Il DNA - Università degli studi di Bergamo

Il DNA & cromosomi
Luca Muzio
San Raffaele Milano
[email protected]
La cellula :
unità fondamentale della vita
Tutti gli esseri viventi sono costituiti da una o più cellule: è la cellula la più
piccola porzione organizzata di materia che possiede le caratteristiche della
vita.
si autoregola
scambia materia
ed energia
CELLULA
con l’ambiente
si può evolvere
si riproduce
I geni: Struttura, funzione e traduzione del segnale
Nucleo
Citosol
Tutte le cellule viventi conservano la loro
informazione ereditaria sotto forma di molecole a
doppio filamento di DNA contenute all’interno del
nucleo cellulare.
10mm
Le cellule procariotiche sono comparse
per prime
Le cellule procariotiche (da
pro, prima e karyon, nucleo)
sono prive di un nucleo
racchiuso da una membrana.
Gli organismi unicellulari
costituiti da cellule
procariotiche, i procarioti,
sono classificati in due domini:
•Archaea (archei);
•Bacteria (batteri).
4
Sylvia 4S. Mader Immagini e concetti della biologia © Zanichelli editore, 2012
Le cellule eucariotiche contengono
organuli specializzati
Le cellule eucariotiche (da eu,
buono, e karyon, nucleo) hanno
un nucleo delimitato da una
membrana ben distinta, che
racchiude il DNA.
Gli organismi eucariotici, ossia
protisti, funghi, piante e
animali, fanno tutti parte del
dominio degli Eukarya
(eucarioti).
Sylvia 5S. Mader Immagini e concetti della biologia © Zanichelli editore, 2012
La cellula procariota
La cellula procariota è organizzata
per garantire la sopravvivenza di
organismi molto semplici, con
minime richieste energetiche, e non
risulta specializzata nel compiere
funzioni particolari.
membrana cellulare
regione nucleare
Tutto il volume cellulare è occupato
da un liquido di consistenza
gelatinosa (il citoplasma), in cui
sono immersi tuti i costituenti
chimici della cellula, e dei piccoli
organuli (ribosomi), deputati alla
sintesi delle proteine.
Il materiale genetico (DNA) si trova
fluttuante nel citoplama, in una
regione priva di una membrana che
la delimiti (non esiste un nucleo vero
e proprio).
Esiste invece una struttura rigida di
protezione e di contenimento, la
parete cellulare, che la separa
dall’ambiente esterno.
parete cellulare
citoplasma
ribosomi
La cellula eucariota
membrana nucleare
La cellula eucariota è un tipo di
cellula molto più voluminosa e
complessa della cellula procariota.
Al suo interno lo spazio è
organizzato in settori cui compete
una certa funzione in modo da
assicurarne la sopravvivenza e la
riproduzione.
citoplasma
membrana
cellulare
Le diverse regioni all’interno della
cellula
sono
delimitate
da
membrane interne. In particolare ,
una
membrana
(involucro
nucleare) delimita il nucleo, in cui
si trova il materiale genetico (DNA)
che presiede al controllo di tutte le
attività della cellula stessa.
La cellula eucariota possiede inoltre
numerosi organuli, in alcuni dei
quali hanno luogo i processi
metabolici
fondamentali
:
nei
ribosomi, ad es.,avviene la sintesi
delle proteine; i mitocondri sono
la sede della respirazione cellulare
nucleo
mitocondri
Reticolo endoplasmatico
con ribosomi
X 50
Zoom sulla punta di
uno spillo
X 1250
X 6000
X 30 000
Le cellule hanno piccole dimensioni
Lo strumento che ci consente di osservare le cellule più
piccole di 0,1 mm è il microscopio.
12
Una microfotografia ottenuta da un microscopio elettronico a trasmissione rivela il
contenuto di una cellula eucariotica vegetale. Nucleo, vacuoli, apparato del golgi nel
dettaglio.
Il ruolo del DNA nell’ereditarietà
Gli esperimenti di Hershey e lady Chase con i batteriofagi T2 ed E. coli.
I
II
vedi sopra
14
La molecola del DNA ha la forma di
una doppia elica
James Watson e Francis Crick costruirono il primo
modello tridimensionale del DNA basandosi sui risultati dei
lavori di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, che
avevano studiato la struttura del DNA usando la
cristallografia a raggi X.
