TCR – trasduzione segnale

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Trasduzione dei segnali del TCR
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TCR: trasduzione del segnale
• I segnali trasdotti dal TCR inducono l’espressione
coordinata di numerosi geni (silenti nelle cellule naive)
– proliferazione
– differenziamento
– funzioni effettrici
• La trasduzione del segnale è indotta dalla stimolazione
di più recettori TCR (tutti con la stessa specificità antigenica) e
corecettori
• Il risultato del riconoscimento dell’antigene è
determinato dalla durata e dall’affinità dell’interazione
tra TCR e complesso peptide-MHC
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Gli eventi precoci in risposta al riconoscimento dell’antigene
comportano il raggruppamento di diversi recettori di
membrana, la fosforilazione in tirosina di numerose proteine e
il reclutamento di molecole adattatrici
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I segnali indotti dal recettore per l’antigene attivano
diverse vie di trasduzione
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Eventi di trasduzione del segnale
• attivazione tirosine chinasi/fosfatasi
• coinvolgimento di molecole adattatrici
• generazione di secondi messaggeri
– DAG, IP3, Ca2+, cAMP, cGMP
• amplificazione attraverso cascate di enzimi
• attivazione di serina/treonina chinasi/fosfatasi
• attivazione di fattori di trascrizione
• attivazione trascrizione di geni
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TCR: trasduzione del segnale
• TCR ha una bassa affinità per complessi MHC-peptide
– Kd 10-5-10-7 M
– Off rate veloce
• Singoli TCR inducono un segnale debole
• Poche delle molecole MHC espresse da APC presentano
peptide riconoscibile da un determinato TCR
• Solo 10-100 complessi MHC-peptide (in un totale di 104-105)
necessitano di essere riconosciuti da TCR per indurre
attivazione
• Lo stesso TCR può essere attivato più volte
• L’intero processo può durare ore
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“Sinapsi Immunologica”
• Questa prolungata interazione è permessa dalla
costituzione della SINAPSI IMMUNOLOGICA nell’area
di contatto tra cellula T e APC
• Il raggruppamento di raft è un evento necessario per la
formazione della sinapsi immunologica
• A seguito di stimolazione TCR monomerici vengono
reclutati in raft e formano dei cluster
• Anche molecole adattatrici e di trasduzione del segnale
sono reclutate nei raft (ZAP70, Vav, Grb2)
(IS: immunological synapse, sinapsi immunologica)
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I raft
• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in
lipidi saturi, colesterolo e GM1
• Compartimentalizzano molecole importanti per la
trasduzione del segnale
– che sono reclutate nei raft attraverso modifiche posttraduzionali
• aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn
• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras
• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali
indotti da TCR
• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’IS
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I raft
• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in
lipidi saturi, colesterolo e GM1
• Compartimentalizzano molecole importanti per la
trasduzione del segnale
– che sono reclutate nei raft attraverso modifiche posttraduzionali
• aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn
• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras
• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali
indotti da TCR
• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’IS
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La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i
raft verso il sito di contatto
Linfocita T non stimolato
Stimolazione TCR
Stimolazione TCR e CD28
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Sinapsi Immunologica (3)
• Inizialmente cellula T e APC interagiscono attraverso
molecole di adesione
– LFA-1  ICAM
• In questa fase il TCR controlla complessi MHC-peptide
– se non riconosce complessi, l’interazione cellula T-APC cessa
• Se il TCR riconosce complessi MHC-peptide invia segnale:
– aumento affinità LFA-1 → stabilizzazione interazione
– arresto migrazione (segnale di stop), ritiro uropode
• meccanismo che ritiene cellule T in organi linfatici secondari
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Ruolo di integrine e TCR in
interazione cellule T - APC
TCR non riconosce
complesso Ag-MHC
Dissociazione
APC cellula T
Adesione debole
Indipendente da Ag
TCR riconosce
Complesso Ag-MHC
Forte adesione
APC cellula T
Risposta
funzionale
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Sinapsi Immunologica (4)
• Stimolazione di TCR e LFA-1 induce la polarizzazione della
cellula T in direzione della APC (antigen-presenting cell)
• Riorganizzazione citoscheletro
– filamenti di actina e talina sono reclutati nei pressi della sinapsi imm.
