Relazione attività Genetica Tumori

RELAZIONE ATTIVITÀ SCIENTIFICA 1999-2002
LINEA DI RICERCA “GENETICA DEI TUMORI”
CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE
Alghero (Sassari)
Responsabile Scientifico della Linea di ricerca
Dr. Giuseppe Palmieri, Primo Ricercatore C.N.R.
Personale C.N.R. impegnato sulla Linea di ricerca
Dr. Antonella Manca, Ricercatore ex art.23
Dr. Marina Pisano, Ricercatore
Dr. Carla Rozzo, Ricercatore
Membri del Gruppo Collaborativo costituito sulla Linea
Istituto Anatomia Patologica, Università degli Studi di Sassari
Prof. Francesco Tanda, Professore Ordinario
Dr. Antonio Cossu, Dirigente medico
Istituto Nazionale Tumori “Fondazione Pascale” di Napoli
Dr. Giuseppe Castello, Direttore U.O.C. Immunologia Clinica
Dr. Paolo Ascierto, Dirigente medico Immunologia Clinica
Centro di Osservazione Epidemiologica Multizonale,
Azienda Unità Sanitaria Locale n.1, Sassari
Dr. Mario Budroni, Dirigente medico
Enti o Associazioni che supportano/hanno supportato la Linea
Assessorato Igiene e Sanità ed Assistenza Sociale
Regione Autonoma della Sardegna
Assessorato alla Programmazione, Progetto “Genetica e
Tumori nel Nord Sardegna”, Regione Autonoma della Sardegna
Assessorato alla Sanità, Regione Campania
Ricerca Finalizzata, Ministero della Sanità
Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
ALTRO PERSONALE IMPEGNATO SULLA LINEA DI RICERCA
-
Dr. Paola Baldinu, biologa, contrattista ex art.37 Regione Autonoma Sardegna
-
Dr. Milena Casula, biologa, contrattista Co.Co.Co Regione Autonoma della
Sardegna
-
Dr. Maria Colombino, biologa, contrattista Co.Co.Co Regione Autonoma della
Sardegna
-
Dr. Grazia Palomba, chimica, dottoranda Università degli Studi di Sassari
-
Sig.ra Maria Paola Satta, tecnico di laboratorio, contrattista Co.Co.Co Regione
Autonoma della Sardegna
-
Dr. Maria Cristina Sini, biologa, contrattista Co.Co.Co Regione Autonoma
della Sardegna
ALTRO PERSONALE CHE HA CONTRIBUITO ALLO SVILUPPO DELLA LINEA
-
Sig. Antonello Arba, tecnico di laboratorio (attualmente dipendente A.S.L.)
-
Dr. Cinzia Loddo, chimica, dottoranda Università degli Studi di Sassari
-
Dr. Rosella Muresu, biologa, ricercatrice C.N.R.
-
Dr. Silvia Tore, studentessa in Scienze Biologiche dell’Università di Sassari
Altre Collaborazioni essenziali all’attività della Linea di ricerca
Gruppo Cooperativo sul Melanoma-Melanoma Cooperative
Group, Istituto Nazionale Tumori “G. Pascale” di Napoli
Centro clinico di Ricerca per lo studio delle Malattie Genetiche
(Presidente Dr. Domenico Milano), Gioia del Colle (Bari)
Istituto Internazionale di Genetica e Biofisica, C.N.R., Napoli
Dr. Michele D’Urso, Dirigente di Ricerca C.N.R.
Istituto di Scienze dell’Alimentazione, C.N.R., Avellino
Dr. Antonio Malorni, Dirigente di Ricerca C.N.R.
Wellcome Trust Sanger Institute del Regno Unito
Dr. Mike Stratton, Direttore
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Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
INDICE
Premesse essenziali ………………………………………………………………………
pag. 4
Presupposti dell’attività scientifica sviluppata dal gruppo ……
pag.
Obiettivi perseguiti ………………………………………………………………………..
pag. 10
Fasi della ricerca …………………………………………………………………………….
pag. 11
9
Arruolamento dei pazienti e segnalazione dei casi …………………
pag. 11
Preparazione ed analisi del materiale biologico ………………………
pag. 13
Analisi mutazionale mediante DHPLC e sequenziamento ……….
pag. 13
Genetica dei tumori: risultati ottenuti dal gruppo ………………….
pag. 17
carcinoma della mammella …………………………………………………….
pag. 17
carcinoma dell’endometrio …………………………………………………….
pag. 18
carcinoma del colon-retto ……………………………………………………..
pag. 20
melanoma maligno ………………………………………………………………..
pag. 21
Sviluppo di nuovi marcatori molecolari come fattori
prognostici nel melanoma ………………………………………………….
Flow charts ……………………………………………………………………………….
pag. 26
pagg. 28-32
Produzione Scientifica della Linea (1999-2002) …………………..
pag. 33
Pubblicazioni …………………………………………………………………………..
pag. 33
Pubblicazioni Atti di Congressi ……………………………………………….
pag. 35
Partecipazioni e Comunicazioni a Congressi ………………………….
pag. 38
Progetti Finanziati nell’ambito della Linea di ricerca
“Genetica dei Tumori”……………………………………………………………….
pag. 39
3
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
PREMESSE ESSENZIALI
I tumori maligni rappresentano nel mondo occidentale e in Italia la seconda causa
di morte. La loro distribuzione a livello mondiale non è uniforme: vengono infatti
descritte grandi variazioni geografiche nella loro incidenza legate prevalentemente
a fattori ambientali e genetici. I dati che provengono dal mondo occidentale, relativi
all’incidenza
e
mortalità
per
cancro,
segnalano
una
crescita
notevole,
verosimilmente anche in relazione al generale invecchiamento della popolazione.
Approssimativamente, un individuo su tre in Europa e nel Nord-America si
ammalerà di uno dei 200 differenti tipi di cancro nella sua vita; inoltre il cancro
causa la morte di un individuo su cinque, nel mondo occidentale.
Qui di seguito è rappresentata la distribuzione delle percentuali di mortalità totale
relative agli Stati Uniti:
Malattie cardiovascolari
31,4
Tumori
23,3
Malattie cerebrovascolari
6,9
4,7
4,1
3,7
2,7
1,3
0,9
0,7
Malattie croniche polmonari
Incidenti
Broncopolmoniti
Diabete mellito
Suicidio
Omicidio
Infezioni da HIV
Adattato da Greenlee RT, et al. CA Cancer J Clin. 2000; 50: 22
Per l’Italia l’andamento appare simile a quello di altri Paesi Europei. I dati relativi
alla
sopravvivenza
da
tumore
nel
corso
dell’ultimo
decennio
indicano
un
miglioramento lento ma progressivo e continuo. Infatti, la mortalità per cancro in
Italia è scesa di cinque punti percentuali tra l’inizio e la fine degli anni Novanta
(Onconews 2001; 4: 8-9). Secondo gli esperti epidemiologi, ciò è il risultato
dell’anticipazione della diagnosi (per esempio, in tumori come quelli della
mammella, del colon-retto e del testicolo, la diagnosi precoce gioca un ruolo
fondamentale
ed
incide
notevolmente
sulla
sopravvivenza
globale)
nonchè
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
dell’estensione dell’accesso alle cure (in tutte le forme neoplastiche per le quali non
esiste ancora la possibilità di una diagnosi tempestiva il potere di modificare la
sopravvivenza dipende dalla disponibilità di terapie efficaci).
In Sardegna non sono disponibili dati che consentano di fornire le tendenze storiche
per le incidenze e mortalità, ma i dati provenienti dal Registro Tumori della
Provincia di Sassari [l’attività scientifica svolta per la stesura di tale Registro (è da
sottolineare che, nel Sud Italia, gli unici Registri Tumori attivi sono quelli di Latina,
Ragusa e, appunto, Sassari) si è basata sulla rilevazione dei casi incidenti di
neoplasie maligne relative all’area geografica del Nord Sardegna, sulla rilevazione
dei dati di mortalità dalle schede ISTAT e sul calcolo dell’incidenza x 100.000 ab.
per tutti i tumori rilevati] indicano una frequenza globale di neoplasie, causa molto
importante di mortalità, analoga a quella rilevata nel resto del Paese.
Tra tutti i tipi di tumore, il melanoma maligno cutaneo, responsabile dell’1% di tutti
i tumori, del 3% di tutte le neoplasie cutanee, e del 65% delle morti per cancro
della cute, è divenuto un problema sanitario e sociale di rilevanza sempre crescente
a causa dell’impressionante aumento di incidenza di tale patologia. L’incremento dei
casi di melanoma registrati ogni anno è superiore a quello di tutti gli altri tipi di
tumori (in Italia ogni anno si verificano circa 6.000 nuovi casi ed oltre 1500 morti).
Significativo appare il risultato epidemiologico secondo il quale il rischio relativo di
sviluppare il melanoma nel corso della vita è in continuo aumento nel corso
dell’ultimo secolo, senza significative differenze tra le diverse regioni italiane (come
evidenziato nel seguente schema):
1/75
1/105
1/150
1/250
1/600
1/1500
1935
1960
1980
1985
1991
2000
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
I fattori implicati nella cancerogenesi possono dividersi in:

estrinseci, che includono sia fattori propriamente ambientali (agenti fisici,
chimici e biologici ad attività cancerogena o co-cancerogena) sia fattori collegati
allo stile di vita ed al tipo di alimentazione;

intrinseci, che includono sia fattori genetici specifici (alterazioni a carico dei
geni coivolti nell’insorgenza e nella progressione neoplastica) sia fattori
cosiddetti costituzionali (stato immunitario, equilibrio endocrino, efficienza dei
sistemi di detossificazione, ecc).
I fattori ambientali interagiscono con quelli intrinseci con il risultato che un tumore
può essere indotto da fattori diversi e uno stesso fattore può provocare tumori
diversi. Come accennato, i fattori intrinseci includono sia mutazioni a carico di
specifici geni di suscettibilità sia più comuni polimorfismi genetici a carico di geni
coinvolti nel metabolismo di sostanze chimiche endogene ed esogene e/o nei
processi di detossificazione ed escrezione di diversi metaboliti (capaci di influenzare
notevolmente la risposta individuale all’esposizione ai fattori ambientali). E’ stato
dimostrato che individui con varianti genetiche di particolari geni del metabolismo
ossidativo presentano un maggior rischio di sviluppare tumori (soprattutto,
carcinomi del polmone e della vescica). Infine, alterazioni del sistema immunitario,
coesistenza di altre malattie debilitanti e deficit nutrizionali (per esempio, riduzione
dell’apporto degli antiossidanti nella dieta) sono i principali fattori acquisiti che
aumentano la suscettibilità ai carcinogeni ambientali (l’interazione tra fattori
genetici
predisponenti
e
fattori
ambientali,
intesi
come
fattori
estrinseci
all’individuo, è indicata dagli anglosassoni come gene-environment interaction ed è
ritenuta critica nello sviluppo di tutte le malattie complesse o multifattoriali).
La persistenza di uno stimolo cancerogeno, in particolari condizioni (presenza di
agenti co-cancerogeni e/o di una maggiore sensibilità individuale a quello stimolo),
può provocare un'alterazione della normale fisiologia della cellula per interazione
del complesso cancerogeno con il DNA stesso della cellula. La cellula a questo punto
può riparare il danno subito oppure “fissare” il danno che si traduce in una
mutazione somatica. A tal proposito bisogna sottolineare che è ormai chiaro che i
tumori sono malattie genetiche, nel senso che sono dovute ad alterazioni del DNA.