Sylvia S. Mader Immagini e concetti della biologia © Zanichelli editore, 2012
Bacterial chromosome and a plasmid
Quasi tutto il DNA delle cellule eucariotiche è contenuto all’interno del nucleo della
cellula che è delimitato da un Involucro Nucleare composto da due doppi strati
lipidici. L’involucro è direttamente connesso ad aree del reticolo endoplasmatico e
molte proteine in grado di agire sul DNA sono disposte al di sotto della membrana
interna. Quindi, l’involucro nucleare non solo permette al compartimentalizzazione
del DNA ma mantiene separati enzimi che operano sul DNA da quelli che operano nel
citoplasma.
Quasi tutto il DNA di una cellula
eucariotica è contenuto all’interno
del nucleo. Questo compartimento
è delimitato dal citosol da un
involucro nucleare composto da
due doppi strati lipidici che sono
perforati a intervalli da grandi pori
nucleari. Attraverso questi pori
proteine e acidi nucleici si spostano
dal nucleo al citosol e viceversa.
L’involucro nucleare è connesso
direttamente
al
reticolo
endoplasmatico.
L’involucro
permette alle molte proteine che
interagiscono con il DNA di
muoversi e concentrarsi dove sono
necessarie.
La scoperta del DNA e della sua struttura a doppia elica è stata una pietra
miliare nella biologia del ventesimo secolo. Questo perché questa
scoperta ha permesso di dare contemporaneamente due risposte a
questioni cruciali che si dibattevano sin dall’inizio del 1900. Ossia, la
trasmissione dell’ereditarietà e l’origine dell’informazione necessaria alla
sintesi proteica
Una tipica cellula umana contiene circa 2 metri di DNA. Quest’ultimo oltre
ad una serie di istruzioni fondamentali per la sopravvivenza della cellula
porta le istruzioni, contenute nei GENI, per la sintesi di circa 20000-25000
proteine
Il genoma è costituto da diversi
cromosomi
Ogni singolo libro è un cromosoma
All’interno contiene le
informazioni per fare le proteine
Adapted from Patty D’Adamo
La funzione più importante dei cromosomi è quella di portare geni, ossia un
segmento di DNA che contiene le istruzioni per produrre una particolare proteina.
La sindrome di Klinefelter è una malattia genetica caratterizzata da un'anomalia cromosomica in cui un individuo di
sesso maschile possiede un cromosoma X soprannumerario. Normalmente le donne possiedono due cromosomi
sessuali XX e gli uomini uno X e uno Y: gli individui affetti dalla sindrome di Klinefelter hanno almeno due cromosomi X
e almeno un cromosoma Y. La malattia può presentarsi con un assetto testicolare di tipo fetale, deficit di androgeni,
testicoli e pene piccoli
Il DNA e le unita da cui è costituito
I componenti chimici del DNA sono uno zucchero il 2D-deossiribosio, il fosfato e quattro
diverse basi azotate: due purine (adenina e guanina) e due pirimidine (citosina e timina).
Una molecola di zucchero legata ad una base azotata forma un nucleoside; una molecola di
zucchero una base e un gruppo fosfato formano un nucleotide che rappresenta l’unità
fondamentale della molecola di DNA
Il modo in cui I nucleotidi sono legati
insieme dà al filamento una polarità
Ciascun zucchero è un blocco con una
sporgenza (il fosfato, 5’) ed un buco
dalla parte opposta (l’ossidrile, 3’).
Ciascuna catena completa è formata
dalla ripetizione di nucleotidi orientati
nella stessa maniera. Quindi si può
intuire che ciascuna catena ha una
estremità 5’ ed una 3’. Le due eliche
corrono
appaiate
in
senso
antiparallelo (i due filamenti si
avvolgono l’uno sull’ altro a formare
una doppia elica) e sono tenute
insieme da legami idrogeno e da legami
di Van der Walls (legami di tipo
debole). Le coppie di basi distano 3,4 A,
un giro completo di elica comprende 10
coppie di basi e il diametro trasversale
della doppia elica è di 20 A.
Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto
forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti
saldamente associati tra loro. Essi si intrecciano tra loro a
formare una struttura definita doppia elica. Ogni nucleotide è
costituito da uno scheletro laterale, che ne permette il legame
covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una base azotata, che
instaura legami idrogeno con la corrispondente base azotata
presente sul filamento opposto. Il composto formato da una
base azotata legata allo zucchero è definito nucleoside; un
nucleotide è invece un nucleoside a cui sono legati uno o più
gruppi fosfato.
