Lezione 14. - Università degli Studi di Parma

I microrganismi nell’Industria
Chimica e Farmacuetica
Esempi di prodotti industriali ottenuti
mediante l’impiego di microrganismi
Produzione industriale di aminoacidi
Produzione riferita all’anno 1985. Metodi produttivi: C: sintesi chimica; M: sintesi microbiologica (fermentazione, biotrasformazione di precursori, trasformazioni enzimatiche); P: purificazione da idrolisati proteici
Alcuni polisaccaridi microbici di interesse
industriale
Polisaccaridi
Microrganismo
produttore
Utilizzazione
Destrani
Leuconostoc
mesenteroides
P.M. 40.000-60.000:
sostituti del plasma
(soluzioni al 6-10%)
Xantani
Xantomonas
campestris
Addensanti e stabilizzanti
in campo alimentare
Alginati
Pseudomonas
aeruginosa
- Agenti stabilizzanti e leganti
di preparazioni farmaceutiche
- preparazione di bendaggi per
ferite
- terapia di disturbi esofagei
Enzimi microbici di interesse industriale e
farmaceutico
Esempi di trasformazioni
microbiche di steroli
Produzione di acido 6-aminopenicillanico
Degradazione di composti
organici nelle biodepurazioni
Esempi di plasmidi catabolici in alcuni microrganismi
Esempi di metaboliti microbici non
antibiotici con attività farmacologica
Ricerca e produzione di nuovi antibiotici
- Modificazione di
antibiotici naturali
- Sintesi chimica di
nuove molecole
Studio di:
spettro d’azione in vitro
tossicità
farmacocinetica
efficacia in infezioni
sperimentali in animali
Biotecnologia
Scienza che studia ed applica processi in cui organismi
viventi (procarioti o eucarioti) vengono geneticamente
manipolati, attraverso l’ingegneria genetica, per indurli
alla produzione di sostanze utili, al fine di realizzarne
applicazioni industriali, mediche o altre
Integrazione di Microbiologia,
Biochimica ed Ingegneria
Biotecnologia
Deliberata modificazione dell'informazione genetica di
un organismo vivente mediante modificazione diretta
del suo acido nucleico o introduzione di uno o più geni
esogeni, attraverso una serie di metodologie, definite
nell'insieme "Tecnologia del DNA ricombinante",
basate sulla possibilità di:
• tagliare il DNA, in corrispondenza di siti specifici, con
enzimi di restrizione (endonucleasi),
• identificare geni di interesse, trasferirli ed inserirli in
opportuni vettori (clonaggio),
• introdurre tali vettori modificati (DNA ricombinante)
in ospiti, che ne consentono la propagazione ed
espressione, con produzione della proteina codificata
dal gene di interesse (proteina ricombinante).
Biotecnologia
I microrganismi (batteri o lieviti), data la
rapidità di crescita, facilità e relativa
economicità della loro coltivazione sono gli ospiti
più utilizzati
Applicazioni:
ricerca, industria farmaceutica,
medicina, agricoltura, zootecnia, ecc.
alimentare,
Industria farmaceutica:
produzione di proteine di difficile ottenimento o
purificazione, da utilizzare quali vaccini, prodotti
terapeutici, diagnostici
Alcune pietre miliari nel campo della
biotecnologia e del DNA ricombinante
1969 primo enzima di restrizione (EcoRI)
1970 trascrittasi inversa (Temin, Baltimore)
sintesi in vitro di un gene completo
1972 clonaggio di geni in vettori plasmidici
1975 prima diagnosi prenatale con una sonda genica specifica
1976 metodi per sequenziamento rapido DNA
1977 scoperta dei geni interrotti (introni)
sintesi della somatostatina ricombinante
1978 sintesi della insulina ricombinante
1979 clonaggio del primo gene codificante un antigene virale
umano (epatite B)
clonaggio del gene codificante un antigene virale dell'afta
epizootica
Alcune pietre miliari nel campo della
biotecnologia e del DNA ricombinante
1981 produzione industriale di insulina umana in E.coli
1982 isolamento, clonaggio, caratterizzazione del primo oncogène
umano
trasferimento del gene per l'ormone della crescita di ratto
in uova fecondate di topo (terapia genica in vitro)
piante di tabacco rese resistenti all'erbicida glifosato
(inserzione di un gene di Salmonella)
1985 sviluppo della reazione polimerasica a catena (PCR)
terapia genica in topo: cura di una malattia genetica letale
con inserimento di un gene normale in una cellula uovo
fecondata
1987 produzione di una pianta agricola geneticamente
modificata (soia)
Alcune pietre miliari nel campo della