In genere, i tumori sono il risultato di mutazioni somatiche, che avvengono, cioè,
solo nel DNA delle cellule che subiscono la trasformazione maligna in uno specifico
organo o distretto anatomico. In qualche caso, le mutazioni possono verificarsi nel
DNA delle cellule della linea germinale e, pertanto, possono essere trasmesse ai
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Relazione attività scientifica 1999-2002
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figli. Questi ultimi presentano, quindi, una mutazione germinale a carico di
particolari categorie di geni in ogni cellula del loro corpo e sono maggiormente
predisposti allo sviluppo di particolari neoplasie.
Sulla base delle conoscenze attuali, solo una minima frazione di tumori presenta
una distribuzione familiare con trasmissione ereditaria delle mutazioni germinali di
tipo monofattoriale (tumori e sindromi tumorali ereditarie propriamente dette). Un
esempio in tal senso è fornito dal carcinoma del colon-retto, la cui distribuzione
percentuale delle diverse forme della malattia è riportata nel seguente schema:
FAP 1%
HNPCC 5%
FH
15-20%
Sporadic 75%
FAP, familial adenomatous polyposis; HNPCC, hereditary nonpolyposis colorectal cancer; FH,
family history (presence of multiple affected members in the family)
da Winawer, J Clin Oncol. 2001; 19 (suppl): 6s-12s
Come per il carcinoma del colon-retto, la maggior parte dei tumori umani, pur
classificato come sporadico, si adatta ad uno schema multifattoriale con effetto
soglia: ipotizza, cioè, un accumulo di contributi diversi, genetici (mediante un
processo a più stadi dovuto a un succedersi di cambiamenti genetici nella
popolazione di cellule che evolve verso il tumore) ed ambientali (comprende anche
il tipo di alimentazione e lo stile di vita). Un modello di cancerogenesi progressiva,
con acquisizione di nuove mutazioni genetiche partendo dal tessuto normale fino ad
arrivare alla lesione benigna e, successivamente, a quella primitiva maligna, è stata
infatti proposta per spiegare la patogenesi di quasi tutte le neoplasie. La
tumorigenesi è stata così associata ad alterazioni sequenziali a carico di specifiche
regioni cromosomiche dove i recenti progressi della genomica hanno consentito di
mappare e caratterizzare un buon numero di geni.
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Qui di seguito è riportato uno schema di trasformazione e progressione maligna
relativo alla sequenza adenoma-carcinoma a livello colorettale (inclusi i geni e le
alterazioni genetiche coinvolte nelle varie fasi della tumorigenesi).
Lo studio e l’analisi della storia clinica per tumori in ogni singola famiglia diventa
fondamentale per almeno due motivi:
a) definire il rischio di ricorrenza di particolari tumori tra i diversi membri della
famiglia (favorendo l’attuazione di specifici programmi di prevenzione per gli
individui con un rischio maggiore rispetto a quello della popolazione generale)
b) identificare nuove mutazioni germinali e nuovi geni coinvolti nel processo di
trasformazione neoplastica (aiutando a comprendere meglio l’origine e la natura
dei tumori).
Una più mirata prevenzione, che includa anche la consulenza genetica ed i
tests molecolari mirati, permetterebbe l’identificazione degli individui a
rischio e, quindi, la diagnosi ed il trattamento precoce della malattia, con
notevole riduzione degli indici di mortalità per tumore.
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Relazione attività scientifica 1999-2002
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PRESUPPOSTI
DELL’ATTIVITÀ SCIENTIFICA SVILUPPATA DAL GRUPPO DI
RICERCA
In questi ultimi anni, è stato costituito un gruppo di ricerca multidisciplinare che
vede la stretta collaborazione di diverse istituzioni (C.N.R., Università, A.S.L.,
I.R.C.C.S.) volto a focalizzare la propria attenzione sull’analisi genetico-molecolare
delle neoplasie. In particolare, attraverso una sistematica integrazione delle diverse
competenze ed “expertises”, ci si propone di identificare quei fattori di rischio (con
preminente riferimento alla componente genetica) coinvolti nella suscettibilità ai
tumori, sia più comuni, come il carcinoma della mammella, del colon-retto e
dell'endometrio (il rischio di sviluppare uno di questi tumori nel corso della vita è
molto alto nei paesi occidentali), che meno frequenti, come il melanoma maligno
(divenuto, come detto precedentemente, un problema sanitario e sociale notevole
per l’impressionante aumento di incidenza negli ultimi anni soprattutto tra gli
individui giovani, andando ad incidere in maniera negativa sulle potenzialità di una
fascia importante del tessuto sociale).
Allo scopo di meglio caratterizzare le alterazioni genetiche coinvolte nei diversi
processi di cancerogenesi, si è ritenuto di attuare in maniera capillare l’analisi
genetica sui pazienti neoplastici ed sulle relative famiglie, allo scopo di selezionare
sottogruppi di casi familiari con particolare predispozione a specifiche forme
neoplastiche. In quest’ottica, ci si propone di studiare soprattutto le famiglie con
elevata ricorrenza di tumori della Sardegna, caratterizzata da una comunità umana
di dimensione relativamente piccola rimasta nel tempo isolata geograficamente. Il
presupposto, derivante da altri studi genetici condotti in precedenza, è che
insediamenti fondati da un numero limitato di individui mantenutisi isolati
contribuiscono a creare una certa omogenità genetica che è in grado di favorire e
facilitare la definizione dei fattori genetici alla base di malattie complesse e/o
multifattoriali come il cancro.
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
OBIETTIVI PERSEGUITI
-
Creazione di un database contenente tutti i casi di neoplasie maligne, con
ricostruzione delle genealogie al fine di individuare e classificare sia i casi
familiari (caratterizzati da ricorrenza nella famiglia di specifici tipi di tumore) che
quelli sporadici. Tale database include casi provenienti da:
-
Nord Sardegna, attraverso una fase di raccolta gestita dal Centro di
Osservazione Epidemiologica Multizonale dell’Azienda USL 1 di Sassari
(Responsabile di Unità: Dr. Mario Budroni), in stretta collaborazione con
l’Istituto di Anatomia Patologica dell’Università di Sassari (Responsabili di
Unità: Prof. Francesco Tanda, Dr. Antonio Cossu);
-
Altre regioni del Sud Italia (in particolare, per i casi di melanoma),
attraverso l’utilizzo di strutture assistenziali adeguate (ambulatori ed una
équipe multidisciplinare ad hoc) presso l’Istituto Nazionale per lo Studio e la
Cura dei Tumori di Napoli (Responsabili di Unità: Dr. Giuseppe Castello,
Dr. Paolo Ascierto);
-
Identificazione di mutazioni sui geni di suscettibilità per neoplasie già noti;
-
Isolamento
di
nuovi
geni
di
suscettibilità
per
neoplasie
mediante
sia
caratterizzazione molecolare di specifiche regioni a livello somatico che analisi di
linkage su famiglie a livello germinale;
-
Correlazione dei dati molecolari ottenuti al sottotipo istologico, tumor grading,
stadio clinico-patologico della neoplasia;
-
Valutazione con metodiche immunoistologiche della presenza o assenza nelle
cellule neoplastiche dei prodotti di espressione dei geni candidati;
-
Definizione delle alterazioni molecolari correlate alla diagnosi e prognosi.
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
FASI DELLA RICERCA
Arruolamento dei pazienti e segnalazione dei casi.
Allo scopo di attuare una corretta anamnesi familiare per l'identificazione delle
famiglie significative per ricorrenza neoplastica, è stato predisposto ed utilizzato un
apposito questionario, previa acquisizione del consenso informato da parte del
paziente e dei familiari arruolati, resi edotti sulle finalità dello studio e sull’iter delle
indagini di laboratorio che venivano eseguite. Questa fase di raccolta della casistica
e di identificazione delle famiglie significative per neoplasie maligne nonchè la
ricostruzione degli alberi genealogici dei pazienti individuati come utili per lo studio
è stata coordinata dall’Istituto di Anatomia Patologica dell’Università di
Sassari.
In particolare, l’attività scientifica svolta durante tale periodo si è basata sulla
rilevazione dei casi incidenti di neoplasie maligne relative all’area geografica del
Nord Sardegna, sulla rilevazione dei dati di mortalità dalle schede ISTAT e sul
calcolo dell’incidenza x 100.000 ab. per tutti i tumori rilevati. I criteri di raccolta
sono stati quelli universalmente utilizzati negli studi epidemiologici e sono stati
rilevati i tumori maligni di qualunque organo e apparato, compresi quelli del
sistema emopoietico e della cute. Le variabili che vengono annotate sono: A.S.L. di
appartenenza; cognome e nome; luogo e data di nascita; stato civile e sesso;
residenza e indirizzo; professione; medico curante; fonte di segnalazione e
struttura sanitaria di cura; sede del tumore; familiarità per neoplasie; modalità di
diagnosi; diagnosi; grading istologico; estensione malattia; trattamento primario;
causa, luogo, data decesso.
La raccolta dei casi di tumore è in parte attiva, in parte passiva. La raccolta attiva
consiste in una ricerca effettuata presso tutti gli Ospedali della provincia,
ambulatori oncologici e di endoscopia; strutture di diagnostica strumentale; uffici
amministrativi delle A.S.L.. Da tali elenchi vengono identificati i casi certi o sospetti
di tumore e per i casi arruolati si procede alla compilazione della scheda cartacea.
Tali schede, codificate, vengono numerate progressivamente al momento della
registrazione in computer e archiviate in appositi contenitori. La rilevazione dei
suddetti dati si è svolta in tutte le strutture assistenziali di tipo oncologico presenti
nell’intera provincia di Sassari, ed è stata coordinata dal Centro di Osservazione
Epidemiologica Multizonale dell’Azienda Unità Sanitari Locale n.1 di
Sassari.
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Per il melanoma, la raccolta della casistica è stata assicurata dall’esistenza, presso
l’Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori di Napoli,
dell’Osservatorio per lo studio e la sorveglianza sui tumori della cute e lesioni a
rischio, con particolare riferimento al melanoma (approvato con deliberazione della
Giunta della Regione Campania).
Tale équipe medica, che confluisce nel “Melanoma Cooperative Group (M.C.G.)”, si
avvale delle più avanzate tecnologie diagnostico-terapeutiche; vengono effettuate
visite di screening avvalendosi della microscopia in epiluminescenza-dermatoscopia,
per facilitare la diagnosi precoce delle lesioni a rischio di trasformazione maligna.
Inoltre, il gruppo si contraddistingue sia per l’elevato numero di pazienti con
melanoma che afferiscono alla struttura (attualmente il gruppo M.C.G. ha in followup circa 700 pazienti) sia per il ruolo di centro di riferimento nazionale per tale
patologia.