– MTOC (MicroTubule Organising Center) si sposta dall’uropode a IS
– questi eventi favoriscono il reclutamento di recettori e molecole di
trasduzione alla sinapsi immunologica
• LFA-1 migra verso la porzione esterna dello SMAC mentre i
TCR muovono al centro
– il blocco nella formazione di questo cluster centrale blocca
l’attivazione dei linfociti T
• La riorganizzazione è in parte condizionata dalle dimensioni
dei complessi recettori-ligandi
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Linfocita T
LFA-1
CD2 TCR CD28
LFA-1
15 nm
ICAM
CD58 MHC
B7
ICAM
APC
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Supra-Molecular Activation Cluster
LFA-1
TCR
CD28
Overlay
cSMAC
pSMAC
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A seguito di attivazione
PKCq è reclutata nella IS
A seguito di attivazione
CD45 non è reclutata nella IS
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• CD3
Complesso del TCR
– catene g, d, e
• omologhe l’una con l’altra
• singolo dominio Ig
– 1 eterodimero d/e
– 1 eterodimero g/e
• catena z
– omodimero z/z
• in 90% CD3
– eterodimero z/h
• in 10% CD3
• h splicing alternativo z
– le catene z sono associate
anche ad altri recettori
•
durante la maturazione dei timociti le
proteine del CD3 e z sono espresse
prima del TCR ma saranno presenti
sulla membrana cellulare solo dopo il
corretto assemblaggio con le catene
a/b del TCR
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Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
ITAM
• ITAM: Tyr-x-x-Leuxxxxxx(xx)Tyr-x-x-Leu
– 1 ITAM in catene g, d, e
– 3 ITAM in catene z
• Le sequenze ITAM di CD3/catene z collegano funzionalmente
riconoscimento dell’antigene da parte del TCR e trasduzione del
segnale
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ITAM
• La fosforilazione delle ITAM del CD3 e delle catene z avviene
pochi secondi dopo la stimolazione del TCR
• Due famiglie di PTK fosforilano e interagiscono con le ITAM
– Src e Syk
• Inibitori delle PTK inibiscono gli effetti della stimolazione del TCR
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Membrana cellulare
APC
Il corecettore CD4
MHC II
TCR
Membrana cellulare
linfocita T
CD4
•
•
•
Composto da 1 catena
4 domini Ig extracellulari
riconosce dominio b2 di MHC II
•
CD4 lega p56lck in porzione
intracitoplasmatica
Topi KO per CD4 non hanno
linfociti T ristretti da MHC II
•
– se transfettati con CD4 normale
sviluppano linfociti T ristretti da
MHC II
– se transfettati con CD4 privo del
sito di legame per p56lck mancano
di linfociti T ristretti da MHC II
• Espresso da timociti, linfociti Tab periferici (ca. 65%), alcune cellule dendritiche
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Il corecettore CD8
•
•
•
Composto da 2 catene legate da
ponte disolfuro
– eterodimero CD8a/CD8b
– omodimero CD8a/CD8a
1 dominio Ig extracellulare/catena
riconosce dominio a3 di MHC I
• CD8 lega p56lck in porzione
intracitoplasmatica
•
Topi KO per CD8 non hanno
linfociti T ristretti da MHC I
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La Src chinasi p56lck
N-terminale
Unique SH3
SH2
Kinase
Y
C-terminale
R
Y
• “Unique”, sequenza caratteristica della famiglia
– lega CD4 e CD8
• SH3, lega sequenze specifiche ricche in prolina
• SH2, lega P-Tyr all’interno di specifiche sequenze
• Kinase, dominio catalitico
• R, dominio regolatorio
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Dominio SH2
• SH2, Src Homology 2
• Dominio proteico
strutturalmente conservato
contenuto in Src ed altre
proteine che trasducono
segnali
• SH2 lega residui di Tyr
fosforilati nel contesto di
specifiche sequenze
peptidiche
NH2
COOH
Dominio SH2 di p56 Lck
