30/04/15 L’ATP è sintetizzato in tre principali modi: mediante fosforilazione a livello del substrato, mediante fosforilazione ossidativa, mediante fotofosforilazione 1 30/04/15 Prima via metabolica ad essere compresa. Universalmente diffusa in tutte le cellule. Avviene nel citosol di tutte la cellule Una molecola di glucosio viene degradata in una serie di reazioni catalizzate da enzimi per produrre due molecole di piruvato Importante ruolo metabolico centrale La glicolisi avviene in 10 tappe Fase preparatoria di investimento energetico - 2 ATP Fase di recupero energetico + 4 ATP + 2 equivalenti di riduzione NADH Negli organismi aerobici la glicolisi è il primo passaggio per la combustione completa del glucosio a CO2 e H2O Negli organismi anaerobici è l’unica via per la produzione di ATP La conversione del glucosio a piruvato nelle cellule in grado di respirare è detta glicolisi aerobica 2 30/04/15 L’ATP è sintetizzato in tre principali modi: mediante fosforilazione fosforilazioneaalivello del substrato, livello del substrato, fosforilazione ossidativa, fotofosforilazione 3 30/04/15 Investimento energetico per aumentare l’energia libera degli intermedi della via metabolica. Gli zuccheri fosforilati non sono più capaci di attraversare la membrana cellulare Le catene metaboliche di tutti gli esosi sono convertite in due molecole di gliceraldeide-3fosfato La resa netta della glicolisi sono 2 molecole di ATP per molecola di glucosio. Altra energia è conservata n e l l a formazione di 2 molecole di NADH 4 30/04/15 Nelle cellule eucariotiche la glicolisi avviene nel CITOSOL, mentre la successiva ossidazione del piruvato avviene nei mitocondri. In alcuni tripanosomi avviene in un organulo citoplasmatico detto glicosoma 5 30/04/15 1° Esochinasi fosforila il glucosio intrappolandolo nella cellula infatti il glucosio 6-fosfato non può uscire dalla cellula. ISOENZIMA Negli epatociti : glucochinasi che differisce dall’esochinasi per diverse proprietà cinetiche e regolatorie QUESTE FORME ISOENZIMATICHE Consentono al cervello e al muscolo di usare per primi il glucosio quando la concentrazione nel sangue è bassa L’esochinasi nei diversi organismi è generalmente caratterizzata da: 1. bassa specificità per gli zuccheri 2. bassa Km (0,1 mM) 3. Inibizione retroattiva da parte del suo prodotto, glucosio-6-fosfato. Concentrazione di glucosio nel sangue = 5mM La glucochinasi nel fegato è invece caratterizzata da : 1.Specificità per il glucosio 2. Più alta Km (10 mM) 3. Non presenta inibizione retroattiva da prodotto Regolazione al livello del substrato. 6 30/04/15 Effetto della concentrazione del glucosio del sangue sulla velocità di fosforilazione catalizzata dalla glucochinasi (nel fegato, rimuove glucosio dal sangue dopo i pasti) e dalla esochinasi (nei tessuti diversi dal fegato è in saturazione di substrato e funziona a ritmo costante per fornire glucosio 6fosfato alle cellule) 1 7 30/04/15 Prima reazione dove si ha conservazione di energia 8 30/04/15 La formazione di ATP mediante il trasferimento di gruppi fosforici da un substrato come 1,3-bisfosfoglicerato viene detta FOSFORILAZIONE AL LIVELLO DEL SUBSTRATO per distinguerla dalla fosforilazione legata alla respirazione. Seconda fosforilazione al livello del substrato Glucosio + 2ATP + 2NAD+ + 4ADP + 2 Pi 2 piruvato +2ADP + 2NADH + 2H+ + 4ATP + 2H2O Cancellando i termini comuni Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 2 piruvato + 2NADH + 2H+ + 2ATP + 2H2O Devono venire riossidate 9 30/04/15 Affinché la via glicolitica possa operare, il NADH deve essere riossidato a NAD+ mediante il trasferimento