La casistica di melanoma del gruppo M.C.G. (nel periodo di attività in oggetto sono
stati individuati 33 casi di melanoma con ricorrenza familiare) è riportata nello
schema che segue:
Centro di Riferimento per i Tumori della Cute
S e rv iz io d i Im m u n o lo g ia
- D ia g n o s i is to lo g ic h e d i m e la n o m a c u ta n e o 1 9 9 6 -2 0 0 0 -
S ta d io IA
1 9 ,3 3 %
S ta d io IB
2 4 ,6 5 %
S ta d io IIA
S ta d io IIB
6 ,4 4 %
S ta d io III
3 ,6 4 %
S ta d io IV
4 5 ,1 0 %
0 ,8 4 %
La suddivisione in stadi
di malattia è in accordo alla classificazione dell’ American Joint
Committee on Cancer (AJCC)
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Preparazione ed analisi del materiale biologico
I pazienti, dopo previa acquisizione del consenso informato, sono stati sottoposti a
prelievo di circa dieci millilitri di sangue periferico. In seguito, si è proceduto
all’isolamento della porzione cellulare del sangue, e quindi alla estrazione di DNA
(per l’analisi mutazionale dei geni interessati nonchè per le successive analisi di
linkage) e, in alcuni casi, anche di RNA (per l’analisi dei prodotti trascrizionali).
Tutti i campioni ottenuti sono stati conservati (in maniera anonima e codificata, a
tutela della privacy) sì da costituire una genoteca di DNA/RNA, per tutti i possibili
studi presenti e futuri. Ogni campione è infatti corredato di scheda con tutti i dati
necessari alle successive correlazioni clinico-patologiche. Inoltre, è stato isolato sia
DNA che RNA da sezioni di tessuto normale e tumorale incluse in paraffina.
Per l’analisi di DNA ed RNA dei singoli pazienti sono state impiegate tecniche basate
sulla PCR (Polymerase Chain Reaction) e RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) in
tutte le diverse varianti applicabili. A tale scopo si è resa necessaria la
individuazione delle specifiche sequenze nucleotidiche da utilizzare come primer
d’innesco per la reazione di amplificazione ciclica. Differenti devono essere i criteri
di scelta per la costruzione di oligonucleotidi per l’analisi di DNA ed RNA. Mentre in
entrambi
i
casi
è
opportuno
che
i
prodotti
di
amplificazione
non
siano
eccessivamente grandi (200-300 bp) così da garantire una buona risoluzione di
analisi, nel caso dell’analisi del trascritto, e quindi dell’RNA, è necessario scegliere
oligonucleotidi tali da poter essere certi che l’amplificato risultante provenga da uno
stampo di RNA (trascritto) e non di DNA (genomico). A tale scopo è opportuno che i
due primer di una coppia non siano localizzati sullo stesso esone (la presenza di
introni non permette di ottenere un prodotto di amplificazione sul DNA genomico).
Analisi mutazionale mediante DHPLC e sequenziamento automatico
Abbiamo iniziato l’analisi dei geni candidati dimostrati coinvolti nella tumorigenesi,
le cui strutture genomiche e sequenze nucleotidiche sono ampiamente conosciute.
Per l’analisi di DNA ed RNA dei soggetti partecipanti allo studio sono utilizzate le
tecniche di PCR ed RT-PCR. In ogni serie di amplificazioni ai campioni in esame
sono stati affiancati alcuni DNA o RNA di controllo, provenienti da individui sani. Gli
amplificati così ottenuti sono analizzati mediante DHPLC (Denaturing HighPerformance Liquid
Chromatography)
per la
ricerca di
mutazioni
nei
geni
considerati, prima di confermare le eventuali mutazioni o polimorfismi mediante
sequenziamento diretto.
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Qui di seguito sono rappresentati il profilo al DHPLC (A) ed la sequenza nucleotidica
(B) di una variante genica, da noi identificata su un prodotto di PCR.
A
Mutate
d
Normal
control
B
Le frecce indicano in (A), il picco anomalo nel DNA del paziente; e in (B), la corrispondente
alterazione nucleotidica in eterozigosi.
La tecnica basata sull’utilizzo del DHPLC presenta il vantaggio, rispetto alle altre
metodiche impiegate (SSCP, DGGE, ecc.), di sensibilizzare e migliorare la procedura
di screening dei campioni di DNA genomico. Tale metodica è una particolare
evoluzione della ben nota tecnica di separazione mediante HPLC. Si tratta di un
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
sistema molto innovativo costituito da una particolare matrice per cromatografia
liquida ad alta capacità di risoluzione costituita da co-polimeri alchilati, non porosi,
di particelle di stirene-divinilbenzene. L’alta capacità di risoluzione della matrice
permette di separare non solo frammenti che differiscono in lunghezza, ma anche
frammenti di lunghezza identica che differiscono nella struttura secondaria come
conseguenza
di
una
destabilizzazione
dell’-elica
conseguente
al
cattivo
appaiamento anche di una sola base. Tali molecole, note come heteroduplex, sono,
ad esempio, il risultato della ri-naturazione tra singole eliche di alleli diversi di uno
stesso gene. L’apparecchio è inoltre corredato da un software specifico per l’analisi
e la rappresentazione grafica dei picchi di eluizione.
In particolare, il gene in esame viene amplificato mediante PCR in un numero di
frammenti corrispondente al numero di esoni e delle regioni di splicing o di controllo
(promotore, ecc.) dello stesso. Mediante opportune condizioni si favorisce la
formazione di eventuali heteroduplex a seguito di denaturazione e rinaturazione,
prima di caricare i campioni sulla colonna. La temperatura della colonna può essere
variata in modo da ottenere le migliori condizioni di separazione tra omo ed
heteroduplex. I frammenti heteroduplex individuati dal profilo di eluizione sono
facilmente recuperati e direttamente sequenziati per la definitiva caratterizzazione
dell’alterazione genetica (mutazione o polimorfismo). L’analisi del campione con
questo sistema implica un tempo di 5-10 minuti. Al momento sono state messe a
punto le migliori condizioni sperimentali per l’analisi dei campioni di DNA genomico.
Tutti i prodotti di amplificazione con alterazione del profilo cromatografico, rispetto
al campione normale di controllo, sono sottoposti a sequenziamento nucleotidico
diretto su sequenziatore automatico.
In molte delle analisi molecolari a livello somatico, ci si è soffermati su due
fondamentali eventi genetici connessi alla trasformazione neoplastica: la perdita di
eterozigosità e l’instabilità dei microsatelliti. La perdita di eterozigosità (LOH) è
indice di perdita di materiale genomico a livello di uno dei due alleli cromosomici;
l’instabilità dei microsatelliti (MSI) riflette un’alterazione dei sistemi di riparazione
del DNA con accumulo di errori di replicazione. Il verificarsi di uno o entrambi tali
meccanismi è indicativo di una drammatica alterazione dei meccanismi di
autocontrollo della cellula.
I due eventi possono essere valutati mediante l’uso di marcatori polimorfici, ovvero
piccole regioni di DNA altamente ripetuto che presentano una così ampia variabilità
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Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
nell’ambito della popolazione da garantire un’alta frequenza di eterozigoti per quel
determinato locus nella popolazione. Il DNA ottenuto sia da tessuto tumorale che
da tessuto sano dello stesso paziente viene amplificato mediante PCR con primer
specifici per alcuni marcatori polimorfici; una differenza nel pattern elettroforetico
dei campioni provenienti dai due tessuti (dovuto ad inserzioni o delezioni delle unità
nucleotidiche che caratterizzano questi marcatori polimorfici, con conseguente
alterazioni della loro lunghezza/grandezza) permette di evidenziare la LOH o la MSI.
Qui di seguito sono riportati due esempi di tali alterazioni:
MSI
170
175
Normale
Tumore
180
185
LOH
190
195
Normale
Tumore
16
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
GENETICA DEI TUMORI: RISULTATI OTTENUTI DAL GRUPPO
Il nostro gruppo di ricerca ha approfondito diversi aspetti dei meccanismi geneticomolecolari alla base di alcuni tipi di neoplasie (carcinoma della mammella,
carcinoma dell’endometrio, carcinoma del colonretto, melanoma maligno).
Per il carcinoma della mammella, che rappresenta la neoplasia più frequente nel
sesso femminile, è oramai chiaro che un fattore di rischio importante nella sua
patogenesi è la familiarità: figlie o sorelle di pazienti con carcinoma mammario
hanno rischio maggiore di sviluppare questo tumore rispetto alla normale
popolazione femminile della stessa età. La costruzione di grandi alberi genealogici
in famiglie sarde ci ha permesso di applicare un approccio per identity-by-descent
(IBD) nello studio di tali patologie complesse. In pratica questa metodologia si basa
sulla ricostruzione di cromosomi ancestrali associati a marcatori genetici che si
trovano in vicinanza del locus/gene predisponente alla patologia in esame.
Nel corso di una prima fase, sono state analizzate poche famiglie con ricorrenza di
questa neoplasia (apparentemente non correlate ed originarie del Nord Sardegna).
Mediante IBD, è stato evidenziato un aplotipo comune tra individui affetti nella
regione del gene BRCA2. Dal sequenziamento diretto delle porzioni codificanti del
gene BRCA2 degli individui affetti, è stata identificata una mutazione germinale con
effetto fondatore, responsabile anche di altri tipi di tumore (in particolare,
carcinoma della prostata e della vescica).
Successivamente, abbiamo esteso lo studio ad una serie più ampia di famiglie del
Nord Sardegna in cui l’analisi genetica dell’albero genealogico faceva ritenere
potesse essere presente una predisposizione ereditaria al cancro della mammella.
Utilizzando le metodiche di screening precedentemente descritte, è stata cosi
evidenziata la presenza di mutazione germinali sia su BRCA1 che BRCA2. Nella
seguente tabella sono riportate le tre mutazioni germinali identificate nelle famiglie
con ricorrenza di carcinoma mammario del Nord Sardegna:
Famiglie con
ca. mammario
(47 totali)
1 (2.1%)
Gene-Esone
Nucleotide
Codone
BRCA1-Esone 11
1714 A>T
6 (12.8%)
BRCA2-Esone 20
8765delAG
1 (2.1%)
BRCA2-Esone 27
10462 A>G
Lys505Term
Frameshift 2845,
2867Term
Ile3412Val
17
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Qui di seguito è invece riportato un interessante pedigree (identificato nella
popolazione del Nord Sardegna, nell’ambito di questo progetto) relativo a due
pazienti con la mutazione del gene BRCA2 con effetto fondatore, che originano dallo
stesso
piccolo
paese
(Thiesi)
e
presentano
antenati
comuni
nel
1700
(appartenendo, quindi, alla stessa estesa famiglia):
I:1
II:1
III:1
IV:1
IV:2
V:1
VI:1
III:2
V:2
VI:2
45
II:2
III:3
III:4
IV:3
V:3
VI:3
II:3
III:5
IV:4
V:4
79
II:6
III:7
IV:6
V:6
VI:5
II:5
III:6
IV:5
V:5
76
VI:4
II:4
I:2
II:7
III:8
II:8
III:9
II:9
III:10
III:11
IV:7
V:7
VI:7
75
III:12
IV:8
V:8
VI:6
45
II:10
VI:8
V:9
VI:9
V:10
VI:10
78
V:11
VI:11
VI:12
69
II:11
III:13
IV:9
V:12
V:13
VI:13
59
VI:14
II:12
III:14
III:15
IV:10
V:14
VI:15
IV:11
V:15
V:16
VI:16
VII:1
44
FAM.48
Per il carcinoma dell’endometrio, i dati citogenetici suggeriscono la presenza di
alcune ricorrenti alterazioni cromosomiche: riarrangiamenti del cromosoma 1,
specialmente trisomie e tetrasomie 1q, trisomie del cromosoma 10 e, più
sporadicamente, trisomie dei cromosomi 2, 7, e 12. In particolare, i cromosomi 1 e
10 sono risultati coinvolti nella patogenesi del carcinoma dell’endometrio, come
confermato
anche
da
analisi
di
ibridazione
in
situ
(Fluorescence
In
III:16
Situ
Hybridization, FISH) condotte in questi ultimi anni dal nostro gruppo.
