10/19/16 Il DNA come molecola in grado di veicolare informazione ereditabile (genetica) Essenz. Alberts: cap 6 La trasmissione dell’informazione replicazione DNA dA, dG, dC, dT RNA A, G, C, U trascrizione traduzione Proteina 20 aminoacidi Dogma centrale della biologia 1 10/19/16 Definizione molecolare di GENE L’intera sequenza di DNA necessaria per la sintesi di un polipeptide (o RNA) funzionale Comprende: • regione trascritta = il tratto di DNA che viene trascritto in mRNA • regioni regolative = tratti di DNA necessari per la corretta trascrizione ed espressione del mRNA GENE DNA promotore regione trascritta Trascrizione mRNA 5’ 3’ Traduzione Proteina NH2 COOH Funzione biologica 2 10/19/16 Gli studi più recenti indicano che molto probabilmente il 70-90% del genoma è trascritto • Genoma • Trascrittoma • Proteoma 3 10/19/16 La trasmissione dell’informazione 4 desossi-ribonucleotidi 4 ribonucleotidi 20 aminoacidi 4 10/19/16 La replicazione del DNA è semiconservativa Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 La replicazione del DNA è semiconservativa Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 5 10/19/16 La polimerizzazione del DNA La DNA polimerasi aggiunge (deossi) nucleotidi all’estremità 3’ di un filamento di DNA Direzione della polimerizzazione: 5’ => 3’ Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 La polimerizzazione del DNA richiede due elementi fondamentali: 1. STAMPO 2. INNESCO 6 10/19/16 Fase di inizio Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 7 10/19/16 DNA genomico eucariotico: vi sono più origini di replicazione Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 ü Riconoscimento dell’origine di replicazione ü Apertura della doppia elica da parte di una elicasi ü I filamenti singoli vengono subito rivestiti da proteine SSB (single-strand binding proteins) che impediscono il riappaiamento del DNA ü Un enzima specifico, la primasi sintetizza un corto segmento di RNA che funziona da primer per la sintesi del DNA ü Poiché la DNA polimerasi può polimerizzare il DNA solo in direzione 5’ -> 3’, uno dei due filamenti stampo deve essere copiato mediante un meccanismo discontinuo di cucitura all’indietro. È quindi definito filamento ritardato 8 10/19/16 La forcella replicativa Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 Entrambi i filamenti del DNA fungono da stampo per la replicazione: Filamento guida - filamento lento zucchero trifosfato Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 9 10/19/16 Sul filamento lento avvengono ripetuti eventi di “innesco” 10 10/19/16 La sintesi del filamento ritardato (lagging strand) avviene mediante un meccanismo discontinuo di “cucitura all’indietro” Procede a partire da inneschi multipli, generando frammenti di DNA (frammenti di Okazaki) che vengono uniti da una ligasi Lunghezza frammenti di Okazaki: Procarioti: 1000-2000 nt Eucarioti: 100-200 nt Mentre la sintesi del filamento guida procede, la primasi sintetizza un corto RNA (<15nt) complementare al filamento ritardato; questo funge da primer per la sintesi di DNA nel verso OPPOSTO alla direzione di spostamento della forcella di replicazione. Questi frammenti misti di DNA ed RNA sono stati scoperti da Reiji Okazaki. Quando questo raggiunge il segmento precedente (perche’ và all’indietro), il primer di RNA viene rimosso, lo spazio lasciato vuoto viene riempito con desossinucleotidi, ed I frammenti vengono in fine legati tra loro. A unique property of the replicating region of chromosomal DNA. Sakabe K, Okazaki R. BBA. 1966, 129(3):651-4. 11 10/19/16 Un unico complesso multi-enzimatico attivo alla forcella di replicazione B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2015 6 | 24 12 10/19/16 Altri enzimi importanti: le Topoisomerasi e’ necessaria una rapida rotazione del DNA in questo punto Stampo del fialmento guida Stampo del filamento lento DNA polimerasi sul filamento guida Catena di DNA di nuova sintesi” Alberts et al., L’ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005 13 10/19/16 Topoisomerasi di tipo I. È in grado di tagliare e ri-legare un filamento di DNA, riducendo il superavvolgimento Due doppie eliche di DNA sono incastrate tra loro Topoisomerasi di tipo II Chemioterapici: Camptothecin per Topoisomerasi I Etoposide per Topoisomerasi II La DNA topoisomerasi di tipo II effettua un legame covalente reversibile su entrambi i filamenti di una delle due eliche di DNA La reazione inversa della DNA topoisomerasi di tipo II ricrea la doppia elica Le due doppie eliche di DNA sono libere 14