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SERS (surface enhanced raman scattering)
La spettroscopia Raman tradizionale
La spettroscopia Raman è una tecnica di indagine superficiale che si basa sul principio di
eccitazione dei livelli energetici della materia. Sul campione da analizzare si invia un raggio laser di
frequenza ν e si registrano le ri-emissioni di fotoni da parte della superficie colpita; i picchi rilevati
sono l’anti-stokes (hν’>hν), lo stokes (hν’<hν) e il Rayleigh (hν’=hν). Per poter comprendere
l’effetto di ri-emissione fotonica bisogna supporre che due atomi legati fra loro siano assimilabili a
due palline unite da una molla; quando queste vengono stimolate da forze esterne al sistema
cominciano a vibrare ad una frequenza pari a (legge di Hooke):
dove µ rappresenta la massa ridotta delle due particelle e vale
Da questa formula si può notare che nel caso in cui si verifichi un aumento di K (dato da un
rafforzamento dei legami) o una diminuzione di µ diminuisce (dato da atomi che presentano una
massa piccola), l’assorbimento Raman avviene ad una frequenza superiore.
In regime di meccanica classica tale oscillazione segue una tradizionale funzione di potenziale che
presenta un punto di minimo (equilibrio) ed infiniti punti continui in cui il sistema può trovarsi in
qualsiasi tempo t durante la vibrazione (V= ½ k r2). Secondo la meccanica quantistica la medesima
funzione di potenziale è invece divisibile in livelli discreti secondo la formula e=hν(n + ½) e il
sistema può giacere solo all’interno di questi.
Le emissioni Raman interessano l’ambito della fisica quantistica; le linee di stokes, anti-stokes e
Rayleigh dipendono solo dai salti energetici quantizzati degli elettroni stimolati. Supponendo di
analizzare il comportamento di un elettrone allo stato fondamentale g=0, si può verificare una
situazione nella quale esso si trovi inizialmente sul livello vibrazionale v=0, salti sul livello virtuale
m e ricada, in ultimo, sul livello v=1 (stokes); nello stesso modo può accadere che da v=1,
l’elettrone balzi allo stato virtuale m’ e decada poi su v=0 (anti-stokes); infine, sempre da v=0,
l’elettrone può salire allo stato m e ricadere su v=0 (Rayleigh).
Il segnale più marcato e netto è quello di Rayleigh, tuttavia sono i picchi di stokes e antistokes che
forniscono il maggior numero di informazioni utili ai fini dell’indagine. La loro intensità dipende
dalla probabilità di Boltzman di trovare un elettrone su un livello v=1 (più eccitato) e su v=0 (meno
eccitato); da ciò si ottiene che il rapporto fra le due popolazioni elettroniche è pari a:
N ( v =1)
= exp ( − ∆E / KT )
N ( v =0 )
dove K è la costante di Boltzmann e T è la temperatura di esercizio. Il segnale di anti-stokes risulta
così meno intenso rispetto a quello di stokes.
Il numero di picchi della spettroscopia Raman è pari al numero di modi vibrazionali della molecola
considerata (3n-6 in generale o 3n-5 per molecole lineari, dove n è il numero di atomi legati fra di
loro).
Esistono alcune varianti della spettroscopia Raman come, ad esempio, la Raman risonante, in cui il
fascio laser eccita gli elettroni fino a portarli ad un livello g=1 con emissioni più marcate, e la
fluerescienza, in cui i gap energetici non coinvolgono i livelli virtuali m, ma solamente il salto tra
g=0 e g=1 e i gap tra i vari sottolivelli vibrazionali v.
La tecnica SERS
La rivoluzione nella spettroscopia arriva con il metodo SERS, una tecnica attraverso la quale si
amplifica il segnale Raman delle molecole adsorbite in prossimità di nanoparticelle o di superfici
metalliche opportunamente rese rugose. L’intensificazione è di due nature differenti:
elettromagnetica e chimica.
Nel primo caso si ha un accoppiamento tra il campo elettromagnetico dell’onda incidente e le
oscillazioni collettive degli elettroni alla superficie del metallo (chiamate plasmoni di superficie).