Il modello di Watson e Crick(1953). Il DNA è una macromolecola costituita da due
filamenti avvolti in senso destrorso l’uno intorno all’altro, in modo da formare una
doppia elica. Ciascun filamento è costituito da una lunga sequenza di nucleotidi, lo
zucchero ed il fosfato si alternano lungo il filamento formando lo scheletro della
molecola del DNA; il legame tra le molecole di zucchero è covalente e si chiama
fosfodiesterico. Una volta stabilita la sequenza di una catena di DNA, la sequenza di
quella opposta, complementare, è determinata automaticamente dalle regole di
appaiamento che prevedono che di fronte ad una guanina ci sarà sempre una citosina e
una timina di fronte ad una adenina
Per poter svolgere la sua funzione il
DNA deve fare due cose: copiare se
stesso, per soddisfare il problema
dell’ereditarietà ed esprimere la sua
informazione (circa 25.000 geni). Il
meccanismo che viene impiegato per
ottenere questi due scopi porta alla
produzione di altre specie molecolari:
l’RNA e le Proteine. La prima parte di
questo secondo processo inizia con la
creazione
di
una
molecola
complementare ad uno dei due filamenti
di DNA. Questa prima fase viene
definita trascrizione e porta alla
creazione dell’ RNA messaggero (o
mRNA). In seguito le molecole di RNA
vengono “tradotte” in polimeri di una
classe chimica radicalmente diversa : le
proteine.
Il numero dei geni varia molto da organismo ad organismo. Per esempio un batterio ha
circa 500 geni, mentre una cellula umana ne codifica circa 25000. Tuttavia il genoma
umano contiene una grandissima quantità di DNA, intercalato tra un gene ed un altro
che non codifica per proteine. Queste sequenze sono oggetto di studio da più di 20
anni, a volte questo DNA non codificante è stato chiamato DNA spazzatura. Anche se si
ritiene che si in qualche modo coinvolto nella regolazione dell’espressione genica
Il codice genetico rappresenta lo schema attraverso cui la cellula traduce la sequenza sul
DNA (triplette di basi) in una sequenza di RNA e successivamente durante la traduzione in
una proteina. Quasi tutti gli esseri viventi usano il medesimo codice genetico, chiamato
codice genetico standard.
Il DNA codifica l’informazione tramite l’ordine in cui vengono messi i vari nucleotidi sul
filamento. Ciascuna base ( A, T, C, G) può essere considerata come una lettera di un alfabeto
costituito da quattro lettere. Il messaggio deposto sul DNA deve essere in qualche modo
usato per codificare le diverse proteine. La sequenza lineare di nucleotidi sul DNA deve in
qualche modo codificare la sequenza di amminoacidi di cui la proteina è composta. La
corrispondenza esatta tra l’alfabeto a quattro lettere del DNA e quello a venti lettere delle
proteine non è intuibile dalla struttura del DNA ed è stato definito Codice Genetico.
Translation starts with a start codon. Unlike
stop codons, the codon alone is not sufficient to
begin the process. Nearby sequences (such as
the Shine-Dalgarno sequence in E. coli) and
initiation factors are also required to start
translation. The most common start codon is
AUG, which is read as methionine.
The three stop codons have been given names:
UAG is amber, UGA is opal (sometimes also
called umber), and UAA is ochre. "Amber"
was named by discoverers Richard Epstein and
Charles Steinberg after their friend Harris
Bernstein, whose last name means "amber" in
German. The other two stop codons were
named "ochre" and "opal" in order to keep the
"color names" theme. Stop codons are also
called "termination" or "nonsense" codons.
They signal release of the nascent polypeptide
from the ribosome because there is no cognate
tRNA that has anticodons complementary to
these stop signals, and so a release factor binds
to the ribosome instead.
Nelle cellule eucariotiche il DNA è diviso in una serie di cromosomi diversi. Ciascun
cromosoma è associato a proteine che lo ripiegano e lo compattano per poter essere
accomodato nel nucleo cellulare. Nei batteri (procarioti) tutti i geni vengono portati su di
una sola molecola circolare, le proteine che lo compattano sono diverse e soprattutto non
esiste un involucro nucleare che separi il DNA dal citosol.