Recenti studi molecolari che valutano la perdita di eterozigosi (perdita di materiale
genetico su uno dei due cromosomi omologhi) nel DNA tumorale rispetto al
controllo normale, hanno dimostrato delezioni alleliche sul cromosoma 10q25-q26
nel 40% dei tumori dell’endometrio esaminati, suggerendo la presenza in queste
18
VI:17
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
regioni di geni oncosoppressori. In collaborazione con l'Istituto di Anatomia
Patologica dell'Università di Sassari abbiamo intrapreso uno studio su casi sporadici
di carcinoma dell'endometrio al fine di individuare eventuali geni presenti in questa
regione e coinvolti in questa neoplasia.
L’analisi molecolare è stata condotta su DNA estratto da tessuto tumorale e
corrispondente tessuto sano inclusi in paraffina mediante PCR con marcatori
polimorfici localizzati nella regione 10q25-q26, ed ha permesso di individuare tre
sottogruppi di pazienti con carcinoma dell’endometrio: uno, senza alterazioni a
carico della regione; il secondo, con delezione più o meno estesa della regione
intorno al locus D10S190; ed il terzo, con prevalenza di instabilità microsatellitare.
Il gruppo di pazienti con la delezione della regione 10q25-26 è stata ulteriormente
analizzata mediante incremento della densità dei marcatori polimorfici. Abbiamo
così ristretto la regione minima di delezione allelica (o LOH) ad un frammento
genomico inferiore a 200 kilobasi, che include il locus candidato D10S190 (tra i
marcatori D10S1236 e WIAF3299, come evidenziato nel sottostante schema):
D10S610
D10S1236
D10S190
D10S542
WIAF3299
TEL
CEN
170 kb
0.5 cM
0.6 cM
Abbiamo quindi intrapreso la ricerca di sequenze trascritte localizzate in tale
ristretta
regione
genomica,
mediante
analisi
bioinformatica
della
sequenza
nucleotidica compresa tra i suddetti marcatori intorno al locus D10S190. Allo stato
attuale due trascritti candidati sono stati identificati (come qui di seguito indicato):
Gene 2
D10S12
36
I
V
I
V
II
I
I
I
I
I
I
D10S19
0
II
I
40 kb
WIAF329
9
I
V
130 kb
Gene 1
19
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
I
casi
con
instabilità
microsatellitare,
probabilmente
causati
da
errori
nel
meccanismo di replicazione del DNA (mismatch repair), sono stati sottoposti a
screening molecolare per identificare variazioni di sequenza nei geni candidati che
controllano il mismatch repair (geni MMR). Sono state cosi identificate variazioni
geniche germinali su MLH1 e MSH2, come qui di seguito riportato:
Tipo
Gene-Esone
Nucleotide
Codone
Mutazione
Polimorfismo
MLH1-Exon 17
MLH1-Exon 8
1963 A>G
655 A>G
Ile655Val
Ile219Val
Polimorfismo
Polimorfismo
Polimorfismo
MLH1-Exon 15
MSH2-Exon 1
MSH2-Exon 10
IVS14-19 A>G
IVS1+8 C>G
IVS9-9 T>A
-
Polimorfismo
MSH2-Exon 10
IVS10+12 A>G
-
Per il carcinoma del colon-retto, ci siamo prefissati di meglio indagare il ruolo
dell’instabiltà dei microsatelliti (MSI) in tale patologia e dei principali geni MMR,
MLH1 e MSH2, nella determinazione del fenotipo instabile (MSI+), mediante analisi
condotte su un’ampia casistica includente sia casi sporadici che casi familiari.
L’inattivazione dei geni MMR è stata dimostrata essere dovuta a mutazioni
somatiche o meccanismi epigenetici di gene silencing (in particolare, la metilazione
del promotore) di entrambi gli alleli genici con conseguente perdita completa della
specifica funzione MMR e sviluppo di un tumore caratterizzato da fenotipo MSI+.
Quest’ultima potrebbe essere considerata una manifestazione secondaria che
tuttavia potrebbere essere correlata alla presenza di ulteriori alterazioni a carico di
specifici
geni
o
regioni
cromosomiche
bersaglio
coinvolte
nei
processi
di
tumorigenesi. L' interesse per il fenomeno dell’instabilità genetica, è aumentato
notevolmente dal fatto che esso non risulta essere limitato solo ai pazienti con una
storia familiare positiva per tumori del colon-retto, ma è stato riscontrato in una
percentuale variabile anche nei casi di carcinoma colorettale di tipo sporadico,
nonché in altri tipi di tumore a sede extracolica (per esempio, come abbiamo già
dimostrato, nel carcinoma dell’endometrio).
Abbiamo quindi cercato di mettere in evidenza le correlazioni esistenti tra la
presenza del fenotipo MSI+ con diversi parametri clinico-patologici nei pazienti
affetti dal carcinoma. Non è stata osservata una correlazione tra lo stadio della
malattia, classificata secondo Dukes, e l’instabilità dei microsatelliti. Questo sta ad
indicare che l’instabilità genetica sembra non giocare un ruolo importante nella
20
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
progressione
clinica
del
carcinoma
(dalla
fase
di
invasione
a
quella
di
metastatizzazione), quanto piuttosto nella fase di insorgenza della neoplasia.
Per definire il ruolo dei geni mutatori, MLH1 e MSH2, nell’insorgenza e nello
sviluppo del carcinoma del colon-retto sono state avviate analisi mutazionali delle
regioni codificanti di questi due geni nei casi che presentavano il fenotipo MSI+ e
ricorrenza famigliare della malattia. Tali analisi condotte su DNA germinale di
pazienti appartenenti a queste famiglie hanno evidenziato la presenza delle
seguenti mutazioni germinali:
Positive
families
34 total
(%)
1
(2.9)
1
(2.9)
1
(2.9)
3
(8.8)
2
(5.9)
1
(2.9)
1
(2.9)
1
(2.9)
2
(5.9)
GeneExon
Nucleotide Codon
Base Amino Acid
Change
Change
3AA deletion
Mutation
Designation
small deletion,
shortened protein
971del9
missense
Lys618Arg
MLH1-11
971_979
324
MLH1-16
1851
618
MLH1-19
2245
749
T>C
LEU to PRO
missense
Leu749Pro
MSH2-1
34_35
12
insG
Stop 80
frameshift,
truncated protein
34insG
MSH2-1
38
13
G>T
SER to ILE
missense
Ser13Ile
MSH2-6
965
322
G>A
GLY to ASP
missense
Gly322Asp
MSH2-6
1024
342
G>A
VAL to ILE
missense
Val342Ile
MSH2-6
1076
-
G>T
-
594
insCT
Stop 599
MSH2-12 1781_1782
del9
Mutation
Effect
AA>CG LYS to ARG
splicing site
IVS6+1G>T
alteration
frameshift,
1781insCT
truncated protein
Per il melanoma maligno, si ritiene che la trasformazione melanocitaria sia
legata all’accumulo di diverse alterazioni genetiche. Un crescente numero di
evidenze indica che: a) il melanoma può insorgere su nevi melanocitici preesistenti;
b) nevi displastici o atipici possono essere considerati lesioni preneoplastiche.
Inoltre, il rischio relativo è superiore in pazienti con storia familiare di melanoma.
I riarrangiamenti e/o le delezioni del braccio corto del cromosoma 9 (9p)
rappresentano l’evento genetico più comune nelle lesioni primitive di melanoma
cutaneo, intervenendo negli stadi iniziali della malattia. Studi molecolari ed analisi
genetiche di linkage hanno indicato la 9p21 come la regione cromosomica coinvolta
21
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
nella patogenesi del melanoma maligno. Riarrangiamenti della 9p21 potrebbero
rappresentare gli eventi “iniziatori” della trasformazione in melanoma ed essere già
presenti nelle lesioni in situ o perfino nei nevi atipici. In alternativa, difetti del gene
oncosoppressore CDKN2A, mappato nella regione 9p21 e coinvolto nella patogenesi
del melanoma familiare, potrebbero contribuire alla instaurazione del potenziale
invasivo e, successivamente, di quello metastatico. Analisi delle mappe di delezione
hanno indicato che altri geni oncosoppressori possono essere presenti nella 9p21 e
coinvolti nella trasformazione neoplastica.
Abbiamo quindi attuato uno studio per valutare il ruolo della 9p21 nell’insorgenza e
progressione del melanoma maligno, mediante PCR di microsatelliti mappati in
questa regione cromosomica ed amplificazione del DNA proveniente da tessuti
inclusi in paraffina. Sono state analizzate sia le lesioni primitive che quelle
secondarie provenienti dagli stessi pazienti ed è stata definita l’incidenza delle
diverse alterazioni genetiche (perdita di eterozigosi e/o instabilità microsatellitare)
nelle diverse fasi della progressione tumorale (dal tumore primitivo alla metastasi).
I risultati ottenuti hanno evidenziato che la percentuale di delezioni alleliche a
carico della 9p21 non varia molto fra tumori primitivi e metastasi, suggerendo che
la perdita di eterozigosi in 9p21 sia un evento precoce nello sviluppo del melanoma.
Inoltre è stata identificata una nuova regione di delezione allelica, a livello del
marcatore D9S171 (evidenziato nel sottostante schema), in cui è stata avviata la
Marker
61
70
76
90
102
82
68
79
67
12
56
15
107
65
53
71
72
73
36
21
103
105
62
55
52
80
77
ricerca di un probabile gene candidato coinvolto nella patogenesi del melanoma:
O O O
D9S162
D9S974
O
O
D9S1748
O O
O
O
O
O
D9S259
O
O
O
O


O
O
O
O 
O
O X
O O
O
X
O
X
X
O
O O O
O
O
O
O
O
O O
O O
O
O
O O O
 O O
O O
O
D9S126
D9S263
X
O

D9S171
D9S169
O
O
D9S942
O
X
X
O O
O
X
O
O O
X
O
X O
X O O
O
I marcatori sono ordinati dal più telomerico (in alto) al più centromerico (in basso). Ogni
paziente è indicato dal proprio numero nella serie. Le caselle nere indicano LOH; quelle grigie,
MSI; quelle bianche, assenza di alterazione. I segni O e X indicano omozigosi costituzionale
(casi non infirmativi per LOH) e assenza di dati, rispettivamente.
22
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Abbiamo inoltre attuato un’analisi mutazionale di tutte le sequenze codificanti e
delle regioni esone-introne dei principali geni di suscettibilità al melanoma
(CDKN2A, CDKN2B, CDK4, and Id-1) nonché della regione del promotore di
CDKN2A in famiglie del Sud Italia con ricorrenza di tale patologia. Eccetto una
minoranza di famiglie con mutazione di CDKN2A (evidenziate in rosso nella
seguente tabella), non abbiamo riscontrato alcuna mutazione negli altri geni
candidati analizzati.
Nucleotide
Codon
MM
families
(%)
110 G>C
Arg24Pro
8
0
0
1-292 G>A
-
8
0
0
CDKN2A-Exon 2
482 G>A
Ala148Thr
23
23
8
CDKN2A-Exon 3
500 C>G
8
4
8
CDKN2A-Exon 3
540 C>T
15
12
12
Gene-position
CDKN2A-Exon 1
CDKN2A-Promoter
Sporadic Healthy
MM pts controls
(%)
(%)
CDKN2A-Promoter
1-191 A>G
-
15
12
15
CDKN2A-Promoter
1-493 A>T
-
23
23
8
ID.1-EXON 1
434 A>G
Gly96Gly
15
n.t.