Ipotizzando di avere a disposizione solo delle nanoparticelle metalliche, accade che l’eccitazione
degli elettroni avvenga solo sulla loro superficie; il picco di risonanza di questa eccitazione è
proporzionale alla forma, alla dimensione, al tipo di metallo utilizzato e al mezzo che circonda le
nanoparticelle. Per poter studiare questo complesso fenomeno di amplificazione sono stati
sviluppati dei modelli matematici riferiti dapprima all’interazione di due o più atomi fino a
interessare anche strutture complesse. Supponendo di avere una particella metallica eccitata da un
fascio laser, si ottiene un dipolo elettrico fluttuante sulla sua superficie. In un punto P posto a
distanza d dalla nanoparticella di raggio r si avvertirà un campo elettrico che dipende sia dal fascio
stimolante sia dal dipolo fluttuante:
Em=E0+Esp
Sapendo che la particella ha una costante dielettrica complessa ε=ε’+iε’’, mentre l’intorno ha
costante ε0 e il rapporto r/λ vale 0,05, si ottiene:
ε − ε0
1
⋅ E0 ⋅
ESP = r 3 ⋅
ε + 2ε 0
(r + d )3
Considerando che E0 è trascurabile rispetto a Esp, il fattore di intensificazione
elettromagnetico risulta pari a:
del campo
3
Em Esp
ε − ε0 ⎛ r ⎞
A(ν ) =
≈
=
⋅⎜
⎟
E0
E0 ε + 2ε 0 ⎝ r + d ⎠
Per definizione si ha che il fattore di amplificazione dell’intensità è:
G (ν ) = A(ν )
ε (ν ) − ε 0 ⎛ r ⎞
≈
⋅⎜
⎟
ε (ν ) + 2ε 0 ⎝ r + d ⎠
2
2
6
Dal momento in cui si ha un’intensificazione del campo elettromagnetico, i segnali stokes e antistokes subiscono la medesima sorte nel caso in cui le loro frequenze siano in risonanza con quelle
del plasmone.
Il fattore di intensificazione globale considera quindi sia la frequenza della linea eccitatrice sia
quella della linea stokes:
Gem (ν s ) = A(ν L ) ⋅ A(ν s )
2
ε (ν L ) − ε 0
ε (ν s ) − ε 0 ⎛ r ⎞
≈
⋅
⋅⎜
⎟
ε (ν L ) + 2ε 0 ε (ν s ) + 2ε 0 ⎝ r + d ⎠
2
2
12
Il tradizionale segnale Raman P= N nlaser σ (dove N è il numero delle molecole colpite, n è il
numero di fotoni per unità di tempo e di area, mentre σ è la sezione) risulta ovviamente modificato
dalla presenza delle particelle metalliche e diventa così:
2
abs
PSERS = N ' ⋅ nLaser ⋅ σ Raman
⋅ A(ν 0 ) ⋅ A(ν s )
2
Nel caso di interferenza chimica si verifica un charge transfer tra la molecola e il metallo, ottenendo
la formazione di un gap energetico tra il livello di Fermi del metallo e quello del charge transfer che
risulta superiore al tradizionale “salto” tra HOMO e LUMO della singola molecola. Sarà quindi
possibile stabilire le condizioni di risonanza tra la radiazione incidente e il nuovo gap elettronico,
che genera un notevole aumento di intensità rispetto ai valori Raman tradizionali; tale aumento è di
10-100 volte inferiore a quello prodotto per via elettromagnetica.
L’effetto di intensificazione del segnale Raman di entrambi i contributi (elettro-magnetico IC e
chimico IE) è pari a:
R
σ . σ ads
⋅ A(ν L ) ⋅ A(ν s )
= eff
=
= IC ⋅ I E
R
σ free
σ Rfree
2
I TOT
2
Ic =
R
σ ads
σ Rfree
I E = A(ν L ) ⋅ A(ν s )
2
2
dove σads tiene già conto dell’effetto chimico (dato che rappresenta la sezione con le molecole
adsorbite), mentre σeff corrisponde alla sezione effettiva.
Preparazione e analisi delle superfici metalliche
Per dar vita all’effetto SERS è necessario disporre di nanoparticelle metalliche che, una volta poste
a contatto con le molecole da analizzare, generino l’amplificazione Raman. Solitamente si
impiegano le seguenti tecniche:
• colloidi di argento o di oro,
• “Silver mirror reaction”,
• etching
• argentatura mediante esanoato di argento.