Il nucleosoma è stato scoperto nel 1974 sezionando delicatamente I nuclei e osservando al
microscopio elettronico una fibra di circa 30nm. Se si sottopone la cromatina a trattamenti
che indicono uno svolgimento, la struttura appare ancora più piccola con sembianze di una
collana di perle
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL
GENE, Zanichelli editore S.p.A.
Copyright © 2005
Il genoma umano è costituito approssimativamente da 3,2 x 109 nucleotidi ed è distribuito su 24
cromosomi diversi. Le molecole di DNA che formano i cromosomi non sono altro che stringhe di
geni messi uno di seguito all’altro. Ciascun cromosoma è costituito da un unica molecola di DNA
adeguatamente ripiegata ed associata a proteine. Questa struttura si chiama cromatina. Con
l’eccezione di poche specie cellulari tutte le cellule di un organismo eucariotico contengono due
coppie di ciascun cromosoma, una ereditata dal padre ed una ereditata dalla madre. I
cromosomi paterno e materno di un a coppia si chiamano omologhi. L’unica coppia di cromosomi
non omologhi è costituita dai cromosomi sessuali (X e Y nella specie umana). Il DNA è
estremamente compattato nel nucleo. Per esempio il ch. 22 con 48 X106 nucleotidi srotolato
sarebbe lungo 1,5 cm. Nel nucleo esso è lungo 2 mm. La compattazione è svolta da un numero
molto grande di proteine che in livelli successivi assicura la condensazione del DNA.
Le proteine che si legano al DNA per
formare la cromatina sono divise in due
gruppi: gli istoni e le proteine non
istoniche. Gli istoni servono per
formare il nucleosoma che rappresenta
il primo livello di organizzazione della
cromatina. Ciascun nucleosoma è
formato da otto proteine: due molecole
istoniche H2a, H2b, H3 e H4. Questo
ottamero viene avvolto dal DNA per
una lunghezza di 146 nucleotidi.
Ciascuna particella è separata dalla
successiva da un linker di lunghezza
variabile, da pochi nucleotidi sino ad un
numero di 80. Quindi in media una
cellula umana contiene circa 30 milioni
di nucleosomi. I nucleosomi sono
compattati l’uno sull’altro, generando
delle schiere di nucleosomi dove il
DNA viene fortemente compattato.
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL
GENE, Zanichelli editore S.p.A.
Copyright © 2005
Nucleosomes are DNA-protein
complexes, which are comprised of a
core particle of 1.6 left-handed turns
of DNA (roughly 146 bp) wound
around a protein complex called the
histone octamer (Figure 1.1(B)). The
histone octamer is a set of 8 basic
proteins, which are among the most
well conserved proteins known in
eukaryotes. It is comprised of a
central tetramer, (H3/H4), flanked by
two H2A/H2B dimers. The structure
of a single histone molecule includes
three major α helices with positivelycharged loops protruding at the Nterminals.
I nucleosomi sono compattati uno sull’altro generando schiere regolari in cui il DNA è
ancora più condensato Un altro istone detto H1 è chiamato in questo gioco di
condensazione. L’istone H1 sembra essere cruciale per tirare la cromatina e ulteriormente
compattarla anche se il meccanismo non è ancora del tutto noto.
Studi microscopici su cellule interfasiche hanno dimostrato l’esistenza di due tipi di
cromatina: l’eterocromatina e l’eucromatina. La prima forma rappresenta uno stato
della cromatina molto condensato, mentre la seconda rappresenta uno stato mediamente
più lasso della cromatina. Inoltre l’eterocromatina solitamente è più refrattaria ad far si
che i geni contenuti al suo interno vengano trascritti. Questo ovviamente per il suo alto
tasso di compattazione..
La Microscopia elettronica rende
possibile vedere l’ultrastruttura di molti
organelli. Questo perchè le cellule sono
fissate con metalli pesanti. Dato che
alcune strutture sono più o meno affini
per questi sali alcune strutture appaiono
più
o
meno
elettron
dense.
L’eterocromatina
e
l’eucromatina
rappresentano un ottimo esempio.