10
Id.1-Exon 2
IVS1-11 C>T
-
8
n.t.
10
Id.1-Exon 2
IVS1-18 T>C
-
39
n.t.
33
La frequenza delle varianti geniche è riportata per 13 famiglie con melanoma maligno (MM),
26 casi sporadici e 100 individui normali come controllo; n.t., non testato.
L’identificazione di un’alta incidenza di “linkage” alla regione 9p21 nelle famiglie con
melanoma e negative per mutazioni germinali nei geni del locus CDKN suggerisce
che altri tipi di alterazioni [genetiche (mutazioni introniche) o epigenetiche (“gene
silencing”)] potrebbero essere responsabili della predisposizione al melanoma.
Mediante analisi FISH in un gruppo di sezioni di tessuto tumorale su vetrino da
pazienti con melanoma, abbiamo inoltre confermato l’esistenza in situ di delezioni
alleliche a livello del locus D9S171 (precedentemente identificato dal sottoscritto),
suggerendo
ulteriormente
che
tale
regione
sul
cromosoma
9p21
potrebbe
contenere altri geni di suscettibilità al melanoma maligno.
23
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Qui di seguito sono riportati: (A) il risultato dell’analisi genotipica di una famiglia
con ricorrenza di melanoma, negativa per mutazioni dei geni CDKN ma associata (in
linkage) alla regione 9p21; e (B) un caso di melanoma che presenta delezione in
eterozigosi a livello del locus D9S171, come evidenziato mediante analisi FISH:
A
I:1
II:1
II:2
54
I:2
II:3
III:1
II:4
I:3
II:5
III:2
26
12 4
6 2
7 11
3 6
6 5
4 6
2 3
1 1
5 1
IV:1
12
6
7
3
6
4
2
1
5
1
7
7
5
8
2
3
1
5
II:6
II:7
52
III:3
IV:2
II:8
I:4
II:9
III:4
54
4 1
2 1
11 11
4 6
6 5
2 6
1 3
1 1
6 1
IV:3
11
7
6
6
6
4
3
3
5
1
1
11
6
5
6
3
1
5
II:10
II:11
60
III:5
49
IV:4
24
11 1
7 1
6 11
6 6
6 5
4 6
3 3
3 1
5 1
IV:5
9
2
7
3
5
3
1
3
5
12
6
7
3
6
4
2
1
1
II:12
III:6
47
12 10
6 6
7 11
3 6
6 5
4 6
2 3
1 1
5 1
IV:6
9
2
8
3
8
2
3
1
1
12
6
7
3
6
4
2
1
5
IV:7
9
2
7
3
5
3
1
3
5
10
6
11
3
5
4
3
1
1
L’età alla diagnosi è indicata per i membri affetti (in nero; con il punto centrale è un idividuo
con nevo atipico; gli altri tipi di “boxes” indicano altri tipi di tumore). Gli aplotipi condivisi a
livello della regione 9p21 sono incorniciati. I marcatori sono ordinati dal più telomerico al più
centromerico (dall’alto in basso): D9S285, D9S157, D9S162, D9S1748, D9S1846, D9S171,
D9S1679, D9S126 e D9S259 (in roso sono indicati i due marcatori inclusi nella regione dei
geni CDKN).
24
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
B
Sezioni di tessuto tumorale da paziente con melanoma dopo ibridazione in situ con sonda
specifica per il locus D9S171. La maggior parte delle cellule presenta un singolo segnale.
In collaborazione con il gruppo del dott. Mike Stratton presso il Wellcome Trust
Sanger Institute del Regno Unito, abbiamo inoltre contribuito all’identificazione di
specifiche mutazioni a carico di un nuovo gene, denominato BRAF (coinvolto nei
processi regolativi del ciclo cellulare), in circa due terzi (62%) dei casi di melanoma
maligno (mutazioni di questo gene sono invece presenti in misura inferiore in altri
tipi di tumore, come mostrato nella seguente tabella):
BRAF Mutations Cancer Cell Lines
Primary Tumours
Nucleotide AA
MM CRC Glioma Sarcoma Other MM
CRC Ovarian Other Total
G1388A G463E
1
1
G1388T G463V
1
1
G1394C G465A
1
1
G1394A G465E
1
1
G1394T G465V
1
1
G1403C G468A
2
2
G1403A G468E
1
1
G1753A E585K
1
1
T1782G F594L
1
1
G1783C G595R
1
1
C1786G L596V
1
1
T1787G L596R
1
1
T1796A
V599E
17
5
4
5
2
16
2
3
1
55
TG1796AT V599D
1
1
Total
18
7
4
5
7
18
4
5
1
69
Samples Screened 34
40
38
59
375
24
33
35
286
924
%
52.9% 17.5% 10.5% 8.5% 1.9% 75.0% 12.1% 14.3% 0.5% 7.5%
25
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Inoltre, abbiamo dimostrato che il prodotto del gene BRAF, una proteina ad attività
serina/treonina
kinasica,
possiede,
quando
mutato,
una
notevole
attività
oncogenica in vitro. Pertanto, difetti del gene BRAF anche se partecipano
all’insorgenza di più tumori, sembrano svolgere un ruolo di primaria importanza
nella patogenesi del melanoma maligno. Tutto questo ha quindi permesso di
identificare una nuova tappa nel processo ad accumulo di difetti genetici che sta
alla base della trasformazione neoplastica. Nel caso del melanoma, un probabile
nuovo fattore diagnostico nonchè nuovo bersaglio di terapia è stato così identificato
(ulteriori studi dovranno confermare o smentire queste ipotesi).
Sviluppo di nuovi marcatori molecolari come fattori prognostici nel melanoma
L’utilizzo di tecniche di biologia molecolare è stata rivolta alla valutazione
dell’estensione della malattia.
Allo scopo di definire nuovi fattori prognostici molecolari, abbiamo dimostrato che la
RT-PCR con marcatori molecolari multipli (multimarker RT-PCR) permette di rivelare
la presenza di cellule metastatiche di melanoma nel sangue periferico. In
particolare, la RT-PCR con marcatori molecolari multipli è risultata altamente
sensibile e abbastanza specifica (l’unico altro tipo di cellula tumorale identificato
mediante
tale
approccio
è
il
sarcoma
di
Kaposi)
nell’identificazione
di
micrometastasi nei pazienti con melanoma, proponendosi come un test efficace per
individuare la presenza di malattia residua e/o la progressione di melanoma
durante il follow-up. Inoltre, il tasso di positività sul sangue periferico dei pazienti
con melanoma sembra correlare allo stadio di malattia, probabilmente dovuto ad un
maggior tumor cell burden circolante. Tutte queste analisi sono state condotte su
un’ampia casistica di pazienti con melanoma a vario stadio di malattia; tutti i dati
molecolari sono stati correlati con quelli clinici (disease-free survival e overall
survival), per le valutazioni statistiche e la definizione della metodica come
marcatore di progressione tumorale.
Tuttavia, la presenza di cellule circolanti, anche se rappresenta una condizione sine
qua non per il successivo sviluppo delle metastasi, non è sempre predittiva della
reale formazione di lesioni secondarie (infatti, tutto dipende dalla capacità della
cellula metastatica di sopravvivere in circolo associata al suo potenziale invasivo e,
quindi, alla capacità di colonizzare tessuti a distanza). Allo scopo di definire un più
attendibile indice di progressione neoplastica nonché un più dettagliato criterio di
stadiazione nel melanoma, abbiamo attuato uno studio per la diagnosi delle
26
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
micrometastasi sui linfonodi regionali istologicamente negativi (come anche
confermato mediante immunoistochimica convenzionale). La presenza di cellule
occulte in tessuti inclusi in paraffina da linfonodi regionali istologicamente negativi
(vedi rappresentazione esemplificativa qui di seguito riportata) è stata dimostrata
statisticamente correlata sia allo stadio di malattia che, soprattutto, alla presenza di
recidive.
Analisi mediante RT-PCR di RNA messaggero (mRNA) in tessuti inclusi in paraffina di linfonodi
istologicamente negativi per cellule neoplastiche da un gruppo di pazienti con melanoma. I
marcatori specifici melanoma-associati (tyrosinase e MelanA/MART1) e quello di riferimento
(GAPDH) sono marcati con radioattivo ed i prodotti di PCR separati su gel di poliacrilamide.
Infine, è in corso di studio, in stretta collaborazione con altri gruppi europei, un
nuovo protocollo basato sull’utilizzo della real-time RT-PCR per l’analisi quantitativa
dei trascritti delle cellule di melanoma nel sangue periferico allo scopo di aumentare
la sensibilità e la specificità di questa metodica.
27
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
FLOW CHARTS
attività di ricerca svolta nell’ambito dello
studio genetico-molecolare di
carcinoma della mammella
carcinoma del colon-retto
carcinoma dell’endometrio
melanoma maligno
28
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Breast Cancer (BC)
Selection of BC families with multiple
affected members from Sardinia
Screening of candidate genes (BRCA1/2) in
genomic DNA by single-strand conformation
polymorphism (SSCP) and denaturing highperformance liquid chromatography (DHPLC)
Direct sequencing on an automated
sequencer of all abnormal PCR
products
Cases positive
for mutations
Cases negative
for mutations
Screening of
candidate genes in
unaffected family
members
(prevention)
Search of other
candidate loci by
genome-wide search
and linkage analysis
(pathogenesis)
29
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Colorectal Cancer (CRC)
Selection and collection of CRC
patients and their families from
Sardinia and South Italy
Familial classification:
Risk A and B (ACS)
Amsterdam Criteria (ASCO)
MSI Phenotype analisis of archival primary tumors
No microsatellite instability (MSI-)
LOH analysis of the
regions spanning
the mismatch repair
(MMR) genes
Microsatellite instability (MSI+)
Immunohistochemistry
(IHC) of tumor sections,
using antibodies against
MMR gene products
Classification of the molecular phenotype in CRC probands
MSIMSI+
LOHIHC+
Selection of
significative
families for
genome-wide
search
Correlation with clinical &
histological parameters
MSI+
LOH+
IHC-
MSI+
LOH+
IHC+
MSI+
LOHIHC-
Full mutation analysis of
the selected MMR genes
Identification of new loci for:
a) Candidate tumor suppressor genes in MSI- group
b) Candidate mismatch repair genes in MSI+ group
Methylation
studies of known
MMR genes
New somatic and
germinal mutations
Identification
of founder
mutations
30
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Endometrial Cancer (EC)
Selection and collection of
endometrial cancer
patients from Sardinia
Identification of a subset
of tumors carrying a
specific allelic loss
Definition of a minimum
consensus region of LOH
LOH analysis at the candidate
region 10q25-q26
Identification of a subset of tumors
carrying microsatellite instability (MSI+)
LOH analysis within the regions of
the mismatch repair (MMR) genes
Fluorescence in situ
hybridization (FISH)
analysis of primary tumors
for presence of aneuploidy
Correlation with clinical and
histological parameters
Immunohistochemistry (IHC) of
tumors with anti-MMR proteins
Classification of the molecular phenotype
Identification of two
candidate EST clusters
Isolation of the
candidate tumor
suppressor gene
Selection of families
for genome-wide
search
Search for new candidate
mismatch repair genes
LOHIHC+
LOHIHC-
Methylation studies
of the MMR genes
LOH+
IHC+/Mutation analysis
of the MMR genes
31
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Malignant Melanoma (MM)
Identification of
melanoma patients from
Sardinia and South Italy
Tumor Genetics: definition of
the role of the 9p21 region in:
Tumor Genetics: selection
of MM-prone families
Mutational analysis of p16, p15, and p19
Positive
Molecular Diagnosis:
development of new
prognostic factors
Identification of
micrometastases by
RT-PCR on:
Negative
Peripheral
Blood
Tumorigenesis and melanoma
progression (after analysis of 64
primary sporadic MM tumors
and their metastases)
New somatic
and germinal
mutations
Identification
of new loci by
genome-wide
search
Identification of a new
LOH region at 9p21
Correlation with clinical
and histological parameters
Search for a new
candidate gene at 9p21
New Protocols and kits
For patients’ management
Results on
patients
followed-up
at N.T.I.
of Naples
Regional
Lymph Nodes
Results on patients
after analysis of
histologicallynegative paraffinembedded tissue
samples
Cooperative work between:
MCG - IMI - EORTC
32
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
PRODUZIONE SCIENTIFICA DELLA LINEA (1999-2002)
PUBBLICAZIONI
1.