Come metodi di analisi si usa l’AFM, il TEM e la spettroscopia ad assorbimento UV-VIS-NIR.
Per creare le nanoparticelle metalliche si può procedere con il metodo top-down oppure con quello
bottom-up. Nel primo caso si parte dal metallo di base e lo si riduce ad un “quantum well” (struttura
con una sola dimensione nanometrica), poi si procede fino a creare un “quantum wire” (elemento
con due dimensioni nanometriche) e si conclude generando un “quantum dot” (particelle con tre
dimensioni nanometriche).
Nel secondo caso si inizia invece dagli atomi e si costruisce la nanoparticella metallica tramite
aggregazione; per la facilità tecnica di produzione dei nano-metalli, si preferisce normalmente
seguire questa seconda via.
In particolare si utilizzano i metodi chimici di sintesi in soluzione (acqua o solventi organici) che
prevedono la riduzione di atomi metallici positivi, presenti sottoforma di ioni o di complessi.
Per tale processo possono essere utilizzati diversi solventi in funzione della natura del sale o del
complesso metallico utilizzato, dell'agente riducente e delle eventuali molecole protettive da
impiegare. Quest’ultime vengono aggiunte alla soluzione per evitare che le nanoparticelle tendano
ad aggregarsi ed a precipitare con l'aumentare della concentrazione e con la diminuzione della
polarità del solvente. A questo scopo si utilizzano diversi tipi di molecole che, legandosi alla
superficie del metallo, lo stabilizzano e lo rendono eventualmente compatibile con solventi apolari.
In generale, il processo di accrescimento segue cinetiche differenti in funzione dei reagenti. Il
numero di particelle prodotte dalla reazione in un istante t generico (Nt) segue la formula:
(
N t = N ∞ 1 − e − kt
)
dove Nt è il numero di particelle prodotte al tempo t, N∞ è il numero di particelle totali che si ottiene
alla fine della reazione e k è una costante cinetica del primo ordine calcolata come segue:
E
ln k = ln A − a , dove A è una costante.
RT
Si possono così avere due tipi di reazione:
• Nucleazione istantanea, quando k è grande e Nt=N∞
• Nucleazione progressiva, dove k è piccolo e Nt = k t N∞
Un primo esempio di questo processo è l’accrescimento di nanoparticelle d’argento attraverso l’uso
di trisodio citrato o di boroidrato in acqua. Il catione argento si riduce ad Ag0, mentre il citrato (o il
boroidrato) si ossida, formando un primo complesso atomico di metallo, il quale cresce
successivamente fino a raggiungere dimensioni nanometriche. Esaminando il composto si nota che
la dimensione media delle particelle è di 35 nm nel caso del citrato mentre è di 7 nm nel caso del
boroidrato, con assorbimento luminoso rispettivamente a 420 nm e 390 nm. La nucleazione è
progressiva (k=173kJ/mol)
Si esegue lo stesso procedimento con un tetrafluoruro aurato (AuCl4-), usato come fonte per il
metallo, e con il citrato, come agente riducente. In questo modo si ottengono nanoparticelle d’oro di
diametro medio di 20 nm e con assorbimento luminoso nel campo del rosso a 520 nm. La
nuclezione è istantanea (k=31,4 kJ/mol).
Una variante al processo è costituita dall’uso di toluene come solvente organico aggiunto all’acqua.
Molto importante è la fase di trasferimento degli ioni AuCl4- dalla fase acquosa alla fase organica
(toluene), resa possibile dalla presenza del trasferitore di fase tetraoctyl ammonium bromide e della
agitazione meccanica che massimizza la superficie di contatto tra fase acquosa e fase organica. Una
volta che gli ioni tetracloroaurici sono trasferiti in fase organica, si aggiunge del sodio boroidrato
che è l’agente riducente. La reazione avviene all’interfaccia tra la fase organica, dove sono presenti
gli ioni AuCl4-, e la fase acquosa, dove è presente il sodio boroidrato. Per questo motivo i due
liquidi devono essere accuratamente miscelati durante la riduzione. Altre reazioni per l’ottenimento
di questi composti sono:
• l’etching di fogli di argento mediante HNO3,
• l’argentatura tramite esanoato (o decanoato) d’argento
• la “silver mirror reaction”.