I cromosomi che normalmente sono aggrovigliati nel nucleo diventano visibili quando la
cellula entra in mitosi. Le due molecole identiche di DNA che si sono prodotte durante la fase
S si condensano drammaticamente formando i due cromatidi fratelli che si appaiano tramite il
centromero. Queste molecole sono ricoperte da un numero molto alto di complessi RNAproteine. Uno degli aspetti più importanti di questo fenomeno è la possibilità di separare i
cromatidi fratelli in modo tale che poi vengano agevolmente tirati verso le due cellule figlie
durante le fasi terminali della mitosi. Quest’ultimo processo di condensazione è svolto da
particolari proteine capaci di idrolizzare ATP per super condensare il DNA. Queste proteine
sono chiamate condensine.
According to NIH, “Scientists use newt lung cells in their studies because these cells are
large, easy to see into, and are biochemically similar to human lung cells."
Cariotipo della specie umana.
La funzione più importante per i cromosomi è portare l’informazione per codificare i geni.
Un gene è definito come un segmento di DNA che contiene le informazioni per produrre
una particolare proteina. Il numero dei geni nella specie umana si aggira sui 30000 ma, per
esempio, questo numero scende intorno a 500 in certi batteri.
Tuttavia i genomi di molte specie eucariotiche (uomo compreso) contengono molto più DNA
di quello necessario per la codifica dei geni. Questo DNA che si intercala tra un gene e l’altro
è stato definito Junk DNA (DNA spazzatura).
L’utilità di queste sequenze non è stata decifrata completamente ma sembrerebbe che la
funzione spaziatrice sia cruciale per una corretta espressione genica.
Organizzazione dei geni sul cromosoma: il ch. 22 umano, uno dei più piccoli,
contiene 48x106 coppie di nucleotidi (1.5% dell’ intero genoma)Ingrandendo una
parte del braccio lungo si possono vedere allineati circa 40 diversi geni (marrone
chiaro e scuro) Un ulteriore ingrandimento mostra l’intera lunghezza di 4
geni,mentre l’ingrandimento più spinto mostra l’organizzazione di un singolo
gene.
Il Progetto Genoma Umano ha permesso di sequenziare ed ordinare tutto il genoma umano.
Questo progetto ha portato alla luce alcuni aspetti sorprendenti. Il primo aspetto è quanto poco
del DNA codifichi per proteine o RNA strutturali. Molto del restante DNA cromosomico è
rappresentato da pezzi mobili di DNA che si sono intercalati tra i geni. Un altro aspetto è
rappresentato dalla dimensione media in nucleotidi di un gene che si stima essere intorno a
27000 nucleotidi. Tuttavia, soltanto 1300 nucleotidi, in media, vengono usati per codificare una
proteina, il restante DNA consiste in lunghi tratti di DNA non codificanti che interrompe i
piccoli segmenti codificanti. Le sequenze codificanti sono chiamate Esoni, mentre quelle non
codificanti vengono dette Introni.
Quindi molte sequenze di DNA sono semplici spaziatori che non portano alcuna
informazione, ossia non sono tradotte in proteine. Identificare le zone che portano
informazione non è semplice in quanto queste zone sono come piccole isole che galleggiano
in un mare di DNA che non ha nessuna funzione codificante. Un approccio vincente è
quello comparativo. Ossia per un dato gene tutte le regioni che devono essere tradotte in
proteina sono conservate anche tra specie molto lontane, mentre quelle che non ospitano
nessuna funzione sono libere di variare casualmente in quanto il loro cambiamento non
pregiudica la funzionalità del gene. Comparando il genoma di uomo con quello di topo (le
due specie hanno un comune antenato 100X106 anni fa) si sono trovate parecchie regioni
praticamente identiche che si ritiene corrispondano alle sequenze che sono necessarie a
portare l’informazione genica. Non solo, si è scoperto che grossi blocchi di genoma sono
praticamente identici portando addirittura gli stessi geni nello stesso ordine spaziale. Questo
fenomeno si chiama sintenia conservata.
IL DNA genomico non dirige direttamente la sintesi proteica, ma usa l’RNA come
molecola intermedia. Quando la cellula ha bisogno di una data proteina una parte del
genoma viene copiata in RNA definito messaggero o mRNA, in un processo chiamato
trascrizione. Questi mRNA emigrano dal nucleo e vengono usati come stampi per la
generazione delle proteine in un processo definito traduzione. Il flusso
dell’informazione è quindi il seguente DNA > RNA> Proteine . Tutte le cellule esprimono
l’informazione genetica in questo modo e questo principio è stato definito dogma centrale della
biologia molecolare.
