Diapositiva 1 - Amedeo Amedei

DNA
-Come è stato scoperto
-Quali sono le sue funzioni
Il DNA è il
materiale ereditario e non le proteine
Esperimento di
Griffith 1928
Streptococcus pneumoniae
S(smooth) capsulato virulento
R(rough) acapsulato non-virulento
•Il ceppo S, detto anche liscio dal momento che produce colonie lisce e lucenti (grazie alla presenza di una capsula batterica polisaccaridica che
avvolgeva ogni cellula). Questo ceppo è in grado di provocare la polmonite.
•Il ceppo R, detto anche rugoso dal momento che produce colonie dall'aspetto "rugoso" (a causa dell'assenza della capsula batterica). Questo
ceppo non è in grado di provocare polmonite.
Utilizzando il calore sterilizzò la soluzione contenente lo
pneumococco letale (S) con capsula, mescolò la soluzione così
ottenuta con quella contenente lo pneumococco privo di capsula
(R) non letale.
Esaminando successivamente le colonie ottenute da batteri della
soluzione finale, verificò la presenza del solo ceppo capsulato
letale.
L’informazione genetica era passata da un ceppo all’altro
(trasformazione ) gli R ricostruivano la capsula
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Secondo esperimento
Per il secondo esperimento Griffith utilizzo sempre i due
ceppi di Streptococcus pneumoniae : il ceppo (R) privo di
capsula e non letale ed il ceppo (S) capsulato e letale;
come cavia nella quale iniettare i batteri utilizzo il topo.
Esegui quattro distinte inoculazioni:
Prima inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo
privo di capsula (R) il topo vive
Seconda inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo
capsulato (S) il topo muore
Terza inoculazione - iniettando nel topo il ceppo morto
capsulato (S) il topo vive
Quarta inoculazione - iniettando nel topo il ceppo vivo
privo di capsula (R) insieme al ceppo morto capsulato
(S) il topo muore, inoltre esaminando il tipo di batteri
presenti nel topo morto Griffith riscontrò il ceppo letale (S).
Questo esperimento dimostrò che i batteri sono in grado di
trasferire informazioni genetiche attraverso un processo
noto come trasformazione
PRINCIPIO TRASFORMANTE
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IDENTIFICAZIONE DEL PRINCIPIO TRASFORMANTE
O.T. Avery 1944
Ripetè l’esperimento di Griffith
Batteri patogeni S con capsula uccisi dal calore +
-DNasi
-RNasi
-Proteasi
Il topo non moriva quando veniva iniettato con
batteri R mescolati a batteri S precedentemente trattati
con DNasi
Critiche da parte della comunità scientifica (Proteine / Dna)3
Esperimento di
Avery
Avery si procurò una coltura di
pneumococchi di tipo S.
A questo punto lisò le cellule (cioè ne
ruppe la parete e la membrana
cellulare) in modo da ottenere una
soluzione nella quale era disciolto il
materiale contenuto nei batteri, il
cosiddetto estratto cellulare o lisato
cellulare.
Per capire quale delle due sostanze fosse ( se DNA o RNA) coinvolta ne trasferimento di materiale
genetico, divise l'estratto in due aliquote:
-una venne trattata con l'enzima ribonucleasi (RNasi) che degrada selettivamente l'RNA e non il DNA,
-l'altra venne invece trattata con desossiribonucleasi (DNasi) che degrada selettivamente il DNA e non
l'RNA.
Ciò che si osservò era la trasformazione dei batteri R in batteri S solo in seguito all'aggiunta dell'aliquota
trattata con RNasi. Il materiale genetico doveva allora essere necessariamente il DNA.
