Titolo del programma di ricerca dell’assegno richiesto
Meccanica di proteine e filamenti mediante trappola ottica
Responsabile Scientifico: Vincenzo Lombardi
Programma di ricerca dettagliato
Scopo di questo progetto di ricerca è lo sviluppo e l’applicazione di metodologie di meccanica con
risoluzione del nanometro e del piconewton alla definizione delle proprietà meccaniche e cinetiche
di molecole e di sistemi sopramolecolari quali le proteine e i filamenti dell’apparato contrattile e
citoscheletrico della cellula muscolare e le proteine di membrana responsabili della sensibilità
meccanica dei neuroni. A questo scopo viene impiegato un apparato nanotecnologico, la trappola
ottica a doppio laser (Dual Laser Optical Tweezers, DLOT), che è capace di registrare variazioni di
forza nell’ambito 0.5 - 200 pN e variazioni di lunghezza nell’ambito 1 – 100000 nm.
Un primo obiettivo della ricerca è lo sviluppo e la definizione delle proprietà meccaniche di
una bio-macchina sintetica basata sul motore miosinico, consistente in un singolo filamento di
actina che interagisce con una schiera di motori miosinici disposti su una superficie inorganica
nanostrutturata. Questo sistema, che noi chiamiamo “nanomuscolo”, permette di superare i diversi
limiti propri dei metodi che usano singole cellule o singole molecole e fornirà una misura della
forza isometrica e della dipendenza dal carico della potenza in una singola interazione della miosina
II con il filamento di actina nell’unità funzionale integra.
Un secondo obiettivo è applicare il DLOT alla caratterizzazione di neuroni nocicettivi, che
sono costitutivamente sensibili alla stimolazione meccanica. In collaborazione con il Laboratorio
di Farmacologia del Dipartimento dell’Area Critica Medico-Chirurgica saranno usato neuroni in
coltura per controllare/registrare i parametri meccanici responsabili della sensibilità meccanica
neuronale e la sua modulazione da parte di molecole bersaglio. La definizione ad alta risoluzione
spaziale e temporale delle risposte di membrana e intracellulari evocate dalla stimolazione
meccanica dei neuroni servirà a valutare in vitro e in vivo modelli di patologie caratterizzate da
allodinia/iperalgesia meccanica per identificare nuovi bersagli molecolari per lo sviluppo di
analgesici innovativi.
Metodologia usata e compiti del titolare dell’assegno
Il Dual Laser Optical Tweezers [1,2] permette di registrare forze fino a 200 pN e spostamenti fino a
100 µm e consente di usare una camera a flussi per il cambio rapido di soluzioni. Le forze sono
misurate dalla posizione nella trappola della biglia, che in genere è connessa ad un estremo del
sistema sotto esame. Gli spostamenti sono imposti con un nano-manipolatore piezoelettrico X-Y-Z
servo controllato (PDQ375 Mad City Labs, ambito di movimento 1-75000nm), cui è attaccato,
tramite una micropipetta od una fibra ottica assottigliata chimicamente, l’altro estremo del sistema.
Nell’apparato sono stati recentemente introdotti un sistema di controllo della temperatura (intervallo
4-40°C) e un rapido controllo di forza che permette di imporre gradini di forza completi in meno di
2 ms [2].