dei suoi elettroni ad un accettore in modo da mantenere uno stato stazionario: all’ossigeno (fosforilazione ossidativa) O ad un’altra molecola ossidante Fermentazione lattica Fermentazione alcolica 10 30/04/15 Lo scopo della riduzione del piruvato a lattato od ad etanolo è quello di rigenerare NAD+ in modo che la glicolisi possa procedere regolarmente NADH piruvato Fegato rapporto NADH/NAD+ lattato BASSO NAD+ + H+ ISOENZIMI della LATTATO DEIDROGENASI MEMBRANA CELLULARE permeabile Muscolo : rapporto NADH/NAD+ ALTO Diverse forme ISOZIMATICHE. La lattato deidrogenasi (LDH) è una proteina tetramerica costituito da due diverse subunità: M ed H M4, HM3, H2M2, H3M, H4 FORME DIVERSE PER DIVERSE FUNZIONI TESSUTALI Piruvato decarbossilasi ALCOOL DEIDROGENASI Anche i tessuti animali contengono alcol deidrogenasi. Alcune delle principali conseguenze metaboliche dell’intossicazione da alcool derivano dall’ossidazione dell’alcool, nel fegato,da parte di questo enzima. Per prima cosa si ha una massiccia riduzione di NAD+ a NADH, che riduce il flusso della glicolisi; inoltre l’acetaldeide è piuttosto tossica e molti degli effetti spiacevoli dei postumi dell’ubriacatura dipendono dall’azione dell’acetaldeide e dei suoi metaboliti 11 30/04/15 La rigenerazione del NAD+ che si verifica nella riduzione del piruvato a lattato o etanolo sostiene la continuità del processo glicolitico in condizioni anaerobiche La fermentazione lattica negli organismi superiori avviene quando la quantità di ossigeno è limitata rispetto alla richiesta di energia della cellula Nei vertebrati durante una breve ma intensa attività muscolare muscolo lattato glucosio fegato L’eccesso di ossigeno consumato durante il periodo di riposo rappresenta il DEBITO DI OSSIGENO, quantità di ossigeno necessaria a fornire ATP per la gluconeogenesi ( rigenerazione di glucosio da parte degli epatociti) 12 30/04/15 1) Nella maggior parte dei tessuti degli animali è convertito ad acetil-CoA per essere demolito a CO2 nel ciclo dell’acido citrico 2) Certi tessuti e tipi di cellule , retina ed eritrociti,convertono il glucosio in lattato anche in condizioni aerobiche 3) In alcuni tessuti di piante in alcuni invertebrati, protisti, microrganismi come il lievito di birra. 4) Il piruvato può avere destini anche anabolici 13 30/04/15 Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 2 piruvato + 2NADH + 2H+ + 2ATP + 2H2O Conversione esoergonica del glucosio in piruvato Glucosio + 2NAD+ 2 piruvato + 2NADH + 2H+ ΔG1’o= - 146 KJ/mole Formazione endoergonica di ATP 2ADP + 2Pi 2ATP + 2H2O Processo irreversibile portato a completamento da questa grande diminuzione di energia libera ΔG2’o= 2 (30,5 KJ/mole) = 61 KJ/mole ΔGs’o= - 85 KJ/mole Nella glicolisi viene ricavato solo il 5,2% dell’energia totale del glucosio (2840 KJ/mole) glicolisi strettamente coordinata ad altre importanti vie metaboliche SINTESI DEL GLICOGENO DEGRADAZIONE DEL GLICOGENO VIA DEL PENTOSO FOSFATO GLUCONEOGENESI CICLO DELL’ACIDO CITRICO SINTESI DEGLI ACIDI GRASSI DIFFICILE CONSIDERARE LA GLICOLISI INDIPENDENTE DALLE ALTRE VIE METABOLICHE NELLA GLICOLISI DUE SONO GLI ENZIMI CHE HANNO FUNZIONI REGOLATRICI SUL CATABOLISMO DEL GLUCOSIO La FOSFOFRUTTOCHINASI-1 e la PIRUVATO CHINASI 14 30/04/15 enzima allosterico Enzima allosterico che ha come ATTIVATORI : AMP e ADP nel FEGATO anche il FRUTTOSIO-2,6-BISFOSFATO 1 6 P O—CH2 5 CH2OH O 2 HO 4 O P 3 OH INIBITORI: ATP (si lega ad un sito distinto dell’enzima con affinità inferiore a quella del sito attivo). L’inibizione consiste in una forte inibizione dell’affinità apparente per il Il CITRATO, intermedio chiave per fruttosio-6-fosfato. l’ossidazione aerobica del piruvato. 