15 BSF Gen batterica e Ingegneria genetica [modalità compatibilità]

LABORATORIO DI
MICROBIOLOGIA DFC
Genetica batterica
• Trasformazione : l’ uccisione di una cellula non distrugge il DNA che
mantiene le sue proprietà, nel caso penetri in una nuova cellula
batterica.
• Coniugazione : due cellule batteriche entrano in contatto tramite
una struttura detta sex pilus che permette il trasferimento di materiale
genetico (plasmidi).
• Trasduzione (conversione fagica) : il trasferimento genetico è
mediato da batteriofagi, sono virus capaci di infettare i batteri, può
essere ristretta o generalizzata.
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TRASFORMAZIONE
TRASDUZIONE
Materiale genetico può essere trasferito da batterio a batterio mediante batteriofagi o
virus..
virus
La trasduzione può essere generalizzata quando il batterio infettato viene lisato, parti
del DNA batterico vengono inglobate dai fagi neosintetizzati, in una successiva
infezione caratteristiche del DNA del batterio possono comparire in altri batteri
infettati..
infettati
La trasduzione di tipo ristretto prevede l’inclusione del DNA virale in quello
cromosomico, (ciclo lisogeno), in un secondo tempo si ha la lisi del batterio, con
fuoriuscita dei fagi maturi che conterrano all’interno del loro Dna materiale genetico
batterico..
batterico
La conversione fagica è un tipo di particolare trasduzione che comporta l’acquisizione
di nuove caratteristiche da parte di una specie batterica, C. diphteriae dopo infezione
con fago beta produce tossina difterica. (ce FAGO BETA tossina botulinica in ceppi di C.
botulinum))
botulinum
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Trasduzione
generalizzata
Trasduzione
ristretta
Il DNA fagico
non contiene
una porzione
del DNA
dell’ospite
Il DNA fagico
contiene una
porzione del
DNA dell’ospite
Genetica batterica
• Trasformazione : l’ uccisione di una cellula non distrugge il DNA che
mantiene le sue proprietà, nel caso penetri in una nuova cellula
batterica.
• Coniugazione : due cellule batteriche entrano in contatto tramite
una struttura detta sex pilus che permette il trasferimento di materiale
genetico (plasmidi).
• Trasduzione (conversione fagica) : il trasferimento genetico è
mediato da batteriofagi, sono virus capaci di infettare i batteri, può
essere ristretta o generalizzata.
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CONIUGAZIONE
La coniugazione avviene tramite una particolare struttura detta sex
pilus, non si tratta di un mezzo di riproduzione non c’è fertilità ma è
un passaggio di porzioni di DNA
DNA..
La differenza tra cellula donatrice e ricevente è nella presenza di un
plasmide (DNA circolare extracromosomiale) che è indipendente
nella replicazione rispetto al DNA cromosomico.
cromosomico. Il plasmide
contiene l’informazione genetica per codificare il plasmide
plasmide..
Il plasmide può anche essere integrato nel DNA cromosomale
(episoma)..
(episoma)
Le cellule che hanno una copia del fattore F (plasmide) sono dette F
+ , quelle che non hanno il plasmide F-.
Il donatore fa una copia del fattore F per trasferirlo in batteri che non
l’hanno..
l’hanno
Esistono numerosi plasmidi che possono rimanere all’interno della
cellula batterica in assenza del fattore F.
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CONIUGAZIONE
Il plasmide può contenere anche geni che inducono l’antibiotico
resistenza..
resistenza
Donatori HFR
HFR:: si tratta di batteri che hanno il plasmide integrato (ma
possono revertire
revertire),
), fanno una copia del loro cromosoma che viene
passato al batterio ricevente, comunque in questo passaggio che si
realizza in poco tempo il fattore F non viene trasferito per cui i
riceventi rimangono F-. Comunque le cellule riceventi acquisiscono
altre caratteristiche veicolate dal plasmide
plasmide..
Il fattore R responsabile di questa trasmissione è trasferibile per tutti
gli enterobatteri.
enterobatteri. Questo plasmide contiene sia geni che codificano
per la resistenza che geni che codificano per il sex pilus
pilus.. (fattore R e
fattore TF transfer factor
factor)).
