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L’EVOLUZIONE DELLA
LOTTA AL DOPING IN
ZOOTECNIA
Dip. Scienze Veterinarie
Università degli Studi di Torino
Largo Braccini 2, Grugliasco (TO)
Francesca Tiziana CANNIZZO
Bartolomeo BIOLATTI
BIOMARKERS
INDICATORI DELLA
SOMMINISTRAZIONE DI PROMOTORI
DELLA CRESCITA AGLI ANIMALI DA
CARNE
https://www.steroid.co
m/blog/Female-LongDistance-Runners-LikeAnabolic-SteroidsToo.php
Estrogeni
androgeni
progestinici
17-estradiolo
Zeranolo
Testosterone
Trembolone
Progesterone
Melengestrolo
PER TUTTE LE CLASSI DI ORMONI
GLI EFFETTI:
ENDOCRINI,
IMMUNOLOGICI,
NEUROBIOLOGICI,
IMMUNOTOSSICI,
GENOTOSSICI,
CARCINOGENICI E SULLO SVILUPPO
SONO EVIDENTI !
TRA I VARI GRUPPI A RISCHIO PREOCCUPA
MAGGIORMENTE QUELLO DEI SOGGETTI PREPUBERI
Purtroppo i dati scientifici non consentono valutazioni
quantitative del rischio
Abuso di ormoni negli
Stati membri EU
 Monitoraggio dell’uso di ormoni in EU 2001:
 8 su15 Stati membri non hanno riscontrato positività
 altri hanno riportato 0.03-0.53% di positività
 media EU: 0.16% positività per residui ormonali
In Italia PNR:
0.3% nel 1999
0.02 % nel 2012
0.04% nel 2014
PROBLEMA
TEST DIAGNOSTICI UFFICIALI
ANALISI
CHIMICHE
elevata sensibilità e
specificità, quantitativa
Non è realistico far numero
rispettare
il
limitato di
illecite,
divieto comunitariosostanze
solo
con
tempistica, COSTI ELEVATI
I problemi
in campo… analitico!
l’approccio
Non si conosce la molecola o le
molecole illecitamente utilizzate
Basse dosi di decine di molecole
Rapida metabolizzazione del farmaco
Tempistica di intervento
Ball S, Polson K, Emeny J, Eyestone W, Akers RM.
Induced lactation in prepubertal Holstein heifers. J
Dairy Sci. 2000 Nov;83(11):2459-63.
CONTROLLO
Biolatti B., Bollo E., Appino S. - Patologia dell'apparato
genitale, apparato respiratorio, mammella e timo di vitelli
trattati con clenbuterolo e steroidi sessuali. Argomenti di
Patologia Veterinaria (Scritti in memoria del Prof. L. Leinati),
285-302, 1993.
TRATTATO
CONTROL
GHIANDOLA MAMMARIA SECERNENTE IN VITELLO
IMPUBERE
COMPLESSO IDROMETRA-MUCOMETRA
CONTROLLO
TRATTATO
CONTROLLO
ANALISI INDIRETTE
GENOMICA
PROTEOMICA
EFFETTO
BIOLOGICO
ISTOLOGIA
METABOLOMICA
TEST ISTOLOGICO
NEGATIVO
DUBBIO
Trattato con
impianti
Controllo
SOSPETTO
Trattato con alte
dosi 17-betaE2
CONTROLLO
TRATTATO
Sviluppo dell’atrofia fisiologica nel timo
nel vitellone all’età di 20/22 mesi
A
C
1
A
C
2
A
C
1
A
C
2
normale
A
T
1
A
T
2
A
T
3
atrofico
Prednisolone
Il
test istologico non permette di
identificare
il
trattamento
con
prednisolone né nei vitelli né nei
vitelloni (Cannizzo et al.,2011).
La ricerca del metabolita
20β-diidrossiprednisolone nelle urine
permette di identificare gli animali
trattati durante il trattamento, ma non a
seguito di sospensione (Leporati et al.,2013).