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Premesse per esperimento di
Hershey-Chase
1952
Quando una cellula
batterica
Viene infettata da un
virus……
……Solo il DNA del
virus entra
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Esperimento di
Hershey-Chase
1952
Il processo utilizzato per determinare se la radioattività provenisse
dall'interno o dall'esterno delle cellule fu il seguente:
-dopo un certo tempo dall'inizio dell'infezione, il terreno di coltura veniva
posto in un omogenizzatore. La conseguente agitazione provocava il
distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare (in
questo caso si parla di "ombre fagiche" poiché questi rivestimenti proteici
non contengono il DNA che è già stato iniettato nella cellula).
Il tutto veniva poi centrifugato: la parte cellulare (contenente
eventualmente il DNA marcato) rimaneva sul fondo della provetta, mentre
i rivestimenti proteici distaccati dalle membrane cellulari rimanevano in
sospensione.
A seconda di dove si misurava la maggiore radioattività era possibile
dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all'interno della
cellula.
IL DNA è
IL MATERIALE EREDITARIO
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Dogma centrale della BIOLOGIA
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Acidi nucleici
• DNA(acido desossiribonucleico),
RNA (acido ribonucleico)
• Catene polinucleotidiche
• Unità base NUCLEOTIDE:
BASE AZOTATA+ZUCCHERO (ribosio nel caso dell’RNA,
desossiribosio nel caso del DNA) +FOSFATO
NUCLEOSIDE
BASE AZOTATA+ZUCCHERO
Denaturazione ( rottura legami H)e rinaturazione
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DNA = lungo polimero costituito da unità ripetute di nucleotidi.
Ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad
esempio, il più grande cromosoma umano (il cromosoma 1)
contiene quasi 250 milioni di paia di basi.
Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto
forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti
saldamente intrecciati tra loro, a formare una struttura definita
doppia elica.
Ogni nucleotide è costituito da uno scheletro laterale, che ne
permette il legame covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una
base azotata, che instaura legami idrogeno con la
corrispondente base azotata presente sul filamento opposto.
La struttura laterale del DNA è composta da unità ripetute ed
alternate di gruppi fosfato e di 2-deossiribosio, uno zucchero
pentoso (a cinque atomi di carbonio) che si lega ai fosfati
adiacenti attraverso legami fosfodiesterici presso il terzo ed il
quinto carbonio. Conseguenza di questi legami asimmetrici è che
ogni filamento di DNA ha un senso, determinato dalla direzione
dei legami fosfodiesterici. In una doppia elica, il senso di un
filamento è opposto a quello del filamento complementare. Per
tale motivo, i due filamenti che costituiscono una doppia elica
sono detti antiparalleli. Le estremità asimmetriche di un
filamento di DNA sono definite estremità 5′ (cinque primo) ed
estremità 3′ (tre primo).
La principale differenza tra il DNA e l'RNA è lo zucchero pentoso
utilizzato: l'RNA, infatti, utilizza il ribosio.
La doppia elica del DNA è stabilizzata dai legami idrogeno che si
instaurano tra le basi azotate presenti sui due filamenti.
Figura 16.5
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Campbell-Reece, Biologia © 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A
La struttura a doppia elica del DNA consente
di portare l’informazione e di autoreplicarsi:
I nucleotidi si legano con legame
fosfodiestereo in direzione 3’OH
5’ P
Estremità 3’ OH libera
Estremità 5’ fosfato
Watson e Crick (1953) ipotizzarono che la
molecola di DNA fosse costituita da 2 catene
polinucleotidiche antiparallele tenute insieme da
legami ad idrogeno tra le basi
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Figura 16.7
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Campbell-Reece, Biologia © 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A
Dati cristollografici
R. Franklin (Londra, 25 luglio 1920 – Londra, 16 aprile 1958 ) e M. Wilkins
Scoperta: due diverse strutture del DNA. Quando è
bagnato il DNA assume una struttura lunga e sottile (A);
quando è asciutto invece diventa corto e grosso (B).
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1950 Chargaff
Tutte e quattro le basi hanno struttura eterociclica
-ma adenina e guanina sono, dal punto di vista strutturale, derivate della purina, e pertanto
dette basi puriniche,
-mentre citosina e timina sono correlate alla pirimidina e dette basi pirimidiniche.