I plasmidi sono elementi trasmissibili che possono contenere anche
informazioni che riguardano il metabolismo e l’assunzione delle
sostanze..
sostanze
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LABORATORIO DI
MICROBIOLOGIA DFC
BIOTECNOLOGIE
Procedure tramite le quali si possono ottenere quantità
commerciali di prodotti utili, mediante l’uso di agenti biologici che
possono essere batteri lieviti, cell
cell.. Vegetali, cell
cell.. Animali
Animali..
Le biotecnologie vengono usate da sempre in agricoltura, per le
attività fermentative dei microrganismi
microrganismi..
•Ingegneria genetica
BIOTECNOLOGIE
•Produzione di anticorpi
•Ingegneria proteica
•Chimica degli oligonucleotidi
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BIOTECNOLOGIE
Ingegneria genetica : produzione di farmaci, vaccini prodotti a
indirizzo terapeutico. (organismi transgenici, con miglioramento p
della resistenza alle malattie infettive, piante, e alle avverse
condizioni ambientali, migliore resa nella produzione dei cereali).
Ingegneria proteica: modifiche strutturali che modificano l’attività in
vitro o in vivo di proteine ad uso terapeutico.
Chimica degli oligonucleotidi: sintesi di geni
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INGEGNERIA GENETICA
Procedura di manipolazione del DNA:: produzione di nuove
combinazioni di materiale ereditabile, ottenute mediante inserzione
di materiale genico di qualunque provenienza
provenienza.. La tecnica permette
di trasferire materiale genetico da un organismo a un altro in
condizioni non naturali anche se le cognizioni su cui si basa e gli
strumenti impiegati sono tutti derivati dall’osservazione dei fenomeni
naturali..
naturali
Tecnica del DNA ricombinante : modifica le caratteristiche genetiche
di piante e animali, in modo da migliorare la produzione agricola e
zootecnica in senso sia qualitativo che quantitativo
quantitativo..
Alterazione artificiale del corredo genetico
genetico:: sia inserzione che
ablazione di un gene
gene.. (GMO)
(GMO)..
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STRUMENTI DELL’INGEGNERIA GENETICA
ENZIMI : consentono di tagliare il DNA in punti specifici, in modo da
separare il tratto di DNA desiderato, di legarlo al vettore prescelto, o
modificato in vitro, in modo conveniente alle proprie necessità
necessità..
VETTORI:: consentono l’ingresso del gene scelto nella cellula ospite,
VETTORI
provvedono alla replicazione del DNA eterologo ed alla sua
espressione..
espressione
ORGANISMI OSPITI
OSPITI:: batteri, cellule animali e e vegetali, lieviti
lieviti..
Sono dotati di caratteristiche altamente specifiche.
specifiche. Le loro
caratteristiche genetiche o biochimiche li rendono più o meno adatti
a detrminate applicazioni pratiche o ad ospitare vettori
vettori..
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STRUMENTI DELL’INGEGNERIA GENETICA
Enzimi di restrizione
restrizione:: prodotti da diverse specie batteriche per le
quali rappresentano un mezzo di difesa, contro l’invasione dei
batteriofagi, in quanto degradano ogni DNA riconosciuto come
stampo..
stampo
Questi enzimi tagliano la doppia elica del DNA in punti precisi
caratteristici per ognuno di essi
essi.. Le dimensioni delle sequenze
vanno da 4 a 8 paia di basi
basi.. Le sequenze riconosciute sono dette
palindromi, sono sequenze con simmetria binaria in direzione di
lettura 5’ 3’ sono praticamente identiche
identiche..
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Modalità di taglio da enzimi di restrizione
AA TT
TT AA
Blunt – end: le due eliche sono uguali
G AA TT C
C TT AA G
Sticky – end: eliche a lunghezza differente
estremamente adesive, produzione di molecole
chimeriche in notevole quantità.
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Vettore
VETTORI: trasferiscono il DNA esogeno nella cell
VETTORI:
cell.. ospite in modo
da farlo replicare e trasmetterlo alle cellule figlie, mediante il vettore
è possibile introdurre un frammento di DNA qualsiasi in una cellula
eucariota o procariota, sia mediante microinieizione che ricorrendo a
metodi chimico fisici adeguati per rendere permeabile la membrana
membrana..
Il frammento deve esser stabile si deve replicare insieme con il DNA
ad ogni replicazione cellulare, eventualmente il DNA può essere
anche fornito di segnali appropriati che lo rendono un’informazione
genetica comprensibile
comprensibile..
