido-riduzione
(trasferimento equivalenti riducenti tra i 2 substrati)
E
A+B
P+Q
E
P-X + B
P + B-X
- 2 possibili reazioni:
(a) Reazioni sequenziali (o “a sostituzione singola”)
(b) Reazioni a ping-pong (o “a doppia sostituzione”)
- Reazioni multisubstrato: si scompone la reazione in una serie di stadi
ciascuno dei quali obbedisce a meccanismi a singola o doppia sostituzione
Cinetica Enzimatica
Reazioni sequenziali
- tutti i substrati si devono combinare con l’enzima prima che possa avvenire
la reazione e che vengano rilasciati i prodotti
E+A+B
AEB
PEQ
E+P+Q
- “sostituzione singola” perché il gruppo X verrebbe trasferito direttamente
da A (P-X) a B formando P e Q (B-X)
- 2 possibili meccanismi:
(a) Meccanismo ordinato
(b) Meccanismo casuale
Cinetica Enzimatica
Reazioni sequenziali
(a) Meccanismo ordinato
nomenclatura di “Cleland”
↓ addizione
↑ rilascio
─ enzima
- ordine obbligato di addizione dei substrati all’enzima (esiste un “substrato
primario” il cui legame può favorire il legame per il secondo substrato)
Esempio: molte deidrogenasi NAD+ o NADP+ dipendenti usano il coenzima
come substrato primario
Cinetica Enzimatica
Reazioni sequenziali
(b) Meccanismo casuale
- entrambi i siti di legame per i substrati sono presenti nell’enzima libero
e non c’e’ un substrato primario che si deve legare prima
Esempio: molte chinasi operano con un meccanismo a 2 substrati casuale
(un substrato è l’ATP)
Cinetica Enzimatica
Reazioni a ping-pong
- il substrato A reagisce con l’enzima dando il prodotto P ed una forma
modificata F dell’enzima E
- il substrato B interagisce con F dando il prodotto Q rigenerando E
E+A
AE
FP
F
P
FB
E+Q
B
A e B non si incontrano
mai sull’enzima
- “doppia sostituzione” perché il gruppo X verrebbe trasferito da A (P-X)
prima ad E (F = E-X) e poi a B formando Q (B-X)
Esempio: la tripsina usa un meccanismo a ping-pong con F = acil-enzima