G. Palmieri, M. Strazzullo, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, A. Daponte, and G.
Castello on behalf of the Melanoma Cooperative Group. Polymerase Chain
Reaction-based detection of circulating melanoma cells as an effective marker
of tumor progression. J. Clin. Oncol. 17: 304-311, 1999.
2.
P.A. Ascierto, G. Palmieri. Adjuvant therapy of cutaneous melanoma.
Lancet 353: 328, 1999.
3.
(I.F. 8,773)
(I.F. 10,232)
Y. Feng, D.R. Hodge, G. Palmieri, D.L. Chase, D.L. Longo, and D.K. Ferris.
Association of polo-like kinase with alpha-, beta- and gamma-tubulins in a
stable complex. Biochem. J. 339: 435-442, 1999.
4.
(I.F. 4,280)
M. Pisano, I. Persico, G. Casu, G. Palomba, G. Palmieri, A. Cossu, F. Tanda, and
M. Pirastu. BRCA2 small insertion in breast cancer.
Hum. Genet. 104: 289, 1999.
5.
(I.F. 3,422)
M. Strazzullo, G. Palmieri, S.M.R. Satriano: Dal danno genetico al tumore; in G.
Castello (Ed.): Esposizione ad agenti genotossici; Valutazione del rischio verso
un approccio globale alla tutela della salute. Edizioni Scientifiche Cuzzolin,
Napoli: 253-272, 1999.
6.
G. Palmieri. Analisi genetiche in individui a rischio: un nuovo approccio per la
prevenzione dei tumori. Obiettivo Vita Anno 3 (1): 2, 1999
7.
M. Pisano, A. Cossu, I. Persico, G. Palmieri, A. Angius, G. Casu, G. Palomba,
M.G. Sarobba, P.C. Rocca, M.F. Dedola, N. Olmeo, A. Pasca, M. Budroni, V.
Marras, A. Pisano, A. Farris, G. Massarelli, M. Pirastu, and F. Tanda. A novel
BRCA2 mutation with founder effect in Sardinia detected by identity by descent
method. Br. J. Cancer 82: 553-559, 2000.
8.
(I.F. 3,489)
P.A. Ascierto, G. Palmieri, E. Celentano, R. Parasole, C. Caracò, A. Daponte,
M.G. Chiofalo, M.T. Melucci, N. Mozzillo, R.A. Satriano, G. Castello and the
Melanoma Cooperative Group. Sensitivity and specificity of epiluminescence
microscopy: evaluation on a sample of 2,731 excised cutaneous pigmented
lesions. Br. J. Dermatol. 142: 893-898, 2000.
9.
(I.F. 2,214)
G. Palmieri, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, M. Strazzullo, G. Apice, and G.
Castello. Circulating melanoma-associated markers detected by RT-PCR in
patients with classic Kaposi’s sarcoma.
Ann. Oncol. 11: 635-636, 2000.
(I.F. 3,249)
10. G. Palmieri, V. de Franciscis, A. Casamassimi, G. Romano, A. Torino, P.
Pingitore, D. Califano, G. Santelli, A. Eva, G. Vecchio, M. D'Urso, and A.
Ciccodicola. Human dbl proto-oncogene in 85 kb of Xq26, and determination of
the transcription initiation site. Gene 253: 107-115, 2000.
(I.F. 2,461)
33
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
11. P.A. Ascierto, A.Daponte, R.Parasole, F.Perrone C.Caracò, M. Melucci, G.
Palmieri, M. Napolitano, N. Mozzillo, and G. Castello. Intermediate-dose
recombinant interferon-alpha as second line treatment of recurrent cutaneous
melanoma in patients pre-treated with low-dose interferon.
Cancer 89: 1490-1494, 2000.
(I.F. 3,611)
12. G. Palmieri, A. Manca, A. Cossu, G. Ruiu, M. Pisano, P.L. Cherchi, S. Dessole,
A. Pintus, G. Massarelli, F. Tanda, and M. Pirastu. Microsatellite analysis at
10q25-q26
in
Sardinian
patients
with
sporadic
endometrial
carcinoma.
Identification of specific patterns of genetic alteration.
Cancer 89: 1773-1782, 2000.
(I.F. 3,611)
13. G. Palmieri, A. Cossu, P.A. Ascierto, G. Botti, M. Strazzullo, A. Lissia, M.
Colombino, M. Casula, C. Floris, F. Tanda, M. Pirastu, and G. Castello for the
Melanoma Cooperative Group. Definition of the role of chromosome 9p21 in
sporadic melanoma through genetic analysis of primary tumors and their
metastases. Br. J. Cancer 83: 1707-1714, 2000.
(I.F. 3,489)
14. A. Daponte, P.A. Ascierto, A. Gravina, M.T. Melucci, G. Palmieri, P. Comella, R.
Cellerino, M. De Lena, G. Marini, and G. Comella. Cisplatin, dacarbazine, and
fotemustine plus interferon alpha in patients with advanced malignant
melanoma. A multicenter phase II study of the Southern Italy Cooperative
Oncology Group. Cancer 89: 2630-2636, 2000.
(I.F. 3,611)
15. P.A. Ascierto, N. Mozzillo, C. Caracò, R. Parasole, G. Palmieri, M.T. Melucci, G.
Botti, and G. Castello. Epithelioid cell-type melanoma as a prognostic factor of
poor response to immunological treatment.
Ann. Oncol. 11: 1504, 2000.
(I.F. 3,249)
16. G. Palmieri, M. Pirastu, M. Strazzullo, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, M.L. Motti,
G. Botti, N. Mozzillo, G. Castello, A. Cossu, A Lissia, F. Tanda. Clinical
significance of PCR-positive mRNA markers in peripheral blood and regional
nodes of malignant melanoma patients. Melanoma Cooperative Group.
Recent Results Cancer Res. 158: 200-203, 2001.
(I.F. 4,182)
17. P.A. Ascierto, C. Caracò, F. Ionna, L. Pezzullo, G. Palmieri, M.T. Melucci, S.
Canzanella for the Melanoma Cooperative Group. Mobile hospital rooms to fight
melanoma. Melanoma Res. 11: 83, 2001.
(I.F. 1,862)
18. G. Palmieri, P.A. Ascierto, A. Cossu, N. Mozzillo, M. Motti, S. Satriano, G. Botti,
C. Caracò, E. Celentano, R.A. Satriano, A. Lissia, F. Tanda, M. Pirastu, and G.
Castello for the Melanoma Cooperative Group. Detection of occult melanoma
cells in paraffin-embedded histologically-negative sentinel lymph nodes using a
reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay.
J. Clin. Oncol. 19: 1437-1443, 2001.
(I.F. 8,773)
34
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
19. G. Palmieri, A. Cossu, A. Lissia, L. Leoncini, S. Lazzi, P.A. Ascierto, G. Castello,
and F. Tanda. Detection of tyrosinase mRNA in microdissected tumor tissues
from classic Kaposi’s sarcoma.
Ann. Oncol. 12: 1765-1766, 2001. (I.F. 3,249)
20. P. Baldinu, A. Cossu, A. Manca, M.P. Satta, M. Pisano, M. Casula, S. Dessole, A.
Pintus, F. Tanda, and G. Palmieri. Microsatellite instability and mutation
analysis of candidate genes in unselected Sardinian patients with endometrial
cancer.Cancer 94: 3157-3168, 2002.
(I.F. 3,611)
21. H. Davies, G.R. Bignell, C. Cox, P. Stephens, S. Edkins, S. Clegg, J. Teague, H.
Woffendin, M.J. Garnett, W. Bottomley, N. Davis, E. Dicks, R. Ewing, Y. Floyd,
K. Gray, S. Hall, R. Hawes, J. Hughes, V. Kosmidou, A. Menzies, C. Mould, A.
Parker, C. Stevens, S. Watt, S. Hooper, R. Wilson, H. Jayatilake, B.A.
Gusterson, C. Cooper, J. Shipley, D. Hargrave, K. Pritchard-Jones, N. Maitland,
G. Chenevix-Trench, G.J. Riggins, D.D. Bigner, G. Palmieri, A. Cossu, A.
Flanagan, A. Nicholson, J.W.C. Ho, S.Y. Leung, S.T. Yuen, B.L. Weber, H.F.
Seigler, T.L. Darrow, H. Paterson, R. Marais, C.J. Marshall, R. Wooster, M.R.
Stratton, and P.A. Futreal. Mutations of the BRAF gene in human cancer.
Nature 417: 949-954, 2002.
(I.F. 25,814)
22. R. Muresu, M.C. Sini, A. Cossu, S. Tore, P. Baldinu, A. Manca, M. Pisano, C.
Loddo, S. Dessole, A. Pintus, F. Tanda, and G. Palmieri. Chromosomal
abnormalities and microsatellite instability in sporadic endometrial cancer.
Eur. J. Cancer 38: 1802-1809, 2002.
(I.F. 2,725)
23. M. Colombino, A. Cossu, A. Manca, M.F. Dedola, M. Giordano, F. Scintu, A.
Curci, A. Avallone, G. Comella, M. Amoruso, A. Margari, G.M. Bonomo, M.
Castriota, F. Tanda, and G. Palmieri. Prevalence and prognostic role of
microsatellite instability in patients with rectal carcinoma.
Ann. Oncol. 13: 1447-1453, 2002
(I.F. 3,249)
24. R. Cesaraccio, O. Sechi, D.R. Pirino, D. Piras, A. Sechi, M. Oggiano, G. Mameli,
M. Budroni, A. Cossu, A. Manca, P. Cossu Rocca, G. Massarelli, F. Tanda, G.
Palmieri. Incidenza dei tumori negli anni 1993-97 in Provincia di Sassari. In:
“Registro Tumori della Provincia di Sassari. I tumori in Sardegna negli anni
novanta”. M. Budroni & F. Tanda (eds). Tipogr. Moderna, Sassari: 9-22, 2002
25. G. Palmieri, G. Palomba, A. Cossu, M. Pisano, M.F. Dedola, M.G. Sarobba, A.
Farris, N. Olmeo, A. Contu, A. Pasca, M.P. Satta, I. Persico, A.A. Carboni, P.
Cossu-Rocca, M. Contini, J. Mangion, M.R. Stratton, and F. Tanda. BRCA1 and
BRCA2 germline mutations in Sardinian breast cancer families and their
implications for genetic counseling.