biotecnologia e del DNA ricombinante
1988 primo saggio sul campo di un virus degli insetti
geneticamente
modificato (baculovirus in grado di
uccidere larve dei geometridi del cavolo)
1989 produzione
primo
granturco
geneticamente
modificato fertile (gene per la resistenza all'erbicida
bialaphos)
produzione di anticorpi ricombinanti nel fago λ
1990 sviluppo maiali e capre transgenici in grado di
produrre proteine umane (es. emoglobina)
produzione di anticorpi ricombinanti in fagemidi (fago
M13)
1991 primo test di terapia genica in un paziente con cancro
1992 immunizzazione genica sperimentale
Prodotti farmaceutici ottenuti mediante
la tecnologia del DNA ricombinante
Alcuni enzimi utilizzati nella Tecnologia del
DNA ricombinante
Enzimi
Microrganismi produttori
Endonucleasi di restrizione
Bam HI
Dpn l
EcoRI
Hae Il
Sal I
Bacillus amyloliquefaciens
Diplococcus pneumoniae
Escherichia coli
Haemophilus aegyptius
Streptomyces albus
Enzimi modificanti
DNA ligasi del fago T4
DNA polimerasi (E. coli)
DNA polimerasi del fago T4
Polinucleotide chinasi
Trascrittasi inversa
E. coli infettato con T4
E. coli
E. coli infettato con T4
E. coli infettato con T4
Virus della mieloblastosi aviaria
Strategie del clonaggio genico
clonaggio: possibilità di trasferire da un organismo ad un altro un
determinato gene, senza che esso venga degradato, ma sia in grado
di essere espresso, propagato (autonomamente o meno) e trasmesso
alle cellule figlie (funzioni fornite dal vettore)
DNA donatore
+
- frammenti del genoma
- cDNA (trascrizione inversa di mRNA)
- DNA sintetico
vettore di clonaggio
- plasmidi
- batteriofagi
- cosmidi e fagemidi
- virus
• inserimento del DNA nel vettore
• inserimento del vettore ricombinante nella cellula
ospite (procariota o eucariota)
(trasformazione, trasduzione, elettroporazione)
• selezione del clone contenente il gene desiderato
(tecniche immunologiche con l’uso di anticorpi marcati,
ibridazione con sonde nucleotidiche, ecc.)
Schema del clonaggio genico
fotografia al M.E. del plasmide
e del gene tagliati
fotografia al M.E. del plasmide ricombinante ottenuto
Il gene di interesse, contenuto nel
DNA donatore, viene tagliato con
una endonucleasi (es. Eco RI); il
vettore plasmidico, contenente un
gene per la resistenza ad un
antibiotico (es. tetraciclina, tetR)
viene tagliato con lo stesso enzima
Le 2 molecole di DNA, purificate,
sono miscelate in modo che le basi
complementari si appaino e legate
insieme ad opera dell’enzima ligasi
Il DNA ricombinante così ottenuto
viene introdotto in una cellula
ospite (es. E. coli) sensibile alla
tetraciclina; le cellule in cui entra il
DNA
ricombinante
diventano
resistenti e possono formare colonie
su terreni contenenti l’antibiotico
(selezione dei ricombinanti).
A volte il DNA viene tagliato con 2
diverse endonucleasi per ottenere
un “clonaggio direzionale”.
Clonaggio di geni eucariotici
Mentre geni batterici e virali possono essere tagliati e clonati
direttamente in un vettore, spesso i geni eucariotici sono interrotti
da introni; si preferisce allora ottenere il gene completo (cDNA) a
partire da mRNA maturo
Nella trascrizione primaria tutto
il gene viene trascritto (RNA
trascritto primario), poi subisce
un processo di maturazione
(“splicing”), durante il quale le
sequenze introniche vengono
rimosse.
L’mRNA maturo può essere
retrotrascritto per ottenere una
molecola di cDNA che contiene
il gene non interrotto
Sintesi di cDNA a partire da mRNA eucariotico
Le code di poliA, presenti nel
mRNA maturo, permettono di
utilizzare inneschi di oligo dT che
consentono all’enzima trascrittasi
inversa di sintetizzare un filamento
di cDNA che termina con un
ripiegamento. L’RNA a questo
punto viene degradato dalla
aggiunta di NaOH. Aggiungendo
DNA polimerasi I si consente la
sintesi della 2^ elica di DNA.
Infine, il tratto ripiegato viene
eliminato mediante trattamento
con una nucleasi (S1) ed alle
estremità vengono aggiunte brevi
sequenze di basi (ad es. C) per
poter inserire il gene in un vettore
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico
Escherichia coli
Primo sistema ospite utilizzato per clonaggio genico e produzione di
proteine ricombinanti: batterio più studiato e conosciuto, per cui la sua
manipolazione genetica è abbastanza facile.