GENOMICA
TRASCRITTOMICA
TRASCRITTOMICA
“One-gene approach”
Il gene di interesse (biomarker)
è espresso in quantità
significativamente diverse negli
animali trattati rispetto ai
controlli.
qPCR nella lotta al doping bovino
MARKER MOLECOLARI
ESTROGENI , ANDROGENI , CORTICOSTEROIDI
VITELLI
Recettore del
progesterone (PR)
VITELLONI
Bulbouretrali
Regucalcina (RGN)
testicolo
Ossitocina (OXT)
muscolo
PRELIEVO
AL MACELLO
ESPRESSIONE PR in VTN
350,00
campioni
cut-off
300,00
2-D Ct x 1000
250,00
200,00
150,00
100,00
50,00
0,00
1
2
3
4
gruppo A
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
gruppo B
gruppo C
gruppo K
curva ROC VTL: intervallo di confidenza del 95% si ottiene
un P=0,000123 ed il cut-off calcolato è di 70,81 con una
specificità e sensibilità del metodo del 100%
TESTICOLO
REGUCALCINA
•Regola l’omeostasi intracellulare del Ca2+
•Topo e uomo
•Diversi tessuti e linee cellulari
qPCR RGN nei VCB
Ghiandola Bulbouretrale
Prostata
Group A = 190 mg/animale di 17β-estradiolo
Group B = 1050 mg di testosterone propionato
K1 = controllo
Testicolo
qPCR RGN nei VTN
Group C = 200 mg di trenbolone acetato e 20 mg di 17β-estradiolo (Revalor-200®)
Group D = 200 mg di trenbolone acetato (Finaplix®-H)
K2 = controllo
IHC RGN nei VCB
Testicolo
Estrogeni
Androgeni
Controllo
BIOMARKER NEL MUSCOLO
SCHELETRICO
OSSITOCINA (OXT)
L’ossitocina viene sintetizzata come prepropeptide e trasportata attraverso gli assoni ai
terminali localizzati nella neuroipofisi.
I peptidi maturi, ossitocina ed il suo carrier
neurofisina I, sono immagazzinati nei granuli
neurosecretori dell’ipofisi posteriore fino ad un
loro rilascio nel circolo sanguigno.
Ruolo dell’OXT
• Parto
• Allattamento
Funzione legata all’attività
sessuale, comportamenti
materno e sociale, osteoporosi,
diabete, cancro, stress e
cardiomiogenesi
L’ossitocina è prodotta anche da alcuni tessuti periferici:







utero
corpo luteo
placenta
prostata
testicoli
epididimo
cuore
Nel plasma degli animali trattati, l’ormone
Revalor-H
Manzi di razza Brahmans ossitocina
68 ± 20 giorni
(200 mg trenbolone acetato
20 mg 17β-estradiolo)
aumenta di 50 volte rispetto+ai
controlli
Over expression
del pre-propeptide
dell’ossitocina (OXT)
nel muscolo
97 volte (qPCR)
ANIMALI
MOLECOLA
TRATTAMENTO
Nel muscolo scheletrico Sternocleidomastoideo
VITELLONI
(13-22 mesi)
VITELLI
(5-6 mesi)
ESPRESSIONE
OXT
(rispetto al
controllo)
Androgeno+
estrogeno +
glucocorticoide
Impianto Revalor (90 d)+Desashock (40 d)
14.3±25.3
Androgeno+
estrogeno
Impianto Revalor (90 d)
10.3±12.1
androgeno
Impianto Finaplix (90 d)
0.41±0.7
estrogeno
20mg/capo 17βE settimanalmente (40 d)
33.5±20.3
glucocorticoide
Desashock (40 d)
13.3±14.5
estrogeno
20-40mg/capo, 17βE weekly (37 d)
3546 ± 1654
androgeno
150-200 mg/capo, testosterone
settimanalmente (37 d)
0.83±1.23
Estrogeno +
glucocorticoide
5 mg/capo 17βE settimanalmente +
Desashock (31 d)
14.1±11.23
Estrogeno +
benzodiazepina
5 mg/capo 17βE settimanalmente +
Brotizolam (31 d)
6.5±7.03
Androgeno +
β-agonista
150mg/capo nandrosol settimanalmente +
ractopamina (31 d)
3.7±3.9
VANTAGGI DEL TEST BIOMOLECOLARE PER OXT
Test eseguibile sul
muscolo anche dopo la
macellazione se
opportunamente
conservato
Reperire il tessuto è semplice e non
necessita di formazione specialistica
per il personale
Sensibile e specifica
RNA later
Il prelievo…
+ 4°C
per 1 mese
Dip. Scienze veterinarie di Torino