Ann. Oncol. 13: 1899-1907, 2002
(I.F. 3,249)
26. G. Palmieri, P.A. Ascierto, F. Perrone, S.M.R. Satriano, A. Ottaiano, A. Daponte,
M. Napolitano, C. Caracò, N. Mozzillo, M.T. Melucci, A. Cossu, F. Tanda, C.
Gallo, R.A. Satriano, and G. Castello on behalf of the Melanoma Cooperative
35
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Group. Prognostic value of circulating melanoma cells detected by reverse
transcriptase-polymerase chain reaction.
J. Clin. Oncol. 20: in press.
(I.F. 8,773)
27. G. Palmieri, P.A. Ascierto, A. Cossu, M. Colombino, M. Casula, G. Botti, A.
Lissia, F. Tanda, and G. Castello. Assessment of genetic instability in
melanocytic skin lesions through microsatellite analysis of benign nevi,
dysplastic
nevi,
and
primary
Melanoma Res. : in press.
melanomas
along
with
their
metastases.
(I.F. 1,862)
PUBBLICAZIONI ATTI DI CONGRESSI
1. M. Pisano, A. Cossu, I. Persico, G. Palmieri, A. Angius, G. Casu, G. Palomba,
M.G. Sarobba, A. Farris, G. Massarelli, F. Tanda, M. Pirastu. A founder mutation
in Sardinian breast cancer families detected by identity-by-descent method.
31th Annual Meeting of the European Society of Human Genetics, Geneve,
Switzerland, P-604. Eur. J. Hum. Genet. 7, Suppl. 1: 146, 1999.
2. G. Palmieri, M. Strazzullo, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, M. Pisano, A. Daponte,
C. Caracò, N. Mozzillo, G. Castello and the Cooperative Melanoma Group. PCRpositive mRNAs in peripheral blood of patients with malignant melanoma as an
effective tumor progression marker. Thirty-Fifth Annual Meeting of the American
Society of Clinical Oncology, Atlanta, USA, n. 2077. Proceedings of ASCO 18:
538a, 1999.
3. G. Palmieri, M. Strazzullo, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, M.L. Motti, G. Botti, A.
Cossu, A. Lissia, A. Daponte, G. Castello. The Melanoma Cooperative Group.
Definition of new tumor progression markers in malignant melanoma (MM). The
European Cancer Conference (ECCO 10), Vienna, Austria, n.1504. Eur. J. Cancer
35, Suppl. 4: S370, 1999.
4. A. Cossu, G. Palmieri, A. Manca, A. Pintus, M. Pisano, P.L. Cherchi, G. Ruiu, G.
Massarelli, F. Tanda, M. Pirastu. Molecular profile of the human chromosome
10q25-q26 in patients with endometrial cancer. 17th European Congress of
Pathology, Barcellona, O-077. Virchows Archiv. 435 (3): 185, 1999.
5. G. Palmieri, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, M.L. Motti, G. Botti, A. Cossu, F.
Tanda, N. Mozzillo, G. Castello. PCR-based analysis of patients with malignant
melanoma (MM): assessment of genetic alterations and detection of occult
metastases as tumor prognostic markers. Thirty-Sixth Annual Meeting of the
American Society of Clinical Oncology, New Orleans, USA, n. 2233. Proceedings
of ASCO 19: 567a, 2000.
6. A. Cossu, G. Palmieri, A. Manca, M. Pisano, A. Pintus, P. Cossu Rocca, M.F.
Dedola, P.L. Cherchi, S. Dessole, G. Massarelli, M. Pirastu, F. Tanda. Allelic
gains and losses at 10q25-q26 in malignancies of the uterine corpus:
demonstration of two distinctive genetic alterations. 89th Annual Meeting of
United States and Canadian Acad. of Pathology, New Orleans, USA, n. 716.
Modern Pathology 13 (1): 123A, 2000.
7. G. Palmieri, A. Manca, A. Cossu, P. Baldinu, R. Muresu, S. Tore, M. Pisano, M.
Casula, G. Ruiu, S. Dessole, A. Pintus, G. Massarelli, F. Tanda, M. Pirastu.
Genotype-phenotype analysis of endometrial cancer in Sardinian patients: fine
mapping of a new minimal LOH region at chromosome 10q25-q26. 50th Annual
Meeting of the American Society of Human Genetics, Philadelphia, U.S.A., n.
461. Am. J. Hum. Genet. 67 (4), Suppl. 2: 95, 2000.
36
Relazione attività scientifica 1999-2002
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8. P. Baldinu, A. Cossu, A. Manca, R. Muresu, S. Tore, M. Casula, G. Ruiu, S.
Dessole, A. Pintus, G. Massarelli, F. Tanda, M. Pirastu, G. Palmieri. Microsatellite
and FISH analysis in endometrial cancer: assessment of specific patterns of
genetic and cytogenetic alterations with their clinical correlation. Second
National Congress on Medical Oncology, Genova, Italy, n. D4. Ann. Oncol. 11,
Suppl. 2: 30, 2000.
9. G. Palmieri, A. Cossu, P.A. Ascierto, M. Strazzullo, G. Botti, A. Lissia, M.
Colombino, M. Casula, C. Floris, F. Tanda, M. Pirastu, and G. Castello. Genetic
alterations at chromosome 9p21 in primary tumors and metastases from
patients with sporadic melanoma: definition of their clinical significance. Second
National Congress on Medical Oncology, Genova, Italy, n. G15. Ann. Oncol. 11,
Suppl. 2: 60, 2000.
10. M.F. Dedola, M. Colombino, A Cossu, I. Persico, S. Marogna, R. Madeddu, A.
Manca, F. Tanda, G. Palmieri. Valutazione dell’instabilità genetica come fattore
prognostico in pazienti affetti da carcinoma del retto e sottoposti a trattamento
radiante. X Congresso Nazionale dell’Associazione Italiana di Radioterapia
Oncologica, Pisa, Italy. Tumori 86 (4), Suppl. 2: S84, 2000.
11. P.A. Ascierto, A. Daponte, G. Palmieri, G. Botti, N. Mozzillo, and G. Castello on
behalf of Melanoma Cooperative Group of Naples. Melanoma from research to
treatment. The experience of melanoma cooperative group of Naples. Fifth
International Conference on Melanoma, Venice, Italy. Melanoma Res. 11, Suppl.
1: S135-136, 2001.
12. G. Palmieri, A. Manca, A. Cossu, P. Baldinu, R. Muresu, S. Tore, M. Pisano, S.
Dessole, A. Pintus, F. Tanda, and M. Pirastu. Identification of different patterns
of genetic alteration (a new minimal LOH region at chromosome 10q25-q26 and
genomic instability) in Sardinian patients with sporadic endometrial cancer and
correlation with clinicopathological parameters. Thirty-Seventh Annual Meeting
of the American Society of Clinical Oncology, San Francisco, U.S.A., n. 2473.
Proceedings of ASCO 20 (2): 181b, 2001.
13. P.A. Ascierto, A. Daponte, G. Palmieri, G. Botti, N. Mozzillo, and G. Castello on
behalf of Melanoma Cooperative Group of Naples. Melanoma from research to
treatment. The experience of Melanoma Cooperative Group of Naples. ThirtySeventh Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, San
Francisco, U.S.A., n. 2888. Proceedings of ASCO 20 (2): 284b, 2001.
14. M. Pisano, A. Cossu, G. Palomba, M.G. Sarobba, A. Farris, M.F. Dedola, N.
Olmeo, A. Contu, I. Persico, M.P. Satta, M. Ibba, M.R. Stratton, M. Pirastu, F.
Tanda, and G. Palmieri. Screening for founder mutations in BRCA1/2 tumor
susceptibility genes among breast cancer families from North Sardinia. Annual
Meeting of the American Society of Human Genetics, San Francisco, U.S.A., n.
426. Am. J. Hum. Genet. 69 (4), Suppl.: 256, 2001.
15. G. Palmieri, P.A. Ascierto, A. Cossu, M. Casula, P. Cannada Bartoli, G. Botti, A.
Daponte, A. Lissia, F. Tanda, and G. Castello. Genetic analysis of sporadic and
familial malignant melanoma (MM): assessment of the role of 9p21 region and
p16/CDKN2A gene in MM tumorigenesis and its clinicopathological correlation.
The European Cancer Conference (ECCO 11), Lisbon, Portugal, n. 288. Eur. J.
Cancer 37, Suppl. 6: S81, 2001.
16. M. Pisano, G. Palomba, A. Cossu, G. Palmieri, M. Ibba, M.G. Sarobba, M.F.
Dedola, M.P. Satta, M. Pirastu, and F. Tanda. BRCA1 and BRCA2 analysis in
breast cancer families from Sardinia: identification of two BRCA2 founder
mutations with their clinical and pathological implications. The European Cancer
Conference (ECCO 11), Lisbon, n. 641. Eur. J. Cancer 37, Suppl. 6: S176, 2001.
37
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
17. M. Colombino, A. Cossu, A. Curci, A. Avallone, M. Giordano, F. Scintu, M.
Amoruso, M. Bonomo, F. Tanda, G. Palmieri. Definition of genetic instability as
prognostic factor in colorectal cancer by microsatellite analysis and
immunohistochemistry of an archival collection of patients. Comparison between
sporadic and familial cases. The European Cancer Conference (ECCO 11),
Lisbon, Portugal, n. 1003. Eur. J. Cancer 37, Suppl. 6: S271-272, 2001.
18. P. Baldinu, A. Cossu, S. Dessole, M.P. Satta, A. Manca, M. Pisano, M. Pirastu, A.
Pintus, F. Tanda, and G. Palmieri. Assessment of microsatellite instability and
genetic analysis of mismatch repair genes in sporadic endometrial cancer:
identification of different subsets of patients and a MLH1 founder mutation in
Sardinia. The European Cancer Conference (ECCO 11), Lisbon, Portugal, n.
1224. Eur. J. Cancer 37, Suppl. 6: S330, 2001.
19. G. Palmieri, A. Cossu, G. Palomba, P. Baldinu, M. Pisano, M.G. Sarobba, A.
Farris, M.F. Dedola, S. Dessole, A. Contu, M.P. Satta, M. Casula, A. Manca, M.
Ibba, A Pintus, M. Pirastu, F. Tanda. Role of founder mutations in breast cancer
families and endometrial cancer patients from Sardinia. Third National Congress
on Medical Oncology, Naples, n. E7. Ann. Oncol. 12, Suppl. 4: 52, 2001.
20. P. Baldinu, A. Cossu, A. Manca, M.P. Satta, M. Pisano, M. Casula, S. Dessole, A.
Pintus, F. Tanda, G. Palmieri. Microsatellite instability in unselected Sardinian
patients with endometrial cancer: screening for hMLH1/hMSH2 and PTEN
germline mutations. The 6th International Symposium on predictive oncology &
intervention strategies, Paris, n. 353. Cancer Detect. Prev. 26, Suppl. 1, 2002
21. P.A. Ascierto, G. Palmieri, F. Perrone, S.M.R. Satriano, A. Ottaiano, A. Daponte,
E. Leonardi, M. Napolitano, M. Melucci, N. Mozzillo, C. Gallo, A. Cossu, F. Tanda,
G. Castello. Circulating melanoma cells detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction: evaluation of prognostic role after a long-time
follow-up. Thirty-Eight Annual Meeting of the American Society of Clinical
Oncology, Orlando, U.S.A., n. 1357. Proceedings of ASCO 21: 340a, 2002.