Le varianti e i miglioramenti apportabili a questa procedura sono molteplici; si possono, ad
esempio, aggiungere alle nanoparticelle metalliche alcuni agenti stabilizzanti costituiti da alchiltiofeni, oppure si possono costruire composti con due metalli omogeneamente miscelati o con fasi
separate.
Le nanoparticelle ottenute costituiscono la chiave di funzionamento dell’amplificazione SERS. È da
tener presente che l’effetto di eccitazione del plasmone di superficie avviene solo a precise
lunghezze d’onda; in generale si ha che:
K xplasmone = K xfotone + K
dove l’ultimo termine K vale 2π/a e dipende dalla spaziatura della rugosità di superficie. Non
essendo questo termine costante, accade che l’eccitazione del plasmone possa avvenire in un range
di lunghezze d’onda. Naturalmente, in sede di analisi al Raman, la frequenza eccitatrice, ovvero la
lunghezza d’onda emessa dal laser, è dato imposto dalla strumentazione stessa; per questo motivo,
al fine di ottenere l’effetto “plasmone”, si deve avere a disposizione un materiale metallico in grado
di stimolarsi nel range di frequenza laser a disposizione. Per fare ciò, si variano le condizioni di pH,
di temperatura, di tempo di reazione e di presenza di NaCl nella soluzione di partenza, in modo da
ottenere nanoparticelle con il picco d’assorbimento desiderato.
0,85
0,80
0,75
0,70
0,65
0,60
Absorbance
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
400
600
800
Wavelength (nm)
Per verificare l’effetto SERS si procede in due differenti modi: utilizzando una molecola come
riferimento interno alla soluzione o avvalendosi della valutazione del rapporto stokes vs. antistokes.
Nel primo caso si pongono in soluzione le molecole da analizzare, le nanoparticelle metalliche e un
composto SERS inattivo (metanolo), che viene usato come riferimento. Si confrontano i picchi del
composto inattivo con quelli della nanoparcella amplificati con effetto SERS e si calcola il fattore di
intensificazione. Dal momento che, ad alte concentrazioni, non tutte le molecole da analizzare sono
legate in un sito attivo dei nano-metalli, si ottiene una stima per difetto dell’amplificazione.
Nel secondo caso si calcola l’area di impatto SERS sapendo che:
dove il rapporto del segnale Pas (anti-stokess) su Ps (stokes) dipende da una componente SERS (τ1 è
il tempo di vita medio del livello vibrazionale 1) e da una termica. Nel caso in cui i parametri siano
controllati con molta accuratezza, la misurazione fornisce la sezione d’urto SERS che vale:
hν
−
PasSERS
KT
e
−
PsSERS
SERS
σ
=
τ 1 ⋅ nL
Nel caso in cui i parametri siano invece imprecisi si potrebbero verificare aberrazioni di origine
termica o matematico-statistica (approssimazioni).
Questa tecnica fornisce un utile strumento per ottenere amplificazioni di spettro Raman pari a 109
fino a 1014 volte rispetto al valore tradizionale, grazie anche all’effetto di abbattimento del segnale
di fluorescenza.
Oggigiorno si utilizzano sistemi a fibra ottica che garantiscono la possibilità di posizionare il
sensore anche in luoghi di difficile accesso (anche a centinaia di metri dallo spettrometro e dal
sistema di acquisizione dati); si possono cosi ottenere, in tempo reale, analisi ad elevata sensibilità
di una o più sostanze contemporaneamente.
Lo strumento è costituito da una fibra ottica sulla cui estremità è posto il rivestimento di
nanoparticelle d’argento che, una volta messe a contatto con il target da rilevare, amplificano il
segnale. Il capo di tale fibra viene trattato in diversi modi attraverso etching chimico, ottenendo
generalmente una forma acuminata con diverso angolo di inclinazione; al segnale che si ottiene
viene sottratta automaticamente la curva relativa all’input appartenente alla fibra.
A basse concentrazioni ( <10-10 M ) si può considerare che nel volume di scattering (decine di pl)
sia presente al massimo una molecola SERS attiva. In questo modo si adottano diverse
metodologie per ottenere un SERS a singola molecola che garantisca un fattore di amplificazione
pari a 1014 e, mediante delle nanopunte, si valutano gli spettri Raman amplificati di singole
molecole poste al di sotto di esse.