RNA struttura della molecola:
L’ RNA è un polimero lineare
composto da quattro nucleotidi
legati attraverso un legame
fosfodiestere che differisce dal
DNA per due aspetti: 1) I nucleotidi
contengono un zucchero diverso da
quello del DNA, il il ribosio. 2) l’
RNA contiene la basi adenina
guanina e citosima ma al posto
della
base
timina
contiene
l’uracile. Poiché l’uracile è
piuttosto simile alla timina, esso si
può appaiare mediante legami a
idrogeno con l’adenina. Mentre il
DNA è a doppio filamento l’RNA è
a singolo. Questa caratteristica
permette all’RNA di ripiegarsi
nello spazio in un numero molto
grande
di
varietà.
Alcune
complesse a tal punto da far si che
l’RNA al pari delle proteine inizi a
funzionare come enzima catalitico
o acquisti particolari proprietà
strutturali.
La trascrizione inizia con lo svolgimento di una piccola porzione di DNA. In questo modo
uno dei due filamenti funziona da stampo per la sintesi di RNA La sequenza dell’ RNA è
definita dall’accoppiamento complementare delle basi fra i nucleotidi in arrivo e quelli dello
stampo di DNA. Quando questa corrispondenza viene soddisfatta il ribonucleotide viene
legato covalentemente alla catena di RNA in crescita. La catena di RNA quindi viene
allungata di un nucleotide alla volta ed ha una sequenza nucleotidica che è esattamente
complementare allo stampo di DNA usato.
La trascrizione avviene in direzione 5’>3’ ed il filamento di DNA che serve da stampo è
ovviamente quello 3’>5’. Il filamento di RNA viene quasi immediatamente rilasciato dal
DNA. Questo permette che molte copie di RNA possano essere prodotte dallo stesso gene in
un tempo breve. Questo perché la sintesi di una nuova molecola di RNA inizia prima che la
precedente molecola sia completata.
La maggior parte dei geni codificati sul DNA ha come prodotto finale una proteina e l’ RNA
messaggero rappresenta solo un prodotto intermedio in questo processo. Tuttavia per una
parte di geni il prodotto finale è proprio l’RNA stesso. Questi RNA, come le proteine
servono da enzimi per svolgere particolari funzioni all’interno della cellula. Sebbene non
tutte le loro funzioni di questi RNA non tradotti siano state decifrate, alcuni piccoli RNA
dirigono il fenomeno dello splicing; l’RNA ribosomale forma il nucleo dei ribosomi
impiegati nella traduzione degli mRNA e gli RNA transfer o tRNA formano gli adattatori
che scelgono gli amminoacidi e li tengono in posizione sul ribosoma durante la traduzione.
La replicazione del DNA.
Tutti gli organismi devono duplicare il loro DNA con estrema accuratezza. Il meccanismo
prevede che entrambe le eliche di DNA vengano usate come stampo per la generazione di
una elica complementare alla prima. Questo processo richiede che i due filamenti vengano
separati e successivamente un particolare enzima detto DNA polimerasi polimerizzi i
nucleotidi sul filamento complementare nascente.
Una delle due funzioni base del ciclo cellulare è
quella di duplicare il DNA cromosomico.
Questo processo avviene durante la fase S (S
per Sintesi). La serie degli eventi che prelude
alla duplicazione del DNA è molto complessa.
Prima di tutto è necessario che nella fase
precedente (G1) ci siano alcuni segnali presenti.
La replicazione del DNA inizia da delle origini
di replicazione ben definite a cui si attaccano
molte proteine durante tutte le fasi del ciclo
cellulare
formando
il
complesso
di
riconoscimento dell’ origine (ORC). Una di
queste proteine è Cdc6 che consente
successivamente l’attacco del complesso Mcm.
L’insieme di queste proteine forma il complesso
pre-replicativo. Una volta pronto questo
complesso alla fine di G1 una serie di segnali
scatena la replicazione del DNA da ciscuna
origine.
