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Istituto Nazionale per le Malattie Infettive
L.Spallanzani IRCCS
-Laboratorio di Immunologia Cellulare-
Dr. Domenico Viola
TSLB
Un nuovo standard
a supporto della diagnosi
dell’infezione da M. tuberculosis
Test basati su IFN-γ
Test in vitro che misurano l’IFN-γ rilasciato
dai linfociti T in risposta ad antigeni tubercolari
I linfociti del soggetto in esame vengono posti in
contatto con l’antigene, con un controllo negativo
privo di antigene e con un controllo che contiene
mitogeno (fitoemoagglutinina)
Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione
– assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE
– presenza di IFN-γ = INFEZIONE
presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO
assenza di IFN-γ nel controllo MIT = DEFICIT IMMUNITARIO
PRINCIPIO DEL TEST: Nil TBAg MIT
QuantiFERON:
test brevettato, certificato CE, FDA
cleared, che, attraverso la misurazione
dell’ IFN-γ prodotto in vitro,
Normal altitude
tubes
a seguito di una
stimolazione linfocitaria (T) specifica*
in sangue intero,
assicura un prezioso supporto alla diagnosi
delle infezioni da M. tuberculosis
High altitude
tubes
* Cellestis Limited e lo Statens Serum Institut (SSI) hanno siglato un accordo
per l’utilizzo delle proteine M. tuberculosis specifiche nella piattaforma
brevettata QFT-TB GOLD In-Tube
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Test basati su IFN-γ
QuantiFERON-TB Gold®
Metodo ELISA in-tube
1.Raccolta del sangue in provette eparinate
(K neg, ESAT6 + CFP10 , mitogeno)
2.Incubazione per 16-24h a 37°C
3.Centrifugazione
4.Recupero del plasma e
dosaggio dell’IFN-γ
1. ELISA ‘sandwich’ incubazione 120 min
2. Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura COLORE
3. Misura della DO e dosaggio dell’IFN-g contro una curva di taratura
Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004
I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono
interferone-γ se vengono in contatto con uno o più antigeni del
M. tuberculosis
ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1)
che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT
Confronto tra i test per infezione latente
Confronto tra i test per infezione latente
Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004
Pai M. et al. Lancet Infect Dis 2004
% maximal IFN-gamma response
ACCURATEZZA DEL TEST: MIT (mitogeno)
100
75
50
25
Mito g e n C o n ce n tra tio n
u se d in Q F T -G o ld
PHA
0
C o n c e n tr a tio n o f M ito g e n
a concentrazione
critica
Un controllo della funzionalità immunitaria del Paziente:
Risposta al Mit inversamente proporzionale alla immunocompromissione del Paziente
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SPECIFICITA’ DEL TEST: TBAg (ESAT-6, CFP-10,
TB 7.7)
Antigeni
Antigeni
BCG substrain
Tuberculosis
complex
ESAT-6*
CFP-10*
TB7.7
M tuberculosis
M africanum
M bovis
+
+
+
gothenburg
moreau
tice
tokyo
danish
glaxo
montreal
pasteur
-
Ceppi
ambientali
M abcessus
M avium
M branderi
M celatum
M chelonae
M fortuitum
M gordonii
M intracellulare
M kansasii
M malmoense
M marinum
M oenavense
M scrofulaceum
M smegmatis
M szulgai
M terrae
M vaccae
M xenopi
ESAT-6*
CFP-10*
TB7.7
+
+
+
-
Antigeni specifici brevettati (SSI, Denmark)
*: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6)
Cellestis con diritti a livello mondiale
*: CFP-10 (culture filtrate protein-10)
OPZIONI DEL TEST: 2 Provette (2P) – 3 Provette (3P)
Pazienti “Clinici”
- Bambini
- Pazienti con sintomi specifici
- TB non polmonare
- Ricerca (monitoraggio terapia, etc.)
Screening di comunità
- Operatori Sanitari: (Ospedali, Università, etc.)
- Militari, Immigrati, Carcerati, etc.
- Associazioni assistenziali governative e non, etc.
- Personale viaggiante: (linee aeree, linee ferroviarie,
trasporto pubblico urbano)
3P
- Servizio pubblico: (Polizia, Pompieri, Assistenti
ambulanze, etc.)
2P
Pazienti “Immunocompromessi”
- HIV/AIDS
- Reumatologia e Dermatologia
- Dialisi
- Candidati a Trapianti
- Pazienti con morbo di Chron
Screening dei contatti
- Personale reparti a rischio (pronto soccorso, etc.)
- Ambienti familiari, di lavoro, etc.
- Controllo sul territorio
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QuantiFERON®:
1° Step: Prelievo
Dopo stimolazione:
Plasma conservabile
a 2-8° per 4 settimane
QuantiFERON®:
2° Step: IFN-γ ELISA
50µl Coniugato +
50µl Plasma/Standard
120min. Incubazione TA
Lavaggio
100ul TMB
30min. Incubazione TA
50ul Stop
Lettura 450nm /620-650nm
Completamente automatizzabile, direttamente dal tubo primario
Riproducibilità 99.3%
QuantiFERON®:
3° Step: Calcolo dei risultati
Disponibilità di Software dedicato:
Test a 2 Provette
Test a 3 Provette (valutazione della funzionalità immunitaria)
Risultato Qualitativo:
Negativo, Indeterminato, Positivo
Risultato Quantitativo:
IFN-γγ UI/mL
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Scenario of testing: 1,000 people and say 5% have true MTB infection.
If we use the estimates of sensitivity and specificity
for QFT, TST and T-Spot from Diel et al, Chest, 2010
which test is the most accurate?
TEST
PPV (%)
NPV (%)
Accuracy (%)
QFT
84.8%
99.2%
98.5%
T-Spot
25.4%
99.3%
86.4%
QFT is far more accurate than either the TST or T-Spot.TB, providing the
correct answer for 985 of the hypothetical 1,000 people (only 15 people
incorrect)
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani IRCCS
-Laboratorio di Immunologia Cellulare-