Esiste una quinta base, di tipo pirimidinico, chiamata uracile (U), ma essa non è di norma
presente nelle catene di DNA. L'uracile è altresì presente nei filamenti di RNA al posto14della
timina
Figura 16.8
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Campbell-Reece, Biologia © 2009 Pearson Paravia Bruno Mondadori S.p.A
DNA B Watson e Crick 1953
Elica a doppio filamento
Diametro uniforme 2 nm
Complementarietà fra le basi
Elica destrorsa
Filamenti antiparalleli
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LEGAME FOSFODIESTEREO
FRA DUE NUCLEOTIDI
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Premesse per
replicazione
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Ipotesi per replicazione DNA
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Meselson e
Stahl
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Per iniziare la replicazione,
occorre anzitutto
-l'apertura della forca replicativa,
attraverso
la
parziale
denaturazione del DNA a doppia
elica, grazie a elicasi e dalle
single-strand-binding proteins
(SSBPs):
: le elicasi sono enzimi che
separano attivamente i due
filamenti usando l'energia dell'ATP;
le SSBPs sono in grado di
mantenere la denaturazione del
DNA legandosi esclusivamente
alle porzioni a singolo filamento e
stabilizzandole.
Nelle molecole di DNA circolari dei
procarioti si ha una sola regione di
origine della replicazione dalla
quale
partono
due
forche
replicative (la struttura prende il
nome di bolla di replicazione).
Quando le due forche
si
incontrano dal lato opposto la
replicazione è completata.
Negli eucarioti la replicazione di
ogni cromosoma inizia invece in
più punti
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DNA batterico
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DNA eucariotico
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Le eliche del DNA devono essere tenute separate
durante la replicazione
DNA elicasi,
topoisomerasi e proteine destabilizzatrici dell’elica
La sintesi procede in direzione 5’ 3’ la DNA polimerasi
forma legami fosfodiesterei tra il
3’ OH della catena in allungamento ed il 5’P di un nuovo
nucleotide
La sintesi necessita di un iniziatore di RNA
Primasi
La DNA polimerasi non è in grado di iniziare la sintesi di un filamento ex novo, mentre può allungare un filamento
polinucleotidico preesistente. In una cellula in replicazione, dunque, è indispensabile la presenza di un filamento preesistente
(detto primer), che consiste solitamente in un breve segmento di RNA complementare allo stampo, sintetizzato da enzimi
specifici detti primasi.
La sintesi avviene in modo
Continuo
Discontinuo
frammenti di Okazaki
Deossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
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Ligasi
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Dalla Bolla di replicazione…..
Dal momento che le DNA polimerasi sono in grado di svolgere la loro attività solo in direzione 5'-3',
esse hanno messo a punto diversi meccanismi per copiare i due filamenti della doppia elica.
Un filamento (chiamato filamento guida) può essere replicato in modo quasi continuo, man mano
che viene esposto,
-l'altro (filamento lento) risulta invece disseminato da brevi filamenti di DNA di nuova sintesi (i
frammenti di Okazaki), ognuno dei quali presenta un innesco iniziale di RNA.
I nuovi filamenti devono essere quindi completati mediante la rimozione degli inneschi da parte di
endonucleasi e il riempimento degli spazi rimasti ad opera di polimerasi di riparazione.
Successivamente tutti questi frammenti di DNA di nuova sintesi del filamento lento vengono legati
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dalle DNA ligasi.
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4
1
5
2
3
In realtà quasi tutti i passaggi sono svolti da un unico ed enorme complesso proteico di più
di 1.000 kDa che si associa al DNA e lo fa scorrere sintetizzandolo, esso comprende le
elicasi, le polimerasi e così via.
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DNA polimerasi II: correttore delle bozze
Altrimenti: mutazioni puntiformi
alleli
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Dogma della Biologia
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