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L’attività catalitica di Lck è regolata da
cambiamenti conformazionali
SH3
SH2
P
Y
Y
PTPase
Y
Stimolazione TCR Y
Dominio catalitico
Dominio regolatorio
Csk
CD45
P
Y
• Fosforilazione di Y in dominio catalitico induce cambiamento
conformazionale che permette accesso del substrato
• La fosforilazione della Tyr nel dominio regolatorio induce una
conformazione chiusa
– SH2 interagisce con il C-terminale
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La Syk chinasi ZAP-70
N-terminale
SH2
•
SH2
Kinase
Y
C-terminale
Y
292
493
z chain-associated protein 70
• Espressa esclusivamente in linfociti T e NK
• 2 domini SH2 legano ITAM fosforilate con affinità elevata
• La fosforilazione di Y292 ad opera della stessa ZAP-70 inibisce
l’attività catalitica
– autoregolazione negativa
• La fosforilazione di Y493 nel dominio catalitico attiva l’enzima
– Y493 fosforilata da p56lck
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MHCII-Ag
TCR
CD3
CD3
TCR
CD4
zz
• MHCII-Ag, TCR e CD4 interagiscono
CD4
ZAP
• CD4 avvicina Lck a TCR-CD3
• p56lck fosforila le ITAM di CD3 e z
• ZAP-70 si lega alle ITAM fosforilate attraverso 2 domini SH2
• Università
p56lckdi fosforila
Y493 di ZAP-70
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LAT, Linker for Activation of T cells (1)
• Molecola adattatrice che permette di reclutare enzimi e altri
adattatori
• Permette l’attivazione di almeno3 vie di trasduzione
– Ras  Raf  Mek  Erk  Elk  Fos
– SLP76 Vav  Rac  Mekk  JNK  Jun
– PLCg1
• IP3 Ca2+
• DAG  PKC
• Localizzato nei raft attraverso modifica post-traduzionale
(palmitoilazione)
• Viene fosforilato da ZAP70
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LAT, Linker for Activation of T cells (2)
• In assenza di LAT molti degli eventi indotti dalla trasduzione
del segnale del TCR sono compromessi:
–
–
–
–
flusso di calcio
attivazione ERK e altre MAP chinasi
attivazione di fattori trascrizione (NF-AT, AP-1)
produzione IL-2
• LAT è richiesto anche per lo sviluppo dei linfociti T nel timo
• Topi LATKO non producono cellule T mature
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CD3
CD4
LAT
lck
ZAP
PIP2
PLC
abTCR
LAT  PLCg1
DG
PKCq
IP3
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CD3
CD4
LATPLCg1Ca2+
CRAC
lck
ZAP
PIP2
LAT
PLC
abTCR
DG
IP3
Ca2+
Ras
PKCq
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Attivazione
fattori
trascrizione
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L’aumento di Ca2+ libero
intracitoplasmatico è transiente
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LATSOSRasMAP chinasi
CD3
CD4
lck
ZAP
LAT
abTCR
Grb2
Sos
Shc
Raf
MEK
ERK
Attivazione
fattori
trascrizione
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CD3
lck
ZAP
PLC
CD28
CD4
LAT
abTCR
LAT  SLP76  VAV
vav
Attivazione
fattori
trascrizione
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Attivazione fattori di trascrizione
• De novo sintesi
– c-Fos
• componente di AP-1
• trascrizione indotta da stimolazione TCR
• Assemblaggio
– dimerizzazione STAT
• fosforilazione da parte di Jak
• Modificazioni covalenti
• Localizzazione
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Attivazione di fattori trascrizione
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Cinetica di espressione in
linfociti stimolati da antigene
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Geni espressi dopo attivazione
• Geni immediati
• c-fos, c-jun, nf-at, c-myc, nf-kb < 30’
• Geni precoci
• IFNg
• IL-3, IL-2Ra
• IL-6
• GM-CSF
• Geni tardivi
< 1h
1-2 h
4-6 h
20 h
• VLA-4
• VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-5
4g
7-14 g
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