15 30/04/15 INIBIZIONE DELLA GLICOLISI DA PARTE DEL GLUCOSIO La glicolisi è controllata dall’attività della fosfofruttochinasi. Osservazione fatta 1 secolo fa da Pasteur: Egli vide che quando delle colture anaerobiche di lievito che metabolizzavano glucosio venivano esposte all’aria, la velocità di reazione diminuiva drasticamente. Questo effetto ha un preciso significato metabolico dovuto al fatto che dall’ossidazione completa Il flusso metabolico della fosfofruttochinasi del glucosio si ottiene di gran lunga viene rallentato in modo più energia che dalla sola glicolisi specifico dalla presenza di O2 Il piruvato è punto di biforcazione nel catabolismo degli zuccheri e l’enzima che catalizza la sua produzione è il secondo enzima che regola la glicolisi . Presenta una attivazione a “feedforward”, inverso della retroinibizione, da parte del fruttosio-1,6-bisfosfato. 16 30/04/15 17 30/04/15 Quadro di insieme della regolazione della glicolisi Per essere riossidato nella fosforilazione ossidativa deve entrare nel mitocondrio … ma il NADH non può attraversare la membrana mitocondriale interna ………….. ???????? Sistema navetta Diidrossiaceto ne fosfato/ glicerolo-3fosfato NADH Sistemi navetta per il trasferimento degli equivalenti di riduzione dal citosol ai mitocondri Sistema navetta malato/aspartato 18 30/04/15 SISTEMI NAVETTA (SHUTTLE) OSSIDAZIONE DEL NADH CITOSOLICO Particolarmente attivo nel fegato e nel cuore Particolarmente attivo nel cervello e nei muscoli del volo degli insetti 19 30/04/15 La forza motrice protonica fornisce energia al trasporto attivo FAVORITA DAL GRADIENTE ELETTRONICO TRANS-MEMBRANA FAVORITA DAL GRADIENTE PROTONICO TRANS-MEMBRANA Molti altri carboidrati sono disponibili come fonti di energia Provengono sia dalla digestione di alimenti che da metaboliti endogeni 20 30/04/15 Nell’epatocita Idrolisi del saccarosio nel muscolo e nel rene dei vertebrati NEL FEGATO Esochinasi ha un’affinità 20 volte più alta per il glucosio Scavalca la regolazione a livello della fosfofruttochinasi spiegando la facilità con cui il fruttosio proveniente dalla dieta viene convertito in grasso 21 30/04/15 LA DIGESTIONE DEI GRASSI NEUTRI (triacilgliceroli) e della maggior parte dei fosfolipidi genera GLICEROLO come uno dei prodotti. Il glicerolo entra nella glicolisi 22 30/04/15 Digestione dei polisaccaridi introdotti con la dieta : amido e SCISSIONE glicogeno IDROLISI Mobilizzazione delle riserve di glicogeno proprie dell’animale FOSFOROLISI Il glucosio unica fonte energetica usata dal cervello (ad eccezione dei periodi di digiuno prolungati). Il glicogeno è presente principalmente nel citosol cellulare del fegato e del muscolo scheletrico, sottoforma di granuli che contengono proteine regolatorie ed enzimi che ne catalizzano la sintesi e la degradazione. Scissione fosforolitica dei legami glicosidici α(1-4) catalizzata dalla glicogeno fosforilasi IMPORTANZA DEL GLUCOSIO-1-FOSFATO 1. In questa fosforolisi parte dell’energia del legame glicosidico viene conservata mediante la formazione del legame estere fosforico del glucosio-1-fosfato Estremità non riducente 2. Il glucosio-1-fosfato non può diffondere fuori dalla cellula il glucosio sì 23 30/04/15 Il glicogeno del muscolo rappresenta una sorgente rapidamente disponibile per la cellula. Nel fegato rappresenta una fonte per l’omeostasi di glucosio del sangue nell’intervallo tra i pasti. Dopo 12, 18 ore da un pasto il glicogeno del fegato è quasi completamente consumato. La glicogeno fosforilasi agisce sulle estremità non riducenti