Le funzioni di espressione, stabilità sono caratteristiche del vettore
prescelto..
prescelto
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Tipi di vettore
Elemento genetico extracromosomico (cosmide o plasmide)
VIRUS ANIMALI
FAGI
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Tipi di vettore
Vettori di clonaggio
Plasmidi di piccole dimensioni facili da isolare e purificare, con
capacità di replicazione autonoma, conferita anche da un’origine di
replicazione autonoma
autonoma.. Esitono vettori sintetici in forma plasmidiale
che sono atti a varie operazioni clonaggio, espressione, trascrizione
trascrizione..
pBR322
pBR
322..
Fagi : fago lambda con genoma completamente sequenziato e
fornito di appropriate mutazioni, in modo da adattarlo alle necessità
del clonaggio, vengono eliminati alcuni geni del fago che sono
sostituiti dal DNA esogeno.
esogeno.
I fagi presentano il vantaggio di ospitare frammenti di DNA più
lunghi..
lunghi
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Vettori virus animali
I vettori considerati consentono trasferimento di geni nelle cellule
batteriche e di lievito
lievito..
Per introdurre DNA esogeno nelle cellule superiori si adottano come
vettori i virus animali in grado di infettare cellule in vitro o in vivo di
replicarsi e in alcuni casi di integrarsi nel genoma
genoma..
Papovirus scimmia (SV
(SV$
$0), papilloma virus bovino, virus herpes,,
possono infettare e in alcuni casi trasformare una varietà di linee
cellulari..
cellulari
Efficienza di introdurre il proprio DNA nella cellula ospite
ospite..
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Clonaggio
Significa fare una copia identica
identica;; un frammento di DNA inserito in un
vettore che viene replicato un numero elevato di volte una volta che
il vettroe raggiunge la cellula ospite, si può anche riferire ad un
organismo che produce una popolazione di cellule o individui
identici a se stesso (clone)
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Biotecnologie innovative
Prima dello sviluppo delle biotecnologie del DNA ricombinante la
maggior parte dei farmaci umani, di natura proteica era disponibile
in quantità limitata, a questo va aggiunto la trasmissione di malattie
infettive in seguito alle trasfusioni di sangue o la comparsa di serie
manifestazione di ipersensibilità
ipersensibilità..
Sfruttando la tecnologia del DNA ricombinante è stato possibile
produrre un’ampia serie di farmaci in quantità sufficiente molto
efficaci e soprattutto sicuri
sicuri..
Attualmente 300 proteine con attività terapeutica vengono prodotte
dai microrganismi, contenenti lo specifico gene codificante
codificante..
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INSULINA DA DNA
RICOMBINANTE
Formata da due catene A e B, difficile ricavare il gene proinsulinico
(forma immatura della proteine che viene poi trasformata in insulina)
direttamente dalle cellule umane
umane..
Di provenienza bovina o suina presentava notevoli problemi di
allergia, di costi, di produzione, di minore efficacia dovute ai mezzi
di estrazione e purificazione
purificazione..
Estrazione del RNAm dalle cellule beta del pancreas
retrotrascrizione in DNA, sintesi chimica in laboratorio il gene della
proinsulina o delle singole catene A e B.
Dopo avere ottenuto il gene si ha l’ immissione nel batterio E. coli
(ospite) che sarà commissionato alla produzione di insulina umana
umana..
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Prodotti da ricombinazione genetica
Ormoni
peptidici
Proteine del sangue fattori di coagulazione
Peptidi atriali e neuropeptidi
antibiotici
Vaccini ricombinanti
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Vaccini ricombinanti
In una cellula eucariota o procariota viene clonato il gene del
microrganismo che codifica per la principale proteina immunogena
che induce nell’ospite la produzione di anticorpi protettivi
protettivi..
Vaccini virali, capside o envelope, vaccini batterici fimbrie, pili etc.
etc.
L’applicazione maggiormente conosciuta è quella del vaccino
contro l’epatite B , in genere per la produzione vaccinica si usano
sempre cellule eucariote per mantenere inalterate tutte le forme di
modificazioni postraduzionale
postraduzionale..
Si isola il gene per l’antigene HbsAg detto antigene australia, vien
espresso in una cellula di S. cerevisiae
cerevisiae.. Purezza del 98%
98%. Nessuna
rischio di ipersensibilità o intolleranza rispetto a vaccini ottenuti con
raccolta di sangue umano
umano..
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