22. G. Palmieri, A. Cossu, M. Casula, A. Manca, S. Tore, C. Sini, C. Loddo, P.A.
Ascierto, G. Botti, A. Daponte, G. Castello, A. Lissia, F. Tanda. From genetics to
physiopathology of malignant melanoma (MM): assessment of the role of known
genes (p16, CDK4, Id-1) and identification of a new candidate locus on
chromosome 9p21 through combined genomic and functional approaches.
Thirty-Eight Annual Meeting of the American Soc. of Clin. Oncol., Orlando, n.
1379. Proceedings of ASCO 21: 345a, 2002.
23. G. Palmieri, A. Cossu, M. Casula, A. Manca, S. Tore, C. Sini, C. Loddo, P.A.
Ascierto, G. Botti, A. Daponte, G. Castello, A. Lissia, F. Tanda. From genetics to
physiopathology of malignant melanoma (MM): assessment of the role of known
genes (p16, CDK4, Id-1) and identification of a new candidate locus on
chromosome 9p21 through combined genomic and functional approaches.
Thirty-Eight Annual Meeting of the American Soc. of Clin. Oncol., Orlando, n.
1379. Proceedings of ASCO 21: 345a, 2002.
24. P. Baldinu, A. Manca, A. Cossu, M.P. Satta, M.C. Sini, S. Tore, M. Pisano, M.
Casula, M.F. Dedola, S. Dessole, A. Pintus, A.A. Carboni, F. Tanda, and G.
Palmieri. Search for candidate gene(s) at chromosome 10q25-q26 in
endometrial cancer. 4th National Congress of Medical Oncology, Turin, Italy, n.
F38. Ann. Oncol. 13, Suppl. 3: 88, 2002.
25. M. Casula, P.A. Ascierto, A. Cossu, A. Manca, C. Rozzo, M. Colombino, C. Loddo,
S.M.R. Satriano, G. Castello, A. Lissia, F. Tanda, and G. Palmieri. Mutational
analysis of candidate genes in families with malignant melanoma (MM):
assessment of the role of the CDKN2A gene in MM predisposition. 4th National
Congress of Medical Oncol., Turin, n. G42. Ann. Oncol. 13, Suppl. 3: 100, 2002.
38
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
26. A. Manca, P. Baldinu, A. Cossu, M.P. Satta, M.C. Sini, S. Tore, M. Casula, M.
Pisano, C. Rozzo, S. Dessole, A. Pintus, A. Lissia, A.A. Carboni, F. Tanda, and G.
Palmieri. Identification of candidate transcripts at chromosomes 10q25-q26 and
9p21 in endometrial cancer and malignant melanoma. Annual Meeting of the
American Society of Human Genetics, Baltimore, U.S.A., n. 434. Am. J. Hum.
Genet. 71 (4), Suppl.: 246, 2002.
27. M. Colombino, G. Palomba, A. Cossu, M. Pisano, M.P. Satta, M.G. Sarobba, A.
Farris, M.F. Dedola, A.A. Carboni, A. Manca, F. Tanda, and G. Palmieri.
Screening for germline mutations of candidate genes in Sardinian cancer
families. Annual Meeting of the American Society of Human Genetics, Baltimore,
U.S.A., n. 449. Am. J. Hum. Genet. 71 (4), Suppl.: 248, 2002.
28. A. Cossu, M. Novelli, P. Carta, S.R. Lakhani, A. Pasca, G. Palmieri, M. Contini,
N.A. Wright, F. Tanda. Demonstration of tumour clonality by RT-PCR
amplification of G6PD gene in carriers of MED mutation. XXIVth International
Congress of the International Academy of Pathology, Amsterdam, The
Netherlands, n. P.22.246. Histopathology 41, Suppl. 1: 204, 2002.
29. G. Palomba, M. Colombino, A. Cossu, M. Pisano, M.P. Satta, A. Farris, M.F.
Dedola, F. Scintu, A.A. Carboni, A. Manca, F. Tanda, and G. Palmieri. Germline
mutations in candidate genes among cancer families from Sardinia. 27 th ESMO
Congress, Nice, n. 33PD. Ann. Oncol. 13, Suppl. 5: 10, 2002.
30. G. Palmieri, A. Cossu, A. Manca, M. Casula, C. Rozzo, G. Botti, G. Castello, A.
Lissia, F. Tanda, and P.A. Ascierto. Low prevalence of microsatellite instability in
malignant melanoma. 27th ESMO Congress, Nice, France, n. 583P. Ann. Oncol.
13, Suppl. 5: 158-159, 2002.
PARTECIPAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI
1.
P.L. Cherchi, G.A. Ruiu, A. Manca, G. Palmieri, M. Pisano, M. Pirastu, A. Cossu,
F. Tanda, S. Dessole. Genomic instability of the human chromosome 10q25q26 in patients with endometrial cancer. The 4th Congress of the European
Society for Gynecologic & Obstetric Investigation, Madonna di Campiglio, Italy:
RT15, 1999.
2.
M. Strazzullo, G. Palmieri, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, A. Daponte, G.
Comella, N. Mozzillo, G. Castello, and the Melanoma Cooperative Group.
Detection of circulating mRNAs in melanoma patients using RT-PCR assays: an
effective tumor progression marker. IV Meeting of Molecular Oncology,
Positano, Italy, P93: 148, 1999.
3.
G. Palmieri, P.A. Ascierto, S.M.R. Satriano, N. Mozzillo, G. Botti, C. Caracò, R.
Parasole, A. Daponte, M.G. Chiofalo, M.T. Melucci, A. Cossu, A. Lissia, F.
Tanda, G. Castello, the Melanoma Cooperative Group. The role of RT-PCR
markers in peripheral blood and regional nodes in the management of
melanoma (MM) patients. IV Conferenza “Melanoma: dalla biologia alla clinica”,
Forli: 29, 2000.
4.
F. Scintu, M.Giordano, P.Mocci, L.Marongiu, M. Melis, G. Palmieri, M. Pirastu, G.
Casula. Prognostic implications of replication error phenotype in non-sporadic
colorectal cancer. 4th Annual Meeting of European Society of Surgery, Krakow,
Poland, n. 271. Przeglad Lekarski 57, Suppl. 6: 54, 2000.
5.
G. Palmieri, P.A. Ascierto, G. Botti, N. Mozzillo, C. Caracò, S.M.R. Satriano, R.
Parasole, A. Daponte, M.G. Chiofalo, M.T. Melucci, A. Cossu, A. Lissia, F.
Tanda, and G. Castello. The RT-PCR markers in the management of melanoma
(MM) patients: the experience of Melanoma Cooperative Group of Naples.
Meeting on Sentinel Node, Santa Monica (CA), USA, n.12: 38, 2000.
39
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
6.
A. Manca, A. Cossu, G. Palmieri, M. Colombino, A. Curci, A. Avallone, M.
Giordano, F. Scintu, M. Amoruso, M. Bonomo, M.F. Dedola, D. Pirino, F. Tanda.
Instabilità genetica microsatellitare e prognosi del carcinoma del colon retto.
XX Congresso Nazionale della Società Italiana di Patologia dell’Apparato
Digerente (SIPAD), Alghero (SS), Italy: 216-219, 2001
7.
G. Palmieri, A. Cossu, M. Pisano, P. Baldinu, M.G. Sarobba, A. Farris, M.F.
Dedola, S. Dessole, N. Olmeo, A. Contu, G. Palomba, I. Persico, M.P. Satta, M.
Casula, A. Manca, M. Ibba, A Pintus, M. Pirastu, and F. Tanda. Identification of
founder mutations in tumor susceptibility genes among breast cancer families
and endometrial cancer patients from Sardinia. International Meeting on New
Trends in Molecular Carcinogenesis, Alghero (SS), Italy: 14, 2001.
40
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
PROGETTI FINANZIATI (SCADUTI ED IN CORSO)
DI RICERCA GENETICA DEI TUMORI. QUOTE DI
DALLA LINEA DI RICERCA PRESSO L’I.G.P.
NELL’AMBITO DELLA
LINEA
FINANZIAMENTO RICEVUTE
Assessorato alla Sanità, Giunta Regionale della Campania, Progetto “Approccio
genetico molecolare nel melanoma maligno: studio dei fattori di predisposizione e di
ricorrenza familiare come base per la produzione di vaccini antimelanoma”.
Annualità 1999.
Responsabile Scientifico: Dr. Giuseppe Castello, Immunologia Clinica, Istituto
Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori di Napoli.
Quota di finanziamento per la Linea presso l’I.G.P.: Lire 90.000.000
Ricerca Finalizzata Ministero della Sanità F.S.N. 1998, Progetto “Basi genetiche
della suscettibilità al melanoma maligno: studio della predisposizione e ricorrenza
familiare e definizione dei fattori di rischio e prognosi”. Annualità 1999-2000.
Responsabile Scientifico: Dr. Giuseppe Castello, Immunologia Clinica, Istituto
Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori di Napoli.
Quota di finanziamento per la Linea presso l’I.G.P.: Lire 80.000.000
Ricerca Finalizzata Ministero della Sanità F.S.N. 1999, Progetto “Sviluppo di nuove
metodiche per la diagnostica e la valutazione prognostica del melanoma: a)
Identificazione
precoce
di
micrometastasi
da
melanoma,
non
rilevabili
con
metodiche tradizionali, mediante utilizzo del frammento variabile ricombinante a
single chain (scFv) diretto contro l’antigene melanoma associato ad alto peso
molecolare (HMW-MAA); b) Sviluppo di nuove metodiche di analisi citogenetica e
molecolare
per
la
valutazione
di
specifiche
alterazioni
geniche
correlate
all’evoluzione e prognosi del melanoma”. Annualità 2000-2001.
Responsabile Scientifico: Dr. Maria Luisa Lombardi, Immunologia, Istituto Nazionale
per lo Studio e la Cura dei Tumori di Napoli.
Quota di finanziamento per la Linea presso l’I.G.P.: Lire 40.000.000
Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (A.I.R.C.), Progetto “Genotypephenotype analysis of tumors in Sardinian patients: identification of cancer genes
using genetic isolates”. Annualità 2001.
Responsabile
Scientifico:
Dr.
Giuseppe
Palmieri,
Istituto
di
Genetica
delle
Popolazioni, Consiglio Nazionale delle Ricerche.
Finanziamento per la Linea: Lire 80.000.000 (pari a Euro 41.317)
41
Relazione attività scientifica 1999-2002
Linea Genetica dei Tumori, CNR, Alghero
Assessorato alla Programmazione, Regione Autonoma della Sardegna, Progetto
“Genetica e Tumori nel Nord Sardegna: correlazione tra epidemiologia, istopatologia
e genetica”. Annualità 2001-2003.
Responsabile Scientifico: Prof. Francesco Tanda, Istituto di Anatomia Patologica,
Università degli Studi di Sassari.
Quota di finanziamento per la Linea presso l’I.G.P.: circa Euro 330.000 (pari
a circa Lire 640.000.000)
Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (A.I.R.C.), Progetto “Genotypephenotype analysis of tumors in Sardinian cancer patients: identification of new
genes using genetic isolates”. Annualità 2002.
Responsabile
Scientifico:
Dr.
Giuseppe
Palmieri,
Istituto
di
Genetica
delle
Popolazioni, Consiglio Nazionale delle Ricerche.
Finanziamento per la Linea: Euro 37.000
42