La doppia elica di DNA viene svolta e i due
filamenti si biforcano
formando una Y
chiamata forcella di replicazione Un
complesso macromolecolare contenente la
DNA pol inizia la sintesi dei nuovi filamenti
usando nucleotidi trifosfati come substrato. A
causa del fatto che i filamenti stampo sono
antiparalleli, la DNA pol può funzionare in
continuo solo sul filamento stampo 3’>5’. Su
questo
filamento
essa
esegue
una
polimerizzazione 5’>3’ continua. Sull’altro
filamento stampo la DNA pol per lavorare in
continuo dovrebbe polimerizzare in direzione
3’>5’. Ma una DNA pol che lavora in questo
modo non è mai stata trovata!!!!!
Per risolvere questo problema la polimerizzazione del nuovo filamento sullo stampo
5’>3’ avviene anche questa secondo la modalità 5’>3’. Ovviamente si generano così dei
corti filamenti complementari detti frammenti di Okazaki. Questi frammenti saranno
discontinui sul DNA e necessiteranno di essere ricuciti alla fine del processo.
Per il filamento 3’>5’ la DNA pol ha bisogno di un primer solo all’inizio della
polimerizzazione poi troverà sempre un’ estremità OH a cui aggiungere un nucleotide.
Per il filamento 5’>3’ dopo che è stato generato un frammento di Okazaki la DNA pol
deve iniziare la polimerizzazione di un nuovo filamento a valle del primo. Per questa
ragione è necessario un nuovo primer per iniziare la polimerizzazione la DNA primasi
è l’enzima che deve produrre corti primers fatti di RNA che serviranno come primer
di innesco per la DNA pol.
Il primer di RNA si lega al DNA creando un ibrido
DNA/RNA che servirà da innesco per la DNA
polimerasi. Un sistema di riparazione rimuove il
vecchio RNA primer e lo sostituisce con nuovo DNA
Infine un enzima chiamato DNA ligasi congiunge le
estremità 3’ del nuovo filamento con il 5’ del neo
sintetizzato.
Per far funzionare questa macchina è necessario che il DNA venga aperto e il filamento di
DNA stampo venga esposto per poter essere adeguatamente copiato. Gli enzimi deputati ad
aprire la doppia elica sono le DNA elicasi. queste molecole usano l’ATP per muoversi
velocemente lungo il DNA e separare le due eliche Inoltre ci vogliono delle proteine capaci
di legare il DNA a singolo filamento (SSB). Esse servono per destabilizzare l’elica e
impedire che il DNA si richiuda dopo il passaggio della DNA elicasi.
La forcella di replicazione di un mammifero impiega due DNA polimerasi diverse che
agiscono sul filamento 5’-3’ dove si devono fare i frammenti di Okazaky. Esse sono la DNA
pol d e quella a. Nei mammiferi una subunità della DNA pol a è la DNA primasi
responsabile della formazione dei primers.
Man mano che le elicasi lavorano sul DNA e
la forcella di replicazione si muove si creq
quello che è definito problema del super
avvolgimento. Dopo 10 basi di avanzamento
si verifica che il DNA ha svolto un giro
completo intorno all’asse della molecola. Per
evitare che il DNA si aggrovigli alcuni enzimi
detti DNA topoisomerasi creano un perno sul
DNA. L’enzima si lega ad un filamento e crea
una rottura su questo filamento. Questa rottura
permettere ai due filamenti di ruotare
liberamente su se stessi. Il verso della
rotazione sarà quello che permette di rilasciare
ogni tensione di super avvolgimento creata
dall’ avanzamento
della forcella
di
replicazione. La rottura è assolutamete
transitoria e quando la topoisomerasi si
allontana il legame si rigenera
La regione di DNA genomico dove la
doppia elica viene aperta per prima si
chiama origine di replicazione. Batteri
e microorganismi semplici hanno di
solito una sola origine di replicazione.
Le proteine iniziatrici controllano
l’esatto momento in cui la replicazoine
inizia. L’origine di replicazione
solitamente contiene sequenze ricche in
A-T, che possono essere separate più
facilmente. Le proteine del complesso
si legano al DNA e reclutano l’elicasi e
la primasi che inizia a creare un primer
complementare al primo stampo per
iniziare la polimerizzazione. Nel caso
di genomi complessi caratterizzati da
un numero di nucleotidi maggiore si è
osservata la presenza di numerose
forcelle
di
replicazione
che
contemporaneamente
iniziano
la
replicazione del DNA.