Svantaggi:
- non possiede efficienti sistemi di secrezione delle proteine (le proteine
ricombinanti prodotte spesso si accumulano all'interno della cellula e,
nei casi di produzione elevata, danno origine ad aggregati
intracellulari);
- alcune proteasi batteriche possono degradare le proteine ricombinanti
(si ovvia utilizzando ceppi mutanti che non producono proteasi).
- come tutte le cellule procariotiche, non permette modificazioni posttraduzionali (glicosilazioni, fosforilazioni, tagli, ecc.)
- essendo un batterio Gram- la proteina ricombinante ottenuta è
contaminata da endotossina (attività pirogena) e deve essere purificata.
E’ il sistema di espressione più utilizzato (insulina, somatostatina,
ormone della crescita, interferoni, ecc.); la proteina ricombinante
rappresenta il 30-40% delle proteine totali.
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico
Bacillus subtilis
Dopo E. coli è il sistema genetico meglio conosciuto
Vantaggi:
- essendo Gram+, non possiede endotossina
- è un microrganismo apatogeno
Tuttavia è poco utilizzato, in quanto non sono
disponibili efficienti vettori di clonaggio e non è stato
possibile ottenere un’efficiente produzione di proteine
ricombinanti eterologhe
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico
Saccharomyces cerevisiae
Microrganismo eucariota (lievito) molto utilizzato a livello
industriale e ben conosciuto dal punto di vista genetico.
Vantaggi:
possiede un efficiente sistema di secrezione, anche per le
proteine ricombinanti eterologhe; esistono vettori efficienti; è
di facile coltivazione; le proteine ricombinanti non formano
inclusioni intracellulari; sono possibili modificazioni posttraduzionali (che tuttavia non sono necessariamente le stesse
prodotte dalle cellule animali); è apatogeno.
Viene utilizzato per produrre interferone, insulina,
interleukina 2, ecc.
Più recentemente sono stati utilizzati anche altri lieviti, quali
Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula
polymorpha, che hanno vantaggi in termini di facilità di
coltivazione o resa del prodotto finale.
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico
Cellule di mammifero coltivate in vitro
Questo sistema ospite permette di ottenere la
secrezione della proteina ricombinante e di realizzare
le modificazioni post-traduzionali di tipo eucariotico
(es. glicosilazione), richieste per la funzionalità della
proteina finale. Sono disponibili efficienti sistemi di
espressione (vettori).
Questo sistema è tuttavia estremamente costoso e le
rese del prodotto sono enormemente inferiori a quelle
dei sistemi microbici, per cui, quando possibile, questi
ultimi sono preferiti.
Es. cellule CHO (cellule di ovaio di hamster cinese)
Cellule ospiti utilizzate per il clonaggio genico
La scelta della sistema ospite dipende dalle
caratteristiche del prodotto finale. Se questo richiede
modificazioni post-traduzionali, occorre utilizzare
sistemi eucariotici più o meno complessi.
Le cellule ospiti vengono coltivate in chemostati
(fermentatori per batteri e lieviti; bioreattori per
cellule di mammifero) e le proteine ricombinanti
vengono purificate dal sopranatante della coltura.
Prodotti farmaceutici ottenuti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Ormoni
ƒ Insulina (E. coli, S. cerevisiae)
ƒ Ormone umano della crescita
(E. coli, S. cerevisiae, cellule CHO)
ƒ Eritropoietina (cellule CHO)
Proteine del sangue
ƒ Attivatore tissutale del plasminogeno
(E. coli, S. cerevisiae)
ƒ Fattore VIII di coagulazione (S. pombe, cellule CHO)
Prodotti farmaceutici ottenuti mediante la
tecnologia del DNA ricombinante
Enzimi
DNasi umana (cellule CHO)
Vaccini
Epatite B (S. cerevisiae, P. pastoris, H. polymorpha)
Immunomodulatori
Interferone α-2a (E. coli)
Interferone α-2b (E. coli)
Interferone β-1a (cellule CHO)
Altre applicazioni importanti
del DNA ricombinante
Terapia genica
Cura di una malattia genetica mediante sostituzione
di un gene mutante “difettoso” con uno normale
(ricombinante) introdotto dall’esterno
Immunizzazione genica
Vaccini a DNA. Introduzione nell’organismo di DNA
ricombinante contenente uno o più geni che
codificano per antigeni che vengono prodotti
nell’organismo e stimolano una risposta immunitaria
protettiva