LOCALIZZAZIONE in situ DI PROTEINE IN CELLULE E TESSUTI 1. CITOCHIMICA ENZIMATICA CITOCHIMICA ENZIMATICA CITOCHIMICA ENZIMATICA Queste reazioni prevedono l’incubazione di cellule o tessuti in una soluzione contenente: 1. il substrato specifico per il sistema enzimatico oggetto di studio; 2. un tampone in grado di mantenere il pH ottimale per il sistema enzimatico; 3. qualsiasi cofattore necessario all’enzima; 4. una molecola in grado di rendere il complesso enzima-substrato insolubile e colorato (“catturante o cromogeno”) in modo che sia visibile, al microscopio, nella sede specifica in cui si trova in natura. PR X S X I E E E CELLULA + CROMOGENO X CONTROLLI E 1. omissione 2. inibitore E PRODOTTO DI REAZIONE - COLORATO (=visibile) - INSOLUBILE - “in situ” Istochimica enzimatica per localizzare l’ enzima Fosfatasi alcalina (FA) Sono fosfomonoesterasi che catalizzano l’idrolisi di esteri dell’acido ortofosforico con attività ottimale a pH basico FA O R-O-P-O-H OH + HOH O R.OH + HO-P-O-H OH Si trovano in membrane cellulari implicate in processi attivi di trasporto Nell’intestino tenue la Fosfatasi alcalina è nella membrana apicale delle cellule epiteliali, a livello dei microvilli REAGENTI reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINA Campioni = sezioni in paraffina SOLUZIONE TAMPONE = Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4 MEZZO DI INCUBAZIONE A Naftil fosfato di sodio = substrato Fast Blue B = catturante B Naftolo AS MX fosfato = substrato Fast Red = catturante N-N dimetilformamide = solvente del naftolo MEZZO DI MONTAGGIO = PBS/Glicerolo 1:3 PREPARATO NON PERMANENTE Protocollo reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINA 1 Delimitare sezioni con matita vetrografica 2 Sparaffinare le sezioni e portarle all’acqua distillata con la scala discendente degli alcoli 3 Lavaggio in tampone Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4 per 5 minuti 4 5 Incubazione nel mezzo di incubazione A o B, preparato immediatamente prima dell’uso, per 3-15 minuti al buio e a temperatura ambiente, in camera umida Lavaggio in acqua distillata e montaggio delle sezioni in PBS/glicerolo 1:3 MEZZO DI INCUBAZIONE A (-> PRODOTTO DI REAZIONE NERO) • Naftil fosfato di sodio: 1mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4 • Fast Blue B : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4 MEZZO DI INCUBAZIONE B (-> PRODOTTO DI REAZIONE ROSSO e fluorescente) • Naftolo AS MX fosfato: 0,5 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4 • Fast Red : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4 • N-N dimetilformamide 0,05 ml CONTROLLI Sono possibili due tipi di controlli: 1. omettere il substrato nel mezzo di incubazione (es. incubazione in solo Fast Blue B) 2. inibire preventivamente l’attività enzimatica mediante preincubazione della sezione di controllo in un INIBITORE SPECIFICO (L-fenilalanina 0,05M in tampone Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4 per 10 minuti) RISULTATI ATTESI Cromogeno = FAST BLU RISULTATI ATTESI Cromogeno = FAST RED APPLICAZIONI DELLA CITOCHIMICA ENZIMATICA BIOPSIA MUSCOLARE Muscolo ago GHIANDOLA MAMMARIA PROSTATA ENDOMETRIO COLON TONSILLA LINFONODO