1. Nell’applicazione alla meccanica del nanomuscolo, le interazioni del filamento di actina con la
schiera di miosine generano forza se il filamento di actina è attaccato alla biglia tramite la sua
estremità + (che corrisponde alla linea Z nell’emisarcomero). Questo si ottiene usando il preparato
Bead Tailed Actin (BTA) [3], sviluppato nel nostro laboratorio con il supporto di J. Sellers dei
National Institutes of Health (Bethesda, USA). La produzione di molecole di miosina perfettamente
funzionali dal muscolo di rana (opportuna perché i valori più attendibili dei parametri meccanici,
cinetici ed energetici provengono da questo muscolo) è stata messa a punto con successo nel nostro
laboratorio [4]. La costruzione della superficie inorganica nano strutturata per il controllo della
geometria della schiera di motori, è fatta in collaborazione con D. Cojoc dell’Istituto Officina dei
Materiali (IOM-CNR, Trieste) e sarà il fattore limitante per la realizzazione della bio-macchina
sintetica. Con una versione semplificata del sistema, in cui una BTA lunga 7-12 µm viene portata a
reagire, in condizioni di controllo di forza o di lunghezza, con un insieme di motori miosinici
disposti a caso su una superficie piatta di 5 µm di diametro in soluzione priva di ATP, abbiamo già
misurato la forza di un singolo evento di rottura del legame acto-miosinico [5] e il tempo di vita del
legame in relazione al carico. L’esperimento può essere fatto anche con HMM di muscolo di
mammifero e con ogni altra proteina motore e questo rende questo tipo di saggio il metodo più
potente per la caratterizzazione in vitro di ogni tipo di miosina muscolare e non, nativa o
modificata.
2. Per quanto riguarda la ricerca sulla meccano-sensibilità dei neuroni, per prima cosa verranno
stabiliti protocolli per applicare stimoli meccanici, in controllo di lunghezza o forza, su un neurone
selezionato della popolazione in coltura e su una zona selezionata del neurone (soma/neurite). I
neuroni sono piastrati su vetrini, trattati con poli-lisina e laminina, fissati mediante colla ottica al
pavimento di una camera a flusso appositamente concepita, posizionata tra gli obiettivi posti l’uno
di fronte all'altro per focalizzare i due raggi laser del DLOT. La posizione della camera è controllata
il mediante nano-posizionatore piezoelettrico servo-controllato. La biglia di polistirene utilizzata
per lo stimolo meccanico viene intrappolata nel fuoco dei due laser che sviluppa forze nell’ambito
1-200 pN, un ambito dinamico sufficiente ad evocare la risposta dei meccanorecettori [6]. Le decine
di millimetri di movimento necessari per spostarsi tra i vari neuroni si otterranno montando il
modulo piezoelettrico su un micro-posizionatore X-Y automatizzato. Il disegno della camera di
flusso permetterà di avere un flusso laminare che permetterà di cambiare la concentrazione dei vari
agenti durante l'esperimento. In questo modo ogni neurone potrà essere caratterizzato per la
relazione forza-deformazione sia istantanea (elastica) che dinamica (viscoelastica, che sottende
plasticità del citoscheletro). Questi test ottimizzeranno il protocollo di stimolazione meccanica da
utilizzare nella serie successiva di esperimenti in cui i neuroni verranno incubati con indicatori
intracellulari di calcio per determinare le risposte intracellulari alla stimolazione meccanica in
condizioni di controllo e in presenza di farmaci (agonisti e antagonisti per determinati recettori e/o
canali).
1. Bianco P., Nagy A., Kengyel A., Szatmári D., Mártonfalvi Z., Huber T. Kellermayer M.S.Z.
Biophys J 93:2102-2109, 2007
2. Bianco P., Bongini L., Melli L., Dolfi M., Lombardi V. Biophys J. 101:866-874, 2011
3. Suzuki N., Miyata H., Ishiwata S., Kinosita K. Biophys J 70:401-408, 1996
4. Elangovan R., Capitanio M., Melli L., Pavone F.S., Lombardi V., Piazzesi G. J Physiol.
590.5:1227–1242, 2012
5. Melli L., Bianco P., Pinato G., Maffei M., Salvi L., Bottinelli R. Cojoc D., Lombardi V. Biophys
Soc 56th annual meeting, San Diego 25-29 Feb. 2012, Pos-L212
6. L. Ponce, A. Berquand, M. Petersen, and M. Hafner. Microscopy: Science, Technology,
Applications and Education. A. Méndez-Vilas and J. Díaz Eds., 2010