delle ramificazioni del glicogeno GLICOGENO Un residuo ogni 10 contiene una ramificazione: legame α(1-6) glicosidico La glicogeno fosforilasi agisce ripetitivamente sulle estremità non riducenti delle ramificazioni del glicogeno fino a 4 residui di glucosio dall’inizio di una ramificazione L’attività transferasica dell’enzima sposta, da prima un blocco di tre residui dalla ramificazione all’estremità non riducente vicina legandola con legame glicosidico (α 1-4), poi taglia l’ultimo residuo rimasto sulla ramificazione con attività glicosidica (α 1-6). Le due attività, trasferasica e glicosidica, sono attività separate di un’unica proteina enzimatica: ENZIMA DERAMIFICANTE Il glucosio-1-fosfato è poi convertito a glucosio-6-fosfato per entrare nel flusso metabolico principale (Es.:GLICOLISI) 24 30/04/15 Glucosio 1-fosfato fosfoglucomutasi glucosio 6-fosfato La MOBILIZZAZIONE DEL GLICOGENO così come la GLUCONEOGENESI producono forme fosforilate che non possono uscire dalla cellula epatica. La conversione in glucosio libero comporta l’azione della Glucosio-6fosfatasi enzima presentenel fegato,nel rene e nell’intestino. Al contrario il glicogeno muscolare serve per il CATABOLISMO della cellula per cui il muscolo non possiede questo enzima. Nel fegato (e nei reni), ma non nel muscolo Glucosio-6-P Glucosio-6-fosfatasi glucosio + Pi può uscire dalla cellula nel sangue La mobilizzazione del glicogeno è controllata da ORMONI attraverso una cascata metabolica che è attivata dalla formazione di cAMP e prevede di FOSFORILAZIONI SUCCESSIVE di proteine enzimatiche 25 30/04/15 Molte sono le vie che confluiscono o che partono dal glucosio-6-fosfato GLICOGENO GLUCOSIO LIBERO Glucosio-6-fosfato GLICOLISI VIA DEL PENTOSO FOSFATO GLUCONEOGENESI 26 30/04/15 Produce NADPH e ribosio 5-fosfato GPD idrolasi Formazione di NADPH per la sintesi di acidi grassi e degli steroli Biosintesi dei nucleotidi e degli acidi nucleici Glucosio 6-fosfato + 2NADP+ + H2O ribosio 5-fosfato + CO2 + 2 NADPH + 2H+ PGD isomerasi Il ruolo di questa via è principalmente anabolico ( i prodotti servono per l’anabolismo) piuttosto che catabolico, sebbene compor ti l’ossidazione del glucosio Nei tessuti che richiedono principalmente, od in un certo momento NADPH , i pentoso fosfati vengono riciclati a glucosio 6-fosfato mediante una serie di reazioni isomerasi tK tA tK GPD PGD epimerasi Tutte le reazi oni sono rever sibili idrolasi 27 30/04/15 Formazione di R5P a partire da intermedi della glicolisi VIE ALTERNATIVE DEI PENTOSO FOSFATI 28 30/04/15 NADPH è utilizzato in reazioni che richiedono un donatore di elettroni con elevato potere riducente Specie reattive dell’ossigeno Reazioni antiossidanti Nei globuli rossi la via dei pentoso fosfati fornisce NADPH per la riduzione del glutatione ossidato Le cellule rigenerano glutatione ridotto attraverso una reazione catalizzata dalla glutatione reduttasi che utilizza NADPH come fonte di elettroni riducenti I globuli rossi dipendono esclusivamente dalla via dei pentosi fosfati per la produzione di NADPH 29 30/04/15 In individui con carenza di G6PD Farmaci ossidativi Antibiotici Antimalarici Antipiretici FAVISMO Effetto emolitico innescato da ingestione di fave Il gene per questo enzima si trova sul cromosama x Il difetto si manifesta con emolisi dei globuli rossi quando individui sensibili sono sottoposti a stress ossidativo causato da farmaci antiossidativi o per l’ingestione di fave ( Vicia faba, FAVISMO) 300 mutazioni che spiegano numerose varianti del gene G6PD A- e G6PD mediterranea differiscono dalla condizione normale per un solo